Các xét nghiệm vi sinh vật trong nước

MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: 1. Thao tác được cách lấy mẫu nước và xét nghiệm một số chỉ số vi sinh của mẫu nước 2. Trình bày được nguyên tắc phát hiện, cách xác định các chỉ số Tổng Coliform, Fecal coliform, E. Coli giả định, tổng vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí trong nước. 3. Nhận định kết quả xét nghiệm và đánh giá được chất lượng mẫu nước về phương diện vi sinh NỘI DUNG 1. Các chỉ số cơ bản để đánh giá chất lượng mẫu nước về mặt vi sinh. Việc đánh giá nguy cơ của chất lượng nước về mặt vi sinh học là một việc làm phức tạp. Nguy cơ lớn nhất về vi sinh vật liên quan đến việc ăn uống phải nước đã bị nhiễm bẩn bởi phân người và súc vật. Bởi vậy có nhiều tiêu chuẩn đưa ra các phương pháp định tính và định lượng các vi khuẩn chỉ điểm phân trong nước, bao gồm các loại vi khuẩn: Vi khuẩn nha bào kỵ khí khử sunfit ( Clostridium perfringens) Tổng Coliform Coliform chịu nhiệt Escherichia Coli (E. coli). Trong đó E. coli là vi khuẩn đặc hiệu nhất trong số các vi khuẩn chỉ điểm phân vì vậy nó được giới thiệu như một loại chỉ danh về chất lượng nước uống. Coliform chịu nhiệt có thể được sử dụng để thay thế E. coli. Loại vi khuẩn này còn được khuyến cáo như những vi sinh vật chỉ điểm về hiệu quả của quá trình xử lý nhằm loại bỏ những tác nhân gây bệnh đường ruột và vi khuẩn từ phân hoặc để đánh giá việc cải tạo chất lượng nguồn nước. Nước sau xử lý không được có coliform. Sự hiện diện của loài vi khuẩn này chứng tỏ công tác xử lý chưa đảm bảo hoặc nước bị tái nhiễm sau xử lý hoặc chứa nhiều chất dinh dưỡng. Ngoài ra còn có thể xác định thêm số lượng vi khuẩn hiếu khí sống trong nước để đánh giá những thay đổi trong việc xử lý nước tại hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho việc xử lý nước tại hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho việc đánh giá chất lượng vi khuẩn học nguồn nước. 2. Phương pháp lấy mẫu để xét nghiệm vi khuẩn trong nước Tuỳ thuộc mục đích và yêu cầu kiểm nghiệm hay nghiên cứu mà xác định địa điểm và thời gian lấy mẫu. Ví dụ: để xác định tính chất vệ sinh của nguồn cung cấp nước cho nhà máy nước (nước ngầm, nước bề mặt) thì lấy mẫu ở nhiều địa điểm khác nhau, nhiều thời gian khác nhau của các mùa trong năm. Để kiểm tra sự hoạt động của quy trình sản xuất nước của nhà máy nước thì cần lấy mẫu sau mỗi công đoạn sản xuất (nước nguồn, lắng, lọc v.v...). Hoặc đánh giá tình trạng ô nhiễm bởi vi sinh vật ở các dòng sông ao, hồ giếng nước ở các vùng khác nhau. 2.1. Dụng cụ lấy mẫu: Tất cả dụng cụ lấy mẫu nước để xét nghiệm vi khuẩn trong nước cần được đảm bảo vô trùng và sấy khô 180o x 30 phút. Dụng cụ : Quang chai và dây để lấy mẫu. Lọ thuỷ tinh dung tích 250500ml có nút đậy kín. Thùng đựng đá, phích đá để bảo quản và vận chuyển về phòng xét nghiệm. Cồn 90o, tăm bông. Diêm, bút chì, sổ sách ghi chép. 2.2. Cách lấy mẫu: 2.2.1. Đối với nước máy: Mỗi nhà máy cần lấy 34 mẫu của từng công đoạn sản xuất: 1 mẫu chưa xử lý 13 mẫu qua bể lắng lọc 12 mẫu ở bể chứa 12 mẫu trước khi bơm vào mạng lưới đường ống. Ngoài ra 12 mẫu ở các vòi xa nhà máy nước. Mỗi mẫu lấy 100500 ml. Trước khi lấy mẫu cần ghi rõ mẫu nước lấy vào nhãn chai. Trước khi lấy mẫu khoá chặt vòi nước lại dùng tăm bông tẩm cồn để đốt miệng vòi 12 phút sau đó mở vòi cho nước chảy 12 phút. Mở nút chai lấy mẫu, dùng bông tẩm cồn đã đốt cháy, hơ miệng chai để tiệt khuẩn. Lấy đầy 910 chai, đậy nút chặt. Nếu nước ở các bể chứa, phải dùng quang chai bằng kim loại đã lắp sẵn chai vô khuẩn để lấy mẫu nước. Nếu tiếp tục lấy mẫu bằng quang thì cần sát khuẩn quang. Khi lấy mẫu thả quang vào bể ở độ sâu 3040cm, kéo nắp chai cho nước vào chai. Sau đó kéo lên và đậy nút chặt.

Các xét nghiệm vi sinh vật nước ThS Trần Thị Thoa MỤC TIÊU: Sau học xong này, sinh viên có khả năng: Thao tác cách lấy mẫu nước xét nghiệm số số vi sinh mẫu nước Trình bày nguyên tắc phát hiện, cách xác định số Tổng Coliform, Fecal coliform, E Coli giả định, tổng vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí nước Nhận định kết xét nghiệm đánh giá chất lượng mẫu nước phương diện vi sinh NỘI DUNG Các số để đánh giá chất lượng mẫu nước mặt vi sinh Việc đánh giá nguy chất lượng nước mặt vi sinh học việc làm phức tạp Nguy lớn vi sinh vật liên quan đến việc ăn uống phải nước bị nhiễm bẩn phân người súc vật Bởi có nhiều tiêu chuẩn đưa phương pháp định tính định lượng vi khuẩn điểm phân nước, bao gồm loại vi khuẩn: - Vi khuẩn nha bào kỵ khí khử sunfit ( Clostridium perfringens) - Tổng Coliform - Coliform chịu nhiệt - Escherichia Coli (E coli) Trong E coli vi khuẩn đặc hiệu số vi khuẩn điểm phân giới thiệu loại danh chất lượng nước uống Coliform chịu nhiệt sử dụng để thay E coli Loại vi khuẩn khuyến cáo vi sinh vật điểm hiệu trình xử lý nhằm loại bỏ tác nhân gây bệnh đường ruột vi khuẩn từ phân để đánh giá việc cải tạo chất lượng nguồn nước Nước sau xử lý khơng có coliform Sự diện loài vi khuẩn chứng tỏ công tác xử lý chưa đảm bảo nước bị tái nhiễm sau xử lý chứa nhiều chất dinh dưỡng Ngồi cịn xác định thêm số lượng vi khuẩn hiếu khí sống nước để đánh giá thay đổi việc xử lý nước hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho việc xử lý nước hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho việc đánh giá chất lượng vi khuẩn học nguồn nước Phương pháp lấy mẫu để xét nghiệm vi khuẩn nước Tuỳ thuộc mục đích yêu cầu kiểm nghiệm hay nghiên cứu mà xác định địa điểm thời gian lấy mẫu Ví dụ: để xác định tính chất vệ sinh nguồn cung cấp nước cho nhà máy nước (nước ngầm, nước bề mặt) lấy mẫu nhiều địa điểm khác nhau, nhiều thời gian khác mùa năm Để kiểm tra hoạt động quy trình sản xuất nước nhà máy nước cần lấy mẫu sau công đoạn sản xuất (nước nguồn, lắng, lọc v.v ) Hoặc đánh giá tình trạng nhiễm vi sinh vật dịng sơng ao, hồ giếng nước vùng khác 2.1 Dụng cụ lấy mẫu: Tất dụng cụ lấy mẫu nước để xét nghiệm vi khuẩn nước cần đảm bảo vô trùng sấy khô 180o x 30 phút Dụng cụ : - Quang chai dây để lấy mẫu - Lọ thuỷ tinh dung tích 250-500ml có nút đậy kín - Thùng đựng đá, phích đá để bảo quản vận chuyển phòng xét nghiệm - Cồn 90o, tăm bơng - Diêm, bút chì, sổ sách ghi chép 2.2 Cách lấy mẫu: 2.2.1 Đối với nước máy: Mỗi nhà máy cần lấy 3-4 mẫu công đoạn sản xuất: mẫu chưa xử lý 1-3 mẫu qua bể lắng - lọc 1-2 mẫu bể chứa 1-2 mẫu trước bơm vào mạng lưới đường ống Ngoài 1-2 mẫu vòi xa nhà máy nước Mỗi mẫu lấy 100-500 ml Trước lấy mẫu cần ghi rõ mẫu nước lấy vào nhãn chai Trước lấy mẫu khố chặt vịi nước lại dùng tăm bơng tẩm cồn để đốt miệng vịi 1-2 phút sau mở vịi cho nước chảy 1-2 phút Mở nút chai lấy mẫu, dùng tẩm cồn đốt cháy, hơ miệng chai để tiệt khuẩn Lấy đầy 9/10 chai, đậy nút chặt Nếu nước bể chứa, phải dùng quang chai kim loại lắp sẵn chai vô khuẩn để lấy mẫu nước Nếu tiếp tục lấy mẫu quang cần sát khuẩn quang Khi lấy mẫu thả quang vào bể độ sâu 30-40cm, kéo nắp chai cho nước vào chai Sau kéo lên đậy nút chặt 2.2.2 Đối với nước bề mặt (ao, hồ, sông, suối): Căn vào bề mặt rộng hay hẹp, mục đích xét nghiệm mà định địa điểm lấy mẫu cho phù hợp - Đối với sông: Có thể lấy vị trí: Giữa dịng mẫu bên bờ Khoảng cách lấy mẫu tuỳ thuộc vào yêu cầu xét nghiệm Dùng quang chai lắp sẵn chai vô khuẩn, thả xuống mặt nước độ sâu cần thiết (thường 30-40cm) cách xa bờ 1-5m - Đối với ao hồ: thường lấy mẫu xung quanh mẫu hồ Cách lấy mẫu sơng Ngồi tuỳ thuộc vào mục đích xét nghiệm nghiên cứu số lượng mẫu tăng giảm 2.2.3 Đối với giếng khơi: Dùng quang chai vô khuẩn chai để lấy mẫu Nguyên tắc cách lấy mẫu Nhưng phải thận trọng không để chai vào thành giếng Nếu có quang mà phải lấy nhiều giếng phải sát khuẩn lại trước chuyển sang lấy mẫu giếng khác Cũng dùng gầu múc, đổ nước gầu 2.2.4 Đối với nước mũi khoan địa chất: Nếu có vịi lấy nhà máy nước Trên lọ đựng mẫu phải ghi rõ: Thời gian, địa điểm lấy mẫu, tình hình thời tiết (nhiệt độ, khơng khí, mưa, nắng ) tình hình vệ sinh nguồn nước, nguồn gây ô nhiễm nước xung quanh nguồn nước Yêu cầu xét nghiệm mục đích