LƯỢC SỬ VỀ CÁC ENZIM GIỚI HẠN

Kỷ yếu công trình khoa học 2014 – Phần II Trường Đại học Thăng Long 235 LƯỢC SỬ VỀ CÁC ENZIM GIỚI HẠN TS. Lê Thị Kim Tuyến Phòng thí nghiệm Sinh học, Trường ĐH Thăng Long Tóm tắt: Được khám phá 60 năm trước đây enzim giới hạn đã trở thành các công cụ quen thuộc của các phòng sinh học phân tử. Bài này kể lại về hiện tượng lạ đã gây được sự chú ý của các chuyên gia vi sinh nghiên cứu về chu kỳ nhiễm của phag e trong vi khuẩn. Kết quả cho phép phát hiện một enzim cắt ADN một cách đặc hiệu. Thời đó, không ai có thể lường trước rằng enzim giới hạn tồn tại cùng methyltransferase trong hệ thống giới hạn-sửa đổi sẽ trở thành những con trâu cầy của đất sinh học phân tử. Nhiều enzim giới hạn có đặc hiệu khác nhau đã được sưu tầm để phục vụ những phương pháp rất phổ biến như giải trình tự, clon gen, độ đa dạng đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) và làm đối tượng nghiên cứu để hiểu biết cấu trúc protein, tương quan giưa protein và ADN dẫn đến khả năng tạo ra enzim có tính đặc hiệu mới. Song enzim giới hạn nay đang nhương bước cho enzim methyltransferase cùng hệ thống giới hạn-sửa đổi. Từ khóa: enzim giới hạn, hệ thống giới hạn-sửa đổi, methyltransferase, sinh học phân tử. Khám phá kỳ diệu của các hệ thống giới hạn-thay đổi Để hiểu được sự phức tạp của những tế bào cơ thể con người, nhằm nhận ra những rối loạn chức năng tế bào gây bệnh tật, thì nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu những tế bào đơn giản hơn là vi khuẩn. Vi khuẩn thường sống riêng lẻ, độc lập, nếu không gặp may thì bị nhiễm bởi phage và tan rã. Phage dối với vi khuẩn như là virut đối với tế bào cao cấp, những ký sinh hoàn toàn cần đến bộ máy sinh học của tế bào mới tồn tại và nhân lên được. Đương nhiên ADN có vai trò trung tâm ở hiện tượng này biết rằng nó là phân tử của sự sống, điểu khiển cả di truyền các vật sống (ở đây là vi khuẩn và phagơ) từ thế hệ này sang thế hệ con và cả chức năng sống trong hiện tại. Trong những năm 1950, một số tác giả (2,4) nhận xét một hiện tượng lạ về vi khuẩn Escherichia coli và phage l. Khi hai typ K và B của Escherichia coli được nhiễm bởi phage, phage đã xâm nhập và lớn lên trong vi khuẩn typ K và được giải phòng ra ngoài sau khi hủy hoại tế bào typ K lại có khả năng tiếp tục xâm nhập một vi khuẩn typ K mới nhưng không có khả năng xâm nhập một vi khuẩn typ B. Như là tế bào typ K dán tên của mình lên bộ phận của phage trở thành lK. Các tác giả tập trung vào việc nghiên cứu để lý giải tại sao phage lK gây hại chỉ hạn chế ở vi khuẩn typ K và lại không xâm nhập được vi khuận typ B. ADN phage lK bị biến đổi ở vi khuẩn typ K cho phép phage K mọc lên tiếp tục ở vi khuẩn typ K. Biến đổi đó không cho phép xâm nhập thành công vi khuẩn typ B. Nhưng trong tỷ lệ rất thấp phage lK mọc lên được trên vi khuẩn typ B (Hình 1). Thật ra ADN phage lK đã bị vi khuẩn typ B biến đổi trở thành phage B, lại mất khả năng xâm nhập vào vi khuẩn typ K. Kỷ yếu công trình khoa học 2014 – Phần II Trường Đại học Thăng Long 236 Hình 1 : Hiện tượng giới hạn Phải đợi một chục năm sau, Arber mới tìm ra những yêu tố gây ra biến đổi ADN phage do chủ vi khuẩn (1). Khi phage vào vi khuẩn typ B, ADN phage bị cắt nhỏ bởi một enzim mang tên enzim giới hạn mà cắt ADN sau khi gắn ở các trình tự nucleotid đặc hiệu. Một tỷ lệ ít phage lK thoát được phản ứng giới hạn có khả năng mọc lên vì ADN phage cùng với ADN vi khuẩn được methyl hóa bởi methyltransferase thuộc cùng hệ thống giới hạn - sửa đổi mà nhận ra cùng trình tự đặc hiệu y như enzim giới hạn. Cả ADN phage và ADN vi khuẩn được bảo vệ chống lại phản ứng giới hạn. Việc nghiên cứu này đã giải thích một hiện tượng quan trọng về sự khả năng của vi khuẩn có thể tự bảo vệ mình chống lại xâm nhập và phá hủy của phage trong thiên nhiên. Trong quá trình nhiễm, phage tiêm ADN vào vi khuẩn nhằm điểu khiển lại bộ máy sinh học của vi khuẩn để nhân lên nhiều phần tử phage mới và cuối cùng dẫn đên sự tan rã vi khuẩn để phage được ra ngoài môi trường. Enzim giới hạn vi khuẩn sẽ hủy ADN của phage nhưng mặt khác methyltransferase sẽ methyl hóa ADN của vi khuẩn để tránh bị cắt. Ở đây cần phải nhấn mạnh rằng sự sống dựa vào các phản ứng sinh hóa học liên quan đến phân tử. Có sự cạnh tranh giữa hai enzim giới hạn và methyltransferase và khi ADN phage nhập vào vi khuẩn thì có một tỉ lệ tuy rằng ít được methyl hóa trước và do đó không bi hủy bởi enzim giới hạn, vì vậy cho phép sự lớn lên thành công của phage. Những enzim giới hạn được tìm thấy đầu tiên thuộc về loại I tức là nhận ra trình tự nucleotid đặc hiệu nhưng cắt ngẫu nhiên xa vị trí nhận. Hai mươi năm sau, vào những năm 1970, một bài báo công bố từ phòng thí nghiệm của Smith, mô tả một enzim giới hạn cắt ADN phage T7 thành các đoạn ADN có chiều dài nhất định. Đó là enzim giới hạn loại II đầu tiên được khám phá từ Hemophilus influenza, đặt tên HindII nhận ra trình tự GTY¯RAC và cắt chính ở giữa vị trí nhận. Nathan đã đưa ra một phương pháp điện di cho phép nhìn thấy các đoạn ADN giới hạn của một virut khỉ SV40 được sắp sếp theo chiều dài. Bằng cách này, có thể thực hiện các bản đồ giới hạn của tất cả các loại ADN và có thể phân tích những thay đổi ở một phân tử ADN ở các giai đoạn phát triển của tế bào, hoặc nhận định cá thể cùng một loài. Phương pháp độ đa dạng độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP restriction fragment length polymorphism) cho phép tạo ra các dấu vết ADN khác nhau dùng để phân tích ADN. Nó hay được dùng trong phân loại các sinh vật trong đó là xác định hài cốt, thủ phạm, huyết thống, theo rõi các vi sinh gây bệnh Nhóm các nhà khoa học gồm Arber đã khám phá cơ chế sinh học của giới hạn-sửa đổi và tinh chế enzim giới hạn loại I đầu tiên, Smith đã khám phá enzim giới hạn loại II thư nhất Kỷ yếu công trình khoa học 2014 – Phần II Trường Đại học Thăng Long 237 và Nathans đã hiểu được sự ứng dụng của enzim giới hạn dể làm bản đồ vất lý của virut SV40 để phân tích gen đã nhận giải Nobel năm 1978. Từ đó enzim giới hạn đã được thông dụng như các công cụ thiết yếu của sinh học phân tử. Các enzim giới hạn : con trâu cầy của cánh đồng sinh học phân tử Thế giới vi khuẩn rất phong phú, có thể tìm được vi khuẩn ở bất cứ nơi nào trong lòng đất, nước, trong điều kiện lạnh, nóng, môi trường mặn, kiềm, axit Hầu hết vi khuẩn chứa hệ thống giới hạn sửa đổi, có đặc hiệu khác nhau, nhận ra trình