tiểu luận bộ môn hóa phân tích chủ đề định lượng protein trong huyết thanh

Cấu trúc bậc 1 Cấu trúc bậc 1 biểu thị trình tự các gốc amino acid trong chuỗi polypeptide, cấu trúc này được giữ vững bằng liên kết peptide liên kết cộng hóa trị.. Cấu trúc bậc 1 Cấ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y – DƯỢC HUẾ

KHOA DƯỢC

BỘ MÔN : HÓA PHÂN TÍCH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y – DƯỢC HUẾ

KHOA DƯỢC

BỘ MÔN : HÓA PHÂN TÍCH

CHỦ ĐỀ : ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG HUYẾT THANH

Nhóm thực hiện

LÔ VĂN ĐẠI Lớp D2A HOÀNG CÔNG CHIẾN

Lớp D2B ĐINH MINH CHUNG

Lớp D2A

NGUỒN GỐC VÀ VAI TRÒ CỦA

PROTEIN TOÀN PHẦN ĐỐI VỚI CƠ THỂ:

 Nguồn gốc của protein:

Protein trong máu gồm 3 thành phần là albumin

chiếm 50 - 55%, globulin chiếm 39 – 45%,

fibrrinogen chiếm 4 – 6% Protein toàn phần trong huyết tương cao hơn huyết thanh vì có thêm

fibrinogen

Albumin và fibrinogen được tổng hợp duy nhất bởi gan Globulin do các tế bào có thẩm quyền miễn

dịch sản xuất ra (tuỷ xương, lách, tế bào lympho,

tế bào Kuffer của gan)

NGUỒN GỐC VÀ VAI TRÒ CỦA

PROTEIN TOÀN PHẦN ĐỐI VỚI CƠ THỂ:

Protein trong máu gồm 3 thành phần là albumin

chiếm 50 - 55%, globulin chiếm 39 – 45%,

fibrrinogen chiếm 4 – 6% Protein toàn phần trong huyết tương cao hơn huyết thanh vì có thêm

fibrinogen

Albumin và fibrinogen được tổng hợp duy nhất bởi gan Globulin do các tế bào có thẩm quyền miễn

dịch sản xuất ra (tuỷ xương, lách, tế bào lympho,

tế bào Kuffer của gan)

 Protein huyết tương có các vai trò sau:

- Tham gia cấu tạo nên cơ thể

- Tạo áp lực keo có vai trò trong quá trình vận

chuyển và trao đổi muối nước

- Tham gia thành phần hệ thống đệm góp phần giữ cân bằng pH cho máu

- Bảo vệ cơ thể: globulin là yếu tố miễn dịch có vai trò bảo vệ cơ thể hơn nữa fibrrinogen tham gia vào quá trình đông máu giúp cầm máu khi bị xây xước, chấn thương

- Vận chuyển hormon và các enzym, protein còn làm nhiệm vụ vận chuyển thuốc như thuốc kháng sinh, coumarin, salycylate, thuốc ngủ

 Protein huyết tương có các vai trò sau:

- Tham gia cấu tạo nên cơ thể

- Tạo áp lực keo có vai trò trong quá trình vận

chuyển và trao đổi muối nước

- Tham gia thành phần hệ thống đệm góp phần giữ cân bằng pH cho máu

- Bảo vệ cơ thể: globulin là yếu tố miễn dịch có vai trò bảo vệ cơ thể hơn nữa fibrrinogen tham gia vào quá trình đông máu giúp cầm máu khi bị xây xước, chấn thương

- Vận chuyển hormon và các enzym, protein còn làm nhiệm vụ vận chuyển thuốc như thuốc kháng sinh, coumarin, salycylate, thuốc ngủ

Các bậc của protein.

Các bậc của protein

Cấu trúc bậc 1

Cấu trúc bậc 1 biểu thị trình tự các gốc amino acid trong

chuỗi polypeptide, cấu trúc này được giữ vững bằng liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị) Cấu trúc bậc 1 là phiên bản của mã di truyền, việc xác định được cấu trúc bậc 1 là cơ sở

để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hoá học

hoặc bằng biện pháp công nghệ sinh học.