sử dụng nguồn nước Cơ quan yêu cầu xét nghiệm 2.3 Bảo quản vận chuyển Mẫu nước sau lấy mẫu cần kịp thời chuyển phòng xét nghiệm sớm, tốt Mẫu nước cần kiểm nghiệm sau kể từ lúc lấy mẫu Trường hợp khơng có điều kiện phân tích để hịm đá, phích đá Tủ lạnh nhiệt độ 0-5oC Không gửi qua bưu điện, tốt cán y tế lấy mẫu, gửi mẫu nắm rõ lý lịch mẫu nước báo cáo với phòng xét nghiệm để đánh giá kết xét nghiệm Phương pháp nuôi cầy xác định vi khuẩn hiếu khí Hiện có ba phương pháp thường sử dụng để xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí 1ml mẫu nước: Phương pháp rót thạch, phương pháp dàn thạch phương pháp màng lọc Phương pháp rót thạch phương pháp đơn giản, rẻ tiền, dễ thực cho kết xác Tuy nhiên đòi hỏi nghiêm ngặt việc theo dõi nhiệt độ thạch nuôi cấy để tránh “sốc nhiệt độ” việc cấy chuyển nhận định khuẩn lạc mọc sâu thạch khó khăn khuẩn lạc phát triển bề mặt thạch 3.1 Dụng cụ, thiết bị, hố chất, mơi trường - Tủ ấm 35-37o - Pipet 10ml, 2ml có chia độ khử trùng micropipét đầu típ tương ứng dùng kỹ thuật vi sinh (các đầu típ giá đầu típ khử trùng phương pháp ướt) - Hộp lồng 57 65cm2 khử trùng - Đèn cồn - Nước muối sinh lý, đóng 9m khử trùng - Thạch dinh dưỡng, có nhiều cơng thức Công thức hay sử dụng là: + Pepton 5g + Cao thịt 2,5g + Glucose 1g + Agar 15g + Nước cất 1lit Sau sấy hấp 121oC/15phút, pH = 7,0 ± 0,2 3.2 - Tiến hành: Chuẩn bị nơi làm việc: Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí địi hỏi thao tác vơ trùng tuyệt đối Cần khử trùng khơng khí, bàn làm việc trước tiến hành phân tích - Chuẩn bị mẫu mơi trường đồng thời: + Đun thạch dinh dưỡng cho tan chảy, mẫu cần khoảng 100ml thạch + Mỗi mẫu cần hộp lồng để cấy hai đậm độ khác nhau, đậm độ hộp lồng Cần ý có đối chứng dương tính đối chứng âm tính cho thạch cho thao tác vơ trùng Do đó, mẫu cần hộp lồng Ghi nhãn, ký hiệu mẫu hộp lồng: Ký hiệu mẫu, đậm độ pha lỗng thể tích cấy + Chọn hai đậm độ ni cấy thích hợp, tuỳ theo ước đốn mức độ ô nhiễm mẫu nước + Mỗi đậm độ hút ml nước, mở hộp lồng 1ml nước theo nhãn ghi hộp lồng Chuẩn bị xong hộp lồng Lấy thạch đun chảy để nguội 45 oC rót vào hộp lồng, đậy nắp xoay tròn nhẹ nhàng từ phải sang trái ngược lại để trộn thạch với nước mẫu cấy Cần ý từ cấy mẫu vào hộp lồng đến rót thạch khơng q 15 phút Để thạch đông lại, lập úp đĩa thạch đem ủ tủ ấm 35-37o 24 3.3 - Đọc kết báo cáo: Nếu hộp lồng có từ 30-300 khuẩn lạc mọc tốt ta việc đếm số khuẩn lạc mắt thường máy đếm theo độ pha lỗng đĩa thạch mà tính tổng số khuẩn lạc 1ml mẫu nước nuôi cấy Kết trung bình cộng đĩa, đĩa đối chứng đạt yêu cầu chứng dương tính chứng âm tính - Nếu đĩa khơng có khuẩn lạc mọc mà ta cấy đậm độ nguyên, tối đa 2ml mẫu nước mẫu chứng dương có khuẩn lạc mọc, báo cáo ghi: khuẩn lạc/1ml Ngược lại, tất hộp lồng 300 khuẩn lạc, ta phải pha loãng tiếp cấy lại Hoặc chọn đếm cm đếm được, độ chừng cm đến 10 cm2, chia góc: 1/4, 1/8 nhân lên với tổng diện tích hộp lồng, mẫu chứng âm tính khơng có khuẩn lạc mọc Rồi từ đậm độ pha lỗng mà tính tổng số khuẩn lạc 1ml mẫu nước Xác định tổng số Coliform, Fecal Coliform E Coli giả định phương pháp nhiều ống (MPN) 4.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp để phát đếm số lượng vi khuẩn coliform, coliform chịu nhiệt Escherichia coli giả định có nước cách ni cấy mơi trường lỏng hệ gồm nhiều ống nghiệm tính tốn số có xác xuất cao chúng có mẫu thử Phương pháp áp dụng cho loại nước, kể loại nước có chứa lượng đáng kể chất lơ lửng 4.2.