tự gồm từ 4 đến 8 nucleotid bị ngắt quãng hay không. Bộ sưu tập enzim thế giới trên thế giới gồm hơn 3600 enzim giới hạn nhận ra 250 trình tự ADN khác nhau (7). Hình như nhóm các enzim giới hạn đã theo sự tiến hóa của thế giới vi khuẩn. Điều này được thể hiện qua các gen enzim giới hạn có độ giống nhau thấp và có nhiều cách thức để tiếp xúc với ADN và thực hiện phản ứng. Hai phương pháp dưới đây đã cho phép sự phát triển sinh học phân tử : - Giải trình tự ADN genom ADN genom nhỏ nhất là của virut gồm có trung bình một vạn nucleotid. Các vi khuẩn có ADN genom chứa hơn một triệu nucleotid, còn tế bào cao cấp có hơn một tỷ nucleotid. Việc giải trình tự ADN genom bé nhất không thể được tiến hành vì chuỗi nucleotid còn quá lớn. Do đó việc này được thực hiện nhờ các enzim giới hạn loại II cắt các phẩn tử ADN to thành các mảnh nhỏ chỉ gồm vài trăm nucleotid nhất định. Mỗi đoạn ADN giới hạn được giải trình tự và được nối lại với nhau để có trình tự của toàn bộ genom. - Clon gen Một đóng góp thứ hai đáng kể của enzim giới hạn loại II là việc thiếp lập quy trình clon gen. Quy trình rất quan trọng đã cho phép nhân lên một gen trong một tế bào chủ của một vi khuẩn trở thành một nhà máy sản xuất protein do gen mã hóa. Nó cho phép sản xuất nhiều sản phẩm quí giá một cách liên tục và ở qui mô lơn. Ví dụ tiêu biểu là protein insulin dùng để điều trị bệnh tiểu đường và được sản xuất bằng phương pháp clon gen từ 1982 (3). Trước đây insulin phải được chiết xuất từ gan lợn, bây giờ chỉ nuôi cấy vi khuẩn chứa gen tái tổ hợp có thể có lượng insulin đủ cho tất cả các bệnh nhân. Sau này nhiều loài thuốc, một số vắc xin, protein dùng cho nông nghiệp và công nghiệp được sản xuất. Hiện nay các protein được nghiên cứu nhờ vào phương pháp clon gen (9). Trong quá trình clon gen những enzim giới hạn loại II nhận ra các trình từ đối xứng được gọi palindromic, thường được dùng để tạo ra các gen tái tổ hợp được gắn vào plasmid và đưa vào các vi khuẩn. Enzim giới hạn đã cho phép sự nghiên cứu chính mình sâu hơn rồi mở đường cho các nghiên cứu nóng bỏng Hầu hết 235 enzim giới hạn đã được New England Biolabs phân phối khắp thế giới là sản phẩm của phương pháp clon gen. Mặt khác, phương pháp lon gen đã cho phép tinh chế enzim giới hạn ở mức độ cao nhất để có tinh thể phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc protein. Phương pháp clon gen còn làm cho quá trình giải trình tự đơn giản hơn. Kết quả giải trình tự cho phép quan sát độ đa dạng vô cùng lớn của các gen mã cho enzim giới hạn. Lúc đầu, các enzim giới hạn được dùng thông thường trong phòng thí nghiệm không có đánh dấu nào trên trình tự gen chỉ định đó là một gen giới hạn. Do đó trong các trình tự vi sinh vật của GenBank khó phát hiện được gen giới hạn. Phương pháp in silico cho phép tìm được các gen giới hạn Kỷ yếu công trình khoa học 2014 – Phần II Trường Đại học Thăng Long 238 giả định thuộc họ enzim giới hạn giống MmeI, có đọ giống nhau cao về trình tự gen. Họ enzim giới hạn này đã cho phép hiểu được một số quy tắc về tương tác giữa các acid amin trong vùng nhận biết đích của enzim giới hạn và các nucleotid trên ADN. Trên nguyên tắc đó, enzim giới hạn có đặc hiệu mới đã