Cấu trúc bậc 2 Biểu thị sự xoắn của chuỗi polypeptide, là

tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong mạch polypeptide Nói cách khác, là dạng không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide Cấu trúc này được làm bền nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa

các liên kết peptide ở gần nhau

Cấu trúc bậc 1

Cấu trúc bậc 1 biểu thị trình tự các gốc amino acid trong

chuỗi polypeptide, cấu trúc này được giữ vững bằng liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị) Cấu trúc bậc 1 là phiên bản của mã di truyền, việc xác định được cấu trúc bậc 1 là cơ sở

để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hoá học

hoặc bằng biện pháp công nghệ sinh học.

Cấu trúc bậc 2 Biểu thị sự xoắn của chuỗi polypeptide, là

tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong mạch polypeptide Nói cách khác, là dạng không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide Cấu trúc này được làm bền nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa

các liên kết peptide ở gần nhau

khác như liên kết kị nước, lực Van der Waals, liên kết hydro, liên kết tĩnh điện giữa các gốc amino acid

 Cấu trúc bậc 4

Biểu thị sự kết hợp của các chuỗi có cấu trúc bậc 3 trong phân tử

protein Những phân tử protein có cấu trúc từ 2 hay nhiều chuỗi

protein hình cầu, tương tác với nhau sắp xếp trong không gian tạo nên cấu trúc bậc 4 Mỗi một chuỗi polypeptide đó được gọi là một tiểu

đơn vị, chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, tương tác Van der Waals giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị để làm bền cấu trúc bậc 4.

khác như liên kết kị nước, lực Van der Waals, liên kết hydro, liên kết tĩnh điện giữa các gốc amino acid

 Cấu trúc bậc 4

Biểu thị sự kết hợp của các chuỗi có cấu trúc bậc 3 trong phân tử

protein Những phân tử protein có cấu trúc từ 2 hay nhiều chuỗi

protein hình cầu, tương tác với nhau sắp xếp trong không gian tạo nên cấu trúc bậc 4 Mỗi một chuỗi polypeptide đó được gọi là một tiểu

đơn vị, chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, tương tác Van der Waals giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị để làm bền cấu trúc bậc 4.

Tính chất hóa học của protein.

- Protein có thể bị thủy phân bởi enzyme hoặc bởi một số yếu tố khác như acid hoặc base đặc (nồng độ 6N) ở nhiệt độ cao và

trong nhiều giờ để tạo thành các sản phẩm dở dang hoặc sản

phẩm cuối cùng là các amino acid.

- Protein cho phản ứng biurea (đặc trưng của liên kết peptid).

- Các gốc amino acid trong phân tử protein cũng cho các phản ứng đặc trưng của amino acid tự do tương ứng

- Phân tử protein có nhóm a-NH2 ở đầu N-tận cùng và a-COOH ở đầu C-tận cùng, ngoài ra chúng còn có thể có thêm một số nhóm -NH2 và COOH của các gốc amino acid nằm giữa chuỗi

polypeptid Do vậy, protein có thể cho hoặc nhận proton (H + ) để thể hiện tính acid hoặc base Nhờ đặc điểm này cho nên protein

là một hệ đệm góp phần duy trì pH của cơ thể động vật tương đối ổn định

- Protein có thể bị thủy phân bởi enzyme hoặc bởi một số yếu tố khác như acid hoặc base đặc (nồng độ 6N) ở nhiệt độ cao và

trong nhiều giờ để tạo thành các sản phẩm dở dang hoặc sản

phẩm cuối cùng là các amino acid.

- Protein cho phản ứng biurea (đặc trưng của liên kết peptid).

- Các gốc amino acid trong phân tử protein cũng cho các phản ứng đặc trưng của amino acid tự do tương ứng

- Phân tử protein có nhóm a-NH2 ở đầu N-tận cùng và a-COOH ở đầu C-tận cùng, ngoài ra chúng còn có thể có thêm một số nhóm -NH2 và COOH của các gốc amino acid nằm giữa chuỗi

polypeptid Do vậy, protein có thể cho hoặc nhận proton (H + ) để thể hiện tính acid hoặc base Nhờ đặc điểm này cho nên protein

là một hệ đệm góp phần duy trì pH của cơ thể động vật tương đối ổn định

 Do Protein cho phản ứng Biurea (phản ứng đặc trưng của liên kết peptid)

Vì vậy trong thí nghiệm này chúng

ta Dùng tính chất này của proten

dể định lượng protein trong huyết thanh Để chận đoán bệnh xơ gan

cổ chướng.