Định nghĩa: 4.2.1 Coliform sinh vật có khả sinh trưởng hiếu khí nhiệt độ 35 ± 0,5 C - 37 ± 0,5 oC vòng 48 h mơi trường ni cấy có lactosa sinh acid, sinh o khí Chúng tìm thấy phân người, động vật môi trường đất, nước rau Chúng coi điểm vệ sinh quan trọng, với nguồn nước xử lý Sự có mặt Coliform chứng minh biện pháp khử trùng chưa đạt hiệu 4.2.2 Fecal Coliform vi khuẩn Coliform chịu nhiệt có đặc tính lên men vịng 24 h nhiệt độ 44 0C ± 0,20C 44,5 0C± 0,20C Chúng có phân người động vật máu nóng Bởi Fecal Coliform coi điểm vệ sinh quan trọng, nguồn nước không xử lý Sự có mặt vi khuẩn ngoại cảnh chứng tỏ có nhiễm phân người động vật máu nóng 4.2.3 Escherichia coli giả định vi khuẩn Coliform chịu nhiệt có khả sinh indol từ tryptophan vòng 24 h, nhiệt độ 440C ± 0,20C 44,5 0C± 0,20C 4.2.4 Escherichia coli (E.coli) xem E coli giả định, chúng cho kết dương tính phép thử metyl đỏ loại cacboxyl acid glutamic, chúng khơng có khả tạo metyl acetyl cacbinol, sử dụng xitrat nguồn cung cấp cacbon nhất, sinh trưởng canh thang kali xyanua (KCN) Việc phát E.coli giả định nước phương pháp này, thông thường để cung cấp chứng ô nhiễm phân 4.3 Nguyên tắc: Cấy phần mẫu thử pha lỗng khơng pha lỗng vào dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactosa Kiểm tra ống thử sau 24 h 48 h nuôi nhiệt độ 35 0C 370C; cấy chuyển tiếp từ ống có biểu đục kèm theo sinh khí vào mơi trường khẳng định chọn lọc để tìm Coliform Fecal Coliform muốn tìm E Coli giả định cấy vào mơi trường mà qua quan sát thấy tạo thành indol Nuôi môi trường khẳng định 48 h nhiệt độ 35 0C 370C để phát vi khuẩn coliform, 44 0C khoảng 24h để phát loại coliform chịu nhiệt E Coli giả định Bằng phương pháp thống kê, tính toán số xác xuất cao dạng coliform, coliform chịu nhiệt E Coli giả định có mặt 100ml mẫu thử, từ số ống thử cho kết xác nhận dương tính 4.4 Dung dịch pha lỗng, mơi trường ni cấy thuốc thử Các ngun liệu chính: Sử dụng hố chất thuộc loại phân tích để pha chế mơi trường ni cấy thuốc thử, tuân theo dẫn cách pha chế môi trường Nếu sử dụng môi trường hồn chỉnh dạng khơ theo sát dẫn nhà sản xuất Để pha chế môi trường, sử dụng nước cất dụng cụ thuỷ tinh nước loại ion, khơng chứa chất ức chế sinh trưởng vi khuẩn điều kiện thử 4.4.1 Dung dịch pha loãng Để tạo nên độ pha loãng mẫu thử, sử dụng dung dịch pha loãng sau: - Nước pepton (0,1%) Pepton Nước cất 1,0g 1000ml Hoà tan pepton khoảng 950 ml nước Chỉnh pH dung dịch NaOH HCl (1 mol/l), cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,1 Thêm nước cất cho đủ 1000 ml, phân phối thành lượng phù hợp khử trùng 1210C ± 10C 15 phút - Dung dịch pepton- muối: Pepton 1,0g Natri clorua (NaCl) Nước cất 8,5g 1000ml Hoà tan thành phần khoảng 950 ml nước cách đun sôi Chỉnh pH dung dịch NaOH HCl (1 mol/l) cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,1 Thêm nước cất cho đủ 1000 ml, phân phối thành lượng phù hợp khử trùng 1210C ± 10C 15 phút - Dung dịch Ringer- nồng độ phần tư Natri clorua (NaCl) 2,25 g Kali clorua (KCl) 0,105g Canxi clorua khan 0,12g Natri hidro cacbonat Nước cất 0,05g 1000 ml Hoà tan thành phần phân phối thành lượng phù hợp Khử trùng 1210C ± 10C 15 phút pH cuối phải 7,0 ± 0,1 - Dung dịch đệm photphat: Kali hidro photphat (KH2PO4) 42,5 mg Magie clorua (MgCl2) 190 mg Nước cất 1000 ml pH cuối phải là7,0 ± 0,1 4.4.2 Môi trường phân lập - Canh thang lactosa đặc, đóng ống 10ml, có ống sinh Cơng thức: Pepton 10g Cao thịt 6g Lactosa 10g Bromocresol tía Nước cất - 0,02g 1000ml Canh thang Lactosa loãng pha chế cách pha loãng canh thang lactosa đặc với thể tích nước cất tương đương làm riêng cách giảm nửa lượng chất thành phần, đóng ống 5ml, có ống sinh Sau đóng ống sấy hấp 121o/15ph cho pH = 6,9 ± 0,2 Hoặc sử dụng canh thang MacConkey: - Canh thang MacConkey đặc: Muối mật 10 g Pepton 40 g Lactosa 20g Natri clorua 10 g Bromo cresol tía dung dịch 1% (v/v) pha etanol 2ml Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 - Canh thang MacConkey loãng: Chuẩn bị canh thang MacConkey loãng cách pha lỗng mơi trường MacConkey đặc với thể tích nước cất tương đương, làm riêng cách giảm nửa lượng chất thành phần Phân phối mơi trường nồng độ lỗng thành lượng ml/ống môi trường nồng độ đặc thành lượng 10 ml, có ống sinh Hấp 1150C 10 phút 4.4.3 - Môi trường khẳng định: Canh thang BGBL (Brilliant Green Bile lactosa ), đóng ống 5ml, có ống sinh Để khẳng định có mặt vi khuẩn Coliform Cơng thức: Pepton 10g Lactosa 10g Muối mật 1,5g Brilliant Green 0,0133g Nước cất 1000ml Sau đóng ống sấy hấp 115o/10ph cho pH = 7,2 ± 0,2 - Môi trường