được tạo ra (5). Enzim giới hạn đã trở thành những công cụ không thiếu được để nghiên cứu genom. Gần 60 năm đã được khám phá, enzim giới hạn đã được hiểu về chức năng, cấu trúc, cả về sự tiếp xúc với ADN. Hiện nay enzim giới hạn không còn thu hút sự quan tâm của nghiên cứu như trước đay nữa. Nhưng đến lượt mehtyltransferase, enzim cặp đôi với enzim giới hạn đã trở thành trung tâm chú ý của nghiên cứu sinh học phân tử vì enzim này thay đổi nucleotid trên genom. Lĩnh vực ngoài di truyền (epigenetics) đã trở thành những đề tài nóng bỏng của sinh học phân tử để hiểu biết các cơ chế điều hòa gen có thể được mở hoặc tắt nhằm phù hơp với hoạt động thực tế của tế bào. Sự hoạt động tốt của tế bào ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và bệnh như ung thư có thể được giải thích bởi một rối loạn về điều hòa gen. Đóng góp của phòng sinh học trường Đại học Thăng Long Công ty New England Biolabs luôn đẩy mạnh việc nghiên cứu sinh học phân tử hợp tác cùng Phòng Sinh học trường Đại học Thăng Long. Được thành lập vào những năm 1970 để sản xuất và phân phối đầu tiên các enzim giới hạn kháp thế giới, công ty có bộ phận nghiên cứu đã sưu tầm nhiều enzim giới hạn và cho những kết quả cho phép hiểu ra cơ chế hoạt động của enzim giới hạn. Sau khi Richard Morgan đã khám phá họ enzim giới hạn giống MmeI (6) chúng tôi đã thăm gia xác định tính đặc hiệu của các enzim giới hạn giả định phân lập từ phần mềm REBASE. Trên cơ sở đó một số qui tắc về acid amin nhận ra nucleotid đã được tìm với họ enzim giới hạn MmeI. Morgan R. tiếp tục hợp tác với phòng chúng tôi để nghiên cứu một họ mới phát hiện của các enzim giới hạn giống HauI nhằm biết một số quy tắc tương tư MmeI. Những họ enzim này, có đặc điểm là hai chức năng giới hạn và methyltransferase được mang trên cùng một protein. Quá trình nghiên cứu họ enzim giống HauI sẽ tiến hành khác hẳn so với họ enzim giống MmeI trước đây bằng xin ADN các chủng đã được giả định chứa gen chờ đời được nhìn thầy ở GenBank. Việc xin ADN là phức tạp vì vậy đề tài hướng nghiên cứu các mẫu phân lập từ thiên nhiên. Morgan R. nhận thấy in silico rằng Microcystis aeruginosa chứa một gen thuộc về họ enzim giống họ HauI. Microcystis aeruginosa là một vi khuẩn, dạng tảo xanh có diệp lục, sống trong nước và mọc phổ biến trên khắp nơi. Các chủng sinh vật cùng một loài có một số thay đổi về mặt trình tự vì đột biến nucleotid sẽ được gặp ở nhiều chỗ khác nhau. Nếu đột biến xảy ra trong vùng enzim giới hạn mà tiếp xúc với vị trí nhận trên ADN thì enzim có thể nhận biết trình tự nucleotid khác nhau. Trên cơ sỏ đó, việc xác định được trình tự acid amin trong vùng nhận ra trình tự ADN và tính đặc hiệu của enzim giới hạn sẽ cho biết quy luật tiếp xúc giữa acid amin với nucleotid nhất định đối với các enzim giới hạn giống HauI. Công trình nghiên cứu của Phòng đang được tiến hành dựa vào việc khai thác sự phong phú của vi khuẩn thiên nhiên của nước ta ở vùng nhiệt đới, những số liệu ADN của GenBank, những tạp chí khoa học từ mạng Internet, sử dụng các máy móc, hóa chất sinh học sẵn có để clon gen và quan sát sự biểu hiện của enzim giới hạn. Phần nghiên cứu hiện đại, cần phải có những máy móc đắt tiền, không dễ điều khiển, thì có thể phối hợp với phòng thí nghiệm khác ở nước ta và ở công ty New England Biolabs. Kỷ yếu công trình khoa học 2014 – Phần II Trường Đại học Thăng Long 239 Tài liệu Tham khảo [1]. Arber W(1965). Host-controlled modification of bacteriophage. Annu Rev Microbiol., 19: 365-78. [2]. Bertani G and Weigle J J (1953). Host controlled variation in bacterial viruses. J. Bacteriol. 