 Do Protein cho phản ứng Biurea (phản ứng đặc trưng của liên kết peptid)

Vì vậy trong thí nghiệm này chúng

ta Dùng tính chất này của proten

dể định lượng protein trong huyết thanh Để chận đoán bệnh xơ gan

cổ chướng.

I NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Protein trong huyết thanh tác dụng với ion

Cu+2 trong môi trường kiềm (thuốc thử Biure) tạo thành phức hợp màu xanh tím

Đậm độ màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong huyết thanh và được xác định mật độ quang ở bước sóng 546nm bằng phép đo điểm cuối

I NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Protein trong huyết thanh tác dụng với ion

Cu+2 trong môi trường kiềm (thuốc thử Biure) tạo thành phức hợp màu xanh tím

Đậm độ màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong huyết thanh và được xác định mật độ quang ở bước sóng 546nm bằng phép đo điểm cuối

Máy li tâm và máy

III QUY TRÌNH TIẾN HÀNH ĐỊNH LƯỢNG

1 Lấy huyết thanh tĩnh mạch:

Vị trí lấy máu: thường ở nếp gấp khuỷu tay.

- Người cho máu ngồi thoải mái, đặt tay nằm

Chờ cồn khô rồi mới

tiến hành lấy máu.

Chú ý: Không được dùng

dây garo vì máu ứ lại làm

cho nồng độ protein tăng

lên nhiều.

III QUY TRÌNH TIẾN HÀNH ĐỊNH LƯỢNG

1 Lấy huyết thanh tĩnh mạch:

Vị trí lấy máu: thường ở nếp gấp khuỷu tay.

- Người cho máu ngồi thoải mái, đặt tay nằm

Chờ cồn khô rồi mới

tiến hành lấy máu.

Chú ý: Không được dùng

dây garo vì máu ứ lại làm

cho nồng độ protein tăng

lên nhiều.

Vị trí lấy máu tĩnh mạch

- Cầm bơm kim tiêm hợp với cẳng tay 1 góc khoảng 30° Chọc kim nhanh, dứt khoát vào vị trí dưới vị trí lấy máu khoảng 1-2mm rồi từ từ luồn kim tiêm vào tĩnh mạch.Khi nào thấy có máu chảy vào đầu kim tiêm thì lúc đó kim

tiêm đã được luồn vào tĩnh mạch.

- Phải giữ chặt kim, không di chuyển khỏi vị trí mạch máu.

- Một tay giữ chặt bơm tiêm, sao cho vị trí kim tiêm không thay đổi Tay kia từ từ rút pít tông của bơm tiêm về phía sau.

Lưu ý: tránh rút pít tông quá nhanh gây xẹp tĩnh mạch,

giảm lượng máu vào kim.

- Hút vào bơm tiêm khoảng 3ml máu.

- Cầm bơm kim tiêm hợp với cẳng tay 1 góc khoảng 30° Chọc kim nhanh, dứt khoát vào vị trí dưới vị trí lấy máu khoảng 1-2mm rồi từ từ luồn kim tiêm vào tĩnh mạch.Khi nào thấy có máu chảy vào đầu kim tiêm thì lúc đó kim

tiêm đã được luồn vào tĩnh mạch.

- Phải giữ chặt kim, không di chuyển khỏi vị trí mạch máu.

- Một tay giữ chặt bơm tiêm, sao cho vị trí kim tiêm không thay đổi Tay kia từ từ rút pít tông của bơm tiêm về phía sau.

Lưu ý: tránh rút pít tông quá nhanh gây xẹp tĩnh mạch,

giảm lượng máu vào kim.

- Hút vào bơm tiêm khoảng 3ml máu.

- Tay giữ bơm tiêm Lấy bông có tẩm cồn 70° đặt nhẹ lên

vị trí lấy máu Một tay rút kim tiêm ra dứt khoát và ngay sau đó tay kia ấn chặt bông lên vị trí lấy máu để cầm

máu.