EC (kiểm tra tính sinh khí) Để khẳng định có mặt vi khuẩn Coliform chịu nhiệt Công thức: Tryptoza 20g Lactosa 5g Bilesalt mixture 1,5g Dikali hidro photphat (K2HPO4) 4g Kali dihidro photphat KH2PO3) 1,5g Sodium chloride Nước cất 5g 1000ml pH = 6,9 ± 0,2 Khử trùng, đóng ống canh thang BGCL - Nước trypton (thử phản ứng indol) Để khẳng định có mặt E.coli giả định Một vài loại pepton cho kết tốt với phép thử 35 0C 370C lại khơng thoả mãn với phép thử indol 440C Người ta thấy trypton thoả mãn điều kiện kiến nghị dùng Trypton Natri clorua Nước cất 20 g 5g 1000 ml 10 Hoà tan thành phần chỉnh pH đến 7,5 Phân phối vào lượng ml hấp 1150 C 10 phút 4.5 Thiết bị, dụng cụ: Các thiết bị thơng thường phịng thí nghiệm vi sinh gồm có: - Tủ sấy nóng để khử trùng khơ nồi hấp áp lực - Tủ ấm bể điều nhiệt điều chỉnh nhiệt độ 35 0C ± 0,5 0C 370C ± 0,5 0C - Tủ ấm bể điều nhiệt điều chỉnh nhiệt độ 440C ± 0,25 0C 44,50C ± 0,25 0C - pH mét - Pipet khắc vạch 10ml –1ml vô khuẩn micropipet đầu típ vơ khuẩn tương ứng - Que cấy, đèn cồn - Các ống nghiệm vô khuẩn 4.6.Cách tiến hành: 4.6.1 Chuẩn bị mẫu: Chọn đậm độ mẫu nuôi cấy tuỳ theo nguồn nước xử lý hay không, hay bị nhiễm bẩn + Trường hợp nước xử lý, nước nên chọn cấy phương pháp ống: xếp ống canh thang lactosa đặc ống canh thang lactosa loãng + Trường hợp nước chưa xử lý, chọn phương pháp cấy nhiều ống xếp hàng, hàng ống, hàng đầu canh thang lactosa đặc hàng sau ống canh thang lactosa loãng 4.6.2 Pha loãng mẫu: + Phương pháp ống khơng cần pha lỗng mẫu + Phương pháp nhiều ống: pha lỗng cách hút vơ khuẩn 1ml nước nguyên cho vào ống chứa 9ml dung dich pha lỗng mẫu để có đậm độ pha lỗng 10 -1 Hút trộn lên xuống 20-25 lần để trộn mẫu với dung dịch pha loãng Từ đậm độ này, lại hút 1ml 11 chuyển sang ống chứa dung dịch pha lỗng mẫu thứ 2, có đậm độ pha loãng 10 -2 Cứ pha loãng tới đậm độ cần thiết Mỗi đậm độ thay pipet 4.6.3 Cấy mẫu bước (nuôi cấy để phân lập): a Phương pháp cấy ống: ống canh thang lactosa đặc, ống cấy 10ml nước mẫu đậm độ nguyên chất ống canh thang lactosa loãng, cấy ml nước nguyên ống canh thang lactosa loãng cấy 1ml nước đậm độ pha loãng 10 -1 0,1ml nước nguyên b Phương pháp cấy nhiều ống: Nếu có điều kiện nên nuối cấy hàng ống Nếu phải tiết kiệm mơi trường hàng ống: + Hàng thứ xếp ống canh thang lactosa đặc, cấy ống 10 ml nước nguyên chất + Hàng thứ xếp ống canh thang lactosa loãng, cấy ống ml nước nguyên chất + Hàng thứ xếp ống canh thang lactosa loãng, cấy ống 1ml mẫu nước đậm độ pha loãng 10-1 +Hàng thứ 4,5 cấy đến đậm độ cần thiết Nuôi cấy: Nuôi ống môi trường cấy mẫu 48 h nhiệt độ 35 0C ± 0,50C 370C± 0,50C, lấy đọc kết bước c Đọc kết bước 1: Kiểm tra ống mẫu cấy sau 18÷24 h ni ấm coi phản ứng dương tính ống có biểu đục vi khuẩn lên men lactosa sinh acid, chuyển màu mơi trường tím sang vàng sinh ống sinh Nuôi tiếp tủ ấm ống nghiệm chưa có dấu hiệu biến đổi nói kiểm tra lại chúng sau 48 h để tìm phản ứng dương tính Ghi tất ống (+) theo đậm độ cấy Ví dụ phương pháp ống: + ống canh thang lactosa đặc, cấy 10ml, (+), ghi 12 + ống canh thang lactosa loãng (+) ghi + ống canh thang lactosa loãng (+) ghi Kết số 11 Trường hợp tất ống (+) vậy, cần tiếp tục pha loãng cấy theo phương pháp nhiều ống, bắt đầu nhắc lại đậm độ (+) loãng vừa cho, 10-1 phải cấy đậm độ 10-2, 10-3 Ví dụ phương pháp nhiều ống: + ống canh thang lactosa đặc, cấy 10ml, (+) ghi + ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước nguyên, (+) ghi + ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước 10-1, (+) ghi + ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước 10-2, (+)2 ghi + ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước 10-3, (-) ghi Kết số là: 3 Chú ý: Trường hợp tất ống cấy (+) cần pha loãng tiếp để cấy thêm đậm độ nữa, nêu phương pháp cấy ống Chọn ống cấy chuyển tiếp: chọn đậm độ pha loãng cao mà tất ống cấy cho kết (+), từ lấy đậm độ pha lỗng cao để có kết số Ví dụ, trường hợp 3 20, chọn Tất ống (+) số cấy chuyển sang bước Nếu khơng nắm vững lí lịch