65: 113–121. [3]. Komaroff L V, Efstratiadis A, Broome S, Lomedico P, Tizard R, Nabert S P, Chickt W L, and Gilbert W (1978). A bacterial clone synthesizing proinsulin Proc. Nati. Acad. Sci., 75(8): 3727-3731. [4]. Luria S E and Human M L (1952). A non hereditary, host-induced variation of bacterial viruses'. J. Bacteriol. 64: 557–569. [5]. Morgan RD and Luyten YA (2009). Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity. Nucleic Acids Res., 37 (15): 5222-5333. [6]. Morgan, R. D., Dwinell E.A., Bhatia T.K., Lang E.M. and Luyten Y. (2009). The MmeI family: type II restriction-modification enzymes that employ single-strand modification for host protection. Nucleic Acids Res., 37(15): 5208-5221. [7]. Roberts RJ (2005). How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci USA, 102, 17: 5905–5908. [8]. Roberts RJ, Vincze T., Postal J, and Macelis D (2010). REBASE – a database for DNA restriction and modification : enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res., 38: D234-D236. [9]. Stryjewska A, Kiepura K, Librowski T, Lochyñski S (2013). Biotechnology and genetic engineering in the new drug development. Part I. DNA technology and recombinant proteins. Pharmacological Reports, 6: 1075-1085. CONDENSED HISTORY OF RESTRICTION ENZYMES Abstract: After their discovery 60 years ago, restriction enzymes has become the usual tools in molecular biology laboratories. In this paper, we relate the observation that hold the attention of microbiologists concerning the infection cycle of phages in bacteria. The results brought up to specific DNA cutting enzymes. At that time, no one could foresee that restriction enzymes always paired with methyltransferase inside one restriction-modification system will become such useful tools in molecular biology, especially in sequencing, cloning, fingerprinting. All these techniques also helped to study the structure of restriction enzymes, their interactions with DNA, thus allow to create even new specificity recognition. Now, they somehow leave the research interest to their close methyltransferase companion. Keyword: restriction enzyme, restriction-modification system, methyltransferase, molecular biology. . năng tạo ra enzim có tính đặc hiệu mới. Song enzim giới hạn nay đang nhương bước cho enzim methyltransferase cùng hệ thống giới hạn- sửa đổi. Từ khóa: enzim giới hạn, hệ thống giới hạn- sửa đổi,. Long 235 LƯỢC SỬ VỀ CÁC ENZIM GIỚI HẠN TS. Lê Thị Kim Tuyến Phòng thí nghiệm Sinh học, Trường ĐH Thăng Long Tóm tắt: Được khám phá 60 năm trước đây enzim giới hạn đã trở thành các công cụ. phối đầu tiên các enzim giới hạn kháp thế giới, công ty có bộ phận nghiên cứu đã sưu tầm nhiều enzim giới hạn và cho những kết quả cho phép hiểu ra cơ chế hoạt động của enzim giới hạn. Sau khi