- Sau đó để bơm tiêm để chếch

với thành ống nghiệm đựng máu 1 góc

khoảng 45° Bơm từ từ máu theo thành ống

nghiệm để tránh làm vỡ hồng cầu rồi đậy nắp

ống nghiệm

- Sau đó ly tâm máu lấy huyết thanh

- Tay giữ bơm tiêm Lấy bông có tẩm cồn 70° đặt nhẹ lên

vị trí lấy máu Một tay rút kim tiêm ra dứt khoát và ngay sau đó tay kia ấn chặt bông lên vị trí lấy máu để cầm

máu.

- Sau đó để bơm tiêm để chếch

với thành ống nghiệm đựng máu 1 góc

khoảng 45° Bơm từ từ máu theo thành ống

nghiệm để tránh làm vỡ hồng cầu rồi đậy nắp

ống nghiệm

- Sau đó ly tâm máu lấy huyết thanh

Ly tâm lấy huyết thanh.

Cho máu vào máy ly tâm để lấy huyết thanh

2 Pha chế thuốc thử Biure.

thuốc thử Biuret theo Gornall.

o Thuốc thử: dựng bộ kít hóa chất mua sẵn gồm:

reagent A – protein và standard – protein

o Thuốc thử biure tự pha theo Gornal làm như sau:

- Lấy 1ml dd A + 1ml dd B + 98ml dd C được thuốc thử

Biure

2 Pha chế thuốc thử Biure.

thuốc thử Biuret theo Gornall.

o Thuốc thử: dựng bộ kít hóa chất mua sẵn gồm:

reagent A – protein và standard – protein

o Thuốc thử biure tự pha theo Gornal làm như sau:

- Lấy 1ml dd A + 1ml dd B + 98ml dd C được thuốc thử

Biure

 Pha chế thuốc thử Biure

 Pha chế thuốc thử Biure

1ml

Cân Cân

Cân

Công thức pha thuốc thử Biure

 Phản ứng tạo Biure và Phản ứng với protein.

 Phản ứng tạo Biure và Phản ứng với protein

 Dạng phức hợp trên ( vơi 4 nuyên tử N tham gia

liên kết phối trí ) thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại

ở bước sóng 520-535nm) trong trường hợp chỉ có 2 hay 3 nguyên tử N tham gia liên kết phối trí thì phức

có màu tím hoạc có màu xanh hấp thụ cực đại ở các bước sóng tương ung là 540- 580 nm và 615-670

nm

 Vì thế thông thường phản ứng của các polypeptit sẽ thay đổi khác nhau tử xanh tím đến đỏ tím.phản ứng Biure thường được ứng Dụng để định lượng Protein (1,3,6,9)

 Dạng phức hợp trên ( vơi 4 nuyên tử N tham gia

liên kết phối trí ) thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại

ở bước sóng 520-535nm) trong trường hợp chỉ có 2 hay 3 nguyên tử N tham gia liên kết phối trí thì phức

có màu tím hoạc có màu xanh hấp thụ cực đại ở các bước sóng tương ung là 540- 580 nm và 615-670

nm

 Vì thế thông thường phản ứng của các polypeptit sẽ thay đổi khác nhau tử xanh tím đến đỏ tím.phản ứng Biure thường được ứng Dụng để định lượng Protein (1,3,6,9)

 Thuốc thử biure có màu xanh nhạt Thuốc thử biure

không dùng được trong môi trường có NH4+ vì NH4+

tạo Phức với Cu 2+ không màu,

bền nên không tạo phức được với protein

 Thuốc thử có thể dùng trong phân tích định tính và

định lượng Trong một phản ứng tiêu biểu một phần

thể tích của mẫu được trôn với 2 phần thể tích của

thuốc thử, tỉ số tối giản phủ thuộc vào nồng độ tối đa của protein mà ta muốn phát hiện, sự xuất hiện của

protein được tìm với bước sóng hấp thụ khoảng 550nm – 555nm, thường thì hay tìm với bước sóng 546 nm.

 Thuốc thử biure có màu xanh nhạt Thuốc thử biure

không dùng được trong môi trường có NH4+ vì NH4+

tạo Phức với Cu 2+ không màu,

bền nên không tạo phức được với protein

 Thuốc thử có thể dùng trong phân tích định tính và

định lượng Trong một phản ứng tiêu biểu một phần

thể tích của mẫu được trôn với 2 phần thể tích của

thuốc thử, tỉ số tối giản phủ thuộc vào nồng độ tối đa của protein mà ta muốn phát hiện, sự xuất hiện của

protein được tìm với bước sóng hấp thụ khoảng 550nm – 555nm, thường thì hay tìm với bước sóng 546 nm.