mẫu nước, nên chọn thêm đậm độ đặc cho tất ống (+) để cấy chuyển sang bước 4.6.4 Cấy chuyển bước (Các phép thử khẳng định): Điều quan trọng cần lưu ý phản ứng dương tính ống môi trường phân lập kết giả định coliform Do đó, cần phải tiến hành phép thử xác nhận, tốt hết chủng cấy khiết a Vi khuẩn coliform Để khẳng định có mặt coliform, dùng que cấy pipet pasteur cấy ống (+) sang ống canh thang BGBL Mỗi ống cần thay pipet khử trùng kỹ que cấy Ví dụ trường hợp trên: chuyển ống canh thang lactosa cấy 1ml nước đậm độ 10-1 ống cấy 1ml đậm độ 10-2 (+) sang ống canh thang BGCL ghi đủ nhãn: 13 Địa điểm, thời gian, thể tích mẫu, cần cấy ống canh thang lactosa (+) cấy 1ml mẫu nước đậm độ nguyên sang ống canh thang BGBL Tổng cộng ống Để tủ ấm 35 0C 370C vòng 48 giờ, lấy kiểm tra tính sinh khí đọc kết b Vi khuẩn Fecal coliform E Coli giả định - Để khẳng định có mặt vi khuẩn coliform chịu nhiệt, dùng que cấy pipet pasteur cấy ống (+) sang ống môi trường EC Mỗi ống cần thay pipet khử trùng kỹ que cấy Để tủ ấm 440C vịng 24 giờ, lấy kiểm tra tính sinh khí đọc kết - Để khẳng định cự có mặt E Coli giả định, dùng que cấy pipet pasteur cấy ống (+) sang ống trypton để tạo indol 44 0C vòng 24 h Sau thêm 0,2 ml ÷ 0,3 ml thuốc thử kovac vào ống nước trypton (đã cấy mẫu): việc xuất màu đỏ sau lắc nhẹ chứng tỏ có mặt indol 4.7 Tính tốn báo cáo kết - Cách chọn ống (+) ghi kết tương tự nêu Ví dụ, cấy để khẳng định có mặt coliform với trường hợp ống trên, đó: + ống cấy chuyển từ canh thang lactosa có cấy ml mẫu nguyên (+), ghi + ống cấy chuyển từ canh thang lactosa cấy 1ml mẫu đậm độ 10-1 (+), ghi + ống cấy chuyển từ canh thang lactosa cấy ml mẫu đậm độ 10-2 (+)1 ống, ghi Kết có 3 1, đầy đủ 3 0, chọn số Thường có bảng số để tra số MPN cho: Phương pháp cấy ống Phương pháp cấy nhiều ống, hàng ống- gọi phương pháp ống Phương pháp cấy nhiều ống, hàng ống Trường hợp cụ thể tra bảng phương pháp cấy ống số 43 Nhưng đọc kết số đậm độ 10 -1 mà bảng số dùng cho đậm độ đầu 10ml nước nguyên Tức pha loãng 100 lần, nên kết là: Tổng số Coliform = 4300/100ml 14 Đọc kết tính tốn số Fecal Coliform theo MPN, E coli giả định giống với Coliform tổng số Tra bảng MPN tương ứng tính: số Fecal Coliform/100ml mẫu; tính số E Coli giả định/100 ml mẫu Bảng 1: Chỉ số MPN cho phương pháp cấy ống: ống 10ml, ống 1ml, ống 0,1ml Số ống (+) MPN/100ml Giới hạn tin cậy 000 0-5,9 100 0,05-13 110 0,5-14 200 0,5-19 210 1,5-19 300 1,6-29 310 12 3,1-30 400 15 3,3-46 410 21 6,0-53 500 38 6,4-330 501 96 12,0-370 510 200 100-3800 511 >240 Bảng Chỉ số MPN cho phương pháp cấy ống 10ml, ống 1ml ống 0,1 ml Số ống (+) MPN/100ml Giới hạn tin cậy 000 0,5-9 010 0,5-13 100 0,5-20 110 1-23 120 11 3-36 200 1-36 210 15 3-44 15 220 21 4-47 300 23 4-120 310 43 7-210 320 93 15-380 321 150 30-440 322 210 35-470 330 240 36-1300 331 460 71-2400 332 1-100 150-4800 333 >2400 Bảng Chỉ số MPN cho phương pháp cấy ống 10ml, ống ml, ống 0,1ml Số ống (+) MPN/100ml Giới hạn tin cậy 000 100 0,5-7 110 0,5-7 200 0,5-11 210 0,5-13 210 1-17 220 2-21 300 1-19 310 11 2-25 320 14 4-34 330 17 5-46 400 13 3-31 410 17 5-46 420 22 7-67 16 430 27 9-80 440 34 12-96 500 23 7-70 510 33 11-93 520 49 17-126 530 79 25-187 540 130 35-302 550 240 68-754 551 348 118-1005 552 542 180-1405 553 918 303-3222 554 1609 635-5805 Xác định Coliform kỹ thuật màng lọc Kỹ thuật màng lọc coi kỹ thuật hàng đầu kỹ thuật vi sinh- vệ sinh mơi trường, đảm bảo độ nhanh nhạy, xác Kỹ thuật có lợi việc kiểm tra, giám sát khẩn cấp nguồn cấp nước, nguồn nước tự nhiên nước ngầm sâu thử nghiệm với thể tích mẫu tương đối lớn Mặt hạn chế kỹ thuật khó tiến hành phân tích nguồn nước có độ đục lớn chứa nhiều tạp khuẩn Thêm nữa, trang thiết bị chuyên dùng cho kỹ thuật lúc sẵn có 5.1 Nguyên tắc: Lọc lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại vi khuẩn, đặt màng lọc lên môi trường nuôi cấy thạch-lactosa chọn lọc miếng đệm hấp thụ bão hoà môi trường lỏng chọn lọc chứa lactosa Nuôi cấy màng lọc 24 h nhiệt độ 35 0C 370C để phát vi khuẩn coliform, 440C để phát vi khuẩn coliform chịu nhiệt 17 Đếm trực tiếp khuẩn lạc đặc trưng hình thành màng; cấy số khuẩn lạc để thử nghiệm xác nhận việc sinh khí indol Tính tốn số vi khuẩn coliform, coliform chịu nhiệt E coli giả định có 100 ml mẫu Kỹ thuật cần phải tiến hành song song với kỹ thuật MPN để xác định khả áp dụng so sánh kết 5.2 Vật liệu Bao gồm tất dụng cụ hố chất mơi trường nêu kỹ thuật MPN để xác định Coliform Fecal Coliform kể thạch Endo Ngoài cần có: - Thiết bị lọc: Có nhiều loại, có loại dùng lần, có loại nhựa khử trùng nhiệt ẩm, luộc sơi để dùng lại cần bơm nén (syringe), có loại kim loại kèm theo bóp cao su máy hút chân không - Nguyên tắc cấu tạo chung gồm: + Giá đỡ để đặt màng lọc vô trùng + Phễu lọc vô trùng thiết bị hút thiết bị nén Các vật tư trang bị khác cần có: - Màng lọc: Mỗi mẫu cần đến màng lọc vô trùng - Máy đếm khuẩn lạc - Tủ ấm, tốt tủ ấm nước, đảm bảo độ ẩm tương đối đạt 90% 5.3 - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu: Kiểm tra lý lịch mẫu để dự kiến thể tích mẫu đem lọc Nước xử lý khử trùng lọc 100ml Nếu lọc 200ml nên chuẩn bị nước pha lỗng vơ trùng để thấm ướt màng lọc trước lọc để nước mẫu lọc dàn khắp màng lọc, tạo khuẩn lạc phát triển riêng rẽ Tóm lại, chọn thể tích mẫu để lọc cho có khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tốt có khoảng 20-80 khuẩn lạc Coliform màng lọc tổng số loại tạp khuẩn không vượt 200 khuẩn lạc màng lọc - Lọc mẫu: Lắp đặt vô trùng màng lọc lên đĩa đệm giá đỡ kẹp vô trùng, mặt kẻ ô màng lọc quay lên (Khơng kẻ đặt mặt nhẵn lên trên) sau tháo phễu lọc Phễu lọc vơ trùng lắp khít lại mặt màng lọc, vặn chốt để tránh nước rỉ tràn qua rìa đáy phễu, mà khơng lọc qua màng lọc Rót nước mẫu vào 18 phễu theo thể tích chọn Hút máy hút chân khơng bóp cao su cho cạn Có tác giả dùng nước pha lỗng vơ trùng rửa tráng phễu lọc để tránh bỏ sót vi khuẩn bám dính vào thành phễu Như vậy, cần màng lọc kiểm tra vơ trùng nước pha lỗng lọc cấy mẫu - Cấy mẫu: Tháo bình chân khơng, tháo phễu lọc nhanh chóng dùng kẹp lấy màng lọc lọc, đặt đĩa môi trường thạch Endo cách vô trùng - Ủ nuôi cấy: + Tốt có tủ ấm nước, đĩa mơi trường ni cấy có màng lọc vào túi nilon buộc kính ngâm ngập nước, nhiệt độ 35-370C 22-24 + Tủ ấm khơng khí 35-370C, cần theo dõi độ ẩm tương đối cho đạt 90%, úp ngược đĩa mơi trường nuôi cấy tủ (để tránh bay làm khô môi trường), để 35-370C 22-24 - Vô trùng lại phận giá đỡ phễu lọc sau mẫu luộc sôi, xông hơi, cồn đốt nhiệt Tuỳ điều kiện, có tác giả đem phơi chúng phút xạ cực tím, thấy đạt hiệu diệt trùng 99,9% Nói chung cần kiểm tra hiệu biện pháp khử trùng - Có thể trước cấy thạch Endo, đặt màng lọc đĩa hộp lồng có đệm hút chứa mơi trường canh thang Lauryl tryptose 1,5-2 để khuyến khích phục hồi Coliform nhiệt độ 35-370C, độ ẩm tương đối 90% Giai đoạn gọi giai đoạn tăng sinh - Đếm số khuẩn lạc Coliform: Đếm tất khuẩn lạc đỏ hồng có ánh kim, ánh kim điển hình, phủ tồn khuẩn lạc, đỉnh khuẩn lạc, rìa khuẩn lạc Dùng máy đếm (nếu có) đếm mắt thường Lưu ý sau 24 giờ, ánh kim nhạt màu dần hẳn - Xác định Coliform : Do có trường hợp sinh ánh kim khơng điển hình khuẩn lạc Coliform ngược lại vi khuẩn Noncoliform ngẫu nhiên sinh ánh kim nên cần xác định Coliform Đơn giản cấy chuyển khuẩn lạc ánh kim sang canh thang BGBL để kiểm tra khả lên men Coliform gây chuyển thành môi trường acid sinh kiểm tra đặc tính β Galactosidase (+) Cytocrome Oxydase (-) Coliform 19 5.4 - Tính tốn báo cáo kết quả: Tổng Coliform/100ml Số khuẩn lạc Coliform ánh kim đếm =  x 100 - % Coliform xác nhận Số ml nước mẫu lọc Số khuẩn lạc Coliform xác nhận =  x 100 - % Coliform kiểm tra Số khuẩn lạc ánh kim kiểm tra Số khuẩn lạc Coliform kiểm tra =  x 100 Tổng số khuẩn lạc ánh kim Trong đó: - Số khuẩn lạc Coliform đếm số khuẩn lạc có ánh kim - Số khuẩn lạc Coliform xác nhận số khuẩn lạc ánh kim cấy chuyển canh thang BGBL cho lactosa (+), sinh hơI, có phản ứng Cytocrome oxydase (-), β Galactosidase (+) - Số khuẩn lạc Coliform kiểm tra số khuẩn lạc có