 Dung dịch thuốc thử biure vừa pha được lắc

kỹ bảo quản trong lọ màu, nút kín để trong tối ngay để tránh thuốc thử bị biến tính, bỏ đi khi

có cặn Tốt nhất là chỉ pha ít một để dùng

 Nghĩa là để riêng dung dịch đồng sulfat và dung dịch NaOH 10% khi cần mới trộn lẫn

theo như công thức qui định.

 Dung dịch thuốc thử biure vừa pha được lắc

kỹ bảo quản trong lọ màu, nút kín để trong tối ngay để tránh thuốc thử bị biến tính, bỏ đi khi

 Bắt đầu pha thuốc thử với huyết thanh và dd Protein mẫu:

-Hút 500 µL thuốc thử Biure vào 3 ống: trắng (Tr), mẫu (M), thử (T)

- Hút 10µL protein mẫu vào ống mẫu

- Hút 10µL huyết thanh vào ống thử

- Hút 10µL protein mẫu vào ống mẫu

- Hút 10µL huyết thanh vào ống thử

 Sau khi pha được dung dịch Đo máy ở bước sóng 546 nm, phương pháp đo điểm cuối.

 Sau khi pha được dung dịch Đo máy ở bước sóng 546 nm, phương pháp đo điểm cuối.

546

Cho dung dịch vào máy

đo quang đo ở bước sóng

546 nm.

Máy do quang

IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ.

1 Kết quả

- Khi đo xong thu được kết quả sau.

- Ở đây protein mẫu là chất chuẩn

- Ta tính nồng độ protein trong huyết thanh theo công thức điểm chuẩn.

IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ.

1 Kết quả

- Khi đo xong thu được kết quả sau.

- Ở đây protein mẫu là chất chuẩn

- Ta tính nồng độ protein trong huyết thanh theo công thức điểm chuẩn.

Mật đô quang A

Protein mẫu A1 64 Huyết thanh A2 C

)

( 1

A

Cm A

Ct Dm

Cm Dt

Ct   

Trong đó: Ct là nồng độ của protein trong huyết thanh

Cm là nồng độ của protein mẫu

Dt ,Dm lần lượt là mật độ quang của proten huyết thanh, protein mẫu.

Tuy nhiên giảm protein trong máu chủ yếu là do bệnh

xơ gan cổ chướng

- Tăng: trong bệnh u tủy, mất nước liên tục (nôn

nhiều, ỉa chảy…), thiểu năng vỏ thượng thận (bệnh Addison)

Tuy nhiên giảm protein trong máu chủ yếu là do bệnh

xơ gan cổ chướng

- Tăng: trong bệnh u tủy, mất nước liên tục (nôn

nhiều, ỉa chảy…), thiểu năng vỏ thượng thận (bệnh Addison)

 Do gan là nơi sản xuất một loạt proten quan trọng bao gồm hormon, emzym, protein trong huyết thanh,các yếu tố đông máu và các yếu

tố miễn dịch.

 Tất cả mỏi người sức khỏe, tuổi thỏ đều phụ thuộc vào khả năng của gan để sản xuất

protein.

 Gan xử lý hầu như tất cả mỏi thứ chúng ta

ăn qua miệng, hít thở vào phổi và hấp thụ

qua da Gan được coi là nhà máy sinh hóa

của cơ thể, gan chuyển hóa các protein trong máu….

 Do gan là nơi sản xuất một loạt proten quan trọng bao gồm hormon, emzym, protein trong huyết thanh,các yếu tố đông máu và các yếu

tố miễn dịch.

 Tất cả mỏi người sức khỏe, tuổi thỏ đều phụ thuộc vào khả năng của gan để sản xuất

protein.

 Gan xử lý hầu như tất cả mỏi thứ chúng ta

ăn qua miệng, hít thở vào phổi và hấp thụ

qua da Gan được coi là nhà máy sinh hóa

của cơ thể, gan chuyển hóa các protein trong máu….