ánh kim chọn để cấy chuyển: Nếu màng lọc có 20 khuẩn lạc, nên chọn khuẩn lạc để cấy chuyển Tốt cấy chuyển tất Nếu màng lọc có từ 20-80 khuẩn lạc ánh kim mong đợi lý tưởng để đếm, nên chọn 10% tổng số khuẩn lạc để cấy chuyển Nếu màng lọc 80 khuẩn lạc ánh kim tổng số 200 khuẩn lạc mọc lan, mọc thành đám đếm được, cần cấy lại chọn thể tích mẫu thích hợp Ví dụ cụ thể: Mẫu 1: Cấy màng lọc: màng lọc 1, lọc 100ml, đếm 10 khuẩn lạc ánh kim; màng lọc 2, lọc 50 ml, đếm khuẩn lạc ánh kim; màng lọc 3, lọc 10 ml, không đếm khuẩn lạc ánh kim 20 (10 + + 0)  Kết quả: x 100 = tổng số Coliform/100ml (100 + 50 + 10) Mẫu 2: Cũng cấy màng lọc: Màng lọc 1, lọc 60ml, đếm 30 khuẩn lạc ánh kim; màng lọc 2, lọc 30 ml, đếm khuẩn lạc ánh kim; màng lọc 3, lọc 10 ml, đếm khuẩn lạc ánh kim 30 Kết :  x 100 = tổng số Coliform/100ml 60 chọn màng lọc có kết đếm rơI vào khoảng 20-80 khuẩn lạc dự tính với thể tích lọc hợp lý Điều cho thấy, kỹ thuật hàng đầu, số đếm số biểu thị trực tiếp khuẩn lạc có màng lọc, song số tuyệt đối Phương pháp xác định nhanh tổng số Colifform Fecal Colirform Trong thực tế nhiều trường hợp cần xác định nhanh chóng chất lượng vi khuẩn học nguồn nước (có cố hệ thống, xử lý nước, hệ thống phân phối ) Vì khơng thể thiếu phương pháp phát nhanh Yêu cầu phương pháp phát nhanh phải có độ tin cậy, độ nhạy, tương đương với phương pháp, kỹ thuật tiêu chuẩn sử dụng thường ngày Thực tế, kỹ thuật thơng thường cải tiến, đòi hỏi thiết bị, vật liệu đặc biệt Kỹ thuật phát định lượng Coliform Fecal Coliform kit xách tay, sử dụng thực địa ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật giống thao tác kỹ thuật màng lọc 6.1 Vật liệu Bộ KIT để kiểm tra mẫu nước với trang bị kèm theo, xin giới thiệu Oxfam- Delagua Anh mà UNICEF trang bị cho số sở xét nghiệm nước Việt Nam 21 6.2 - Tiến hành: Pha môi trường: Môi trường canh thang Lauryl sunfate dùng cho màng lọc KIT môi trường khô cung cấp kèm theo KIT: Cân 76,2 g môi trường khô cho vào lit nước cất Hoà tan kỹ sấy hấp 1210C/10 phút - Bảo quản môi trường pha chế nơi mát tối, môi trường giữ hàng tháng - Phân phối vơ trùng vào hộp lồng nhôm miếng đệm, khoảng 2-2,5ml - Khử trùng lọc: Cho khoảng ml Methanol vào cốc nhôm, đốt để cháy vài giây, úp ngược phễu lọc, đậy kín miệng cốc để khử trùng phễu lọc Formaldehyt sinh trình cháy thiếu oxy Sau mẫu lọc phải khử trùng lại phễu lọc - Lọc mẫu: Tuỳ theo nguồn nước xử lý hay chưa, hay bẩn mà chọn thể tích cần thiết: 100ml nước khử trùng, nước bẩn cần lọc 10-20ml Cần tính tốn thể tích lọc cho có khoảng 200 khuẩn lạc loại 80 khuẩn lạc Coliform (như kỹ thuật màng lọc nêu trên) màng lọc  Lắp màng lọc vào giá đỡ phần lọc vô trùng, mặt có kẻ vng màng lọc quay lên  Lăp kín phận phễu lọc  Rót mẫu nước vào phễu theo thể tích mẫu chọn  Dùng bóp cao sụ, bóp hút khơng khí phễu lọc để hút nước chảy xuống qua màng lọc, đến cạn nước thơi - Cấy mẫu: Lấy màng lọc ra, đặt miếng đệm ngấm đủ mơi trường, mặt có kẻ màng lọc quay lên - Ủ ấm nhiệt độ 420C ± 0,5 để xác định Fecal Coliform 14-18 giờ, lấy đọc kết Nếu cần sau có khuẩn lạc mọc rõ màng lọc đọc kết sơ - Ủ ấm nhiệt độ 35-370C để xác định Coliform tổng số Chú ý: Mẫu mẫu cuối sau cấy xong không lệch 22 6.3 Kết quả: Đếm tất khuẩn lạc màu vàng có đường kính 1-3ml tính tốn số khuẩn lạc 100 ml mẫu Nếu số khuẩn lạc 200, khó đếm xác được, cần cấy lại mẫu, thể tích mẫu lọc cần Kết quả: + Tổng số Fecal Coliform/100 ml mẫu (nếu ủ 42 0C± 0,5) + Tổng số Coliform/100ml mẫu ( ủ ấm 35-370C) Cần ý: Giống kỹ thuật màng lọc khác, mẫu cần cấy màng lọc) Phương pháp xác định Clostridium Perfringens Clostridium Perfringens vi khuẩn sinh H 2S từ lâu coi điểm vệ sinh thường phát 90-95% tổng số mẫu xét nghiệm phân người động vật Chúng vi khuẩn có nha bào nên chịu nhiệt độ cao tồn tạI lâu dàI ngoại cảnh 7.1 Nguyên tắc: Cấy phần mẫu thử pha lỗng khơng pha lỗng theo thể tích khác vào dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy chọn lọc Thạch Wilson Blair có Natri sulfit dung dịch phèn sắt II Sau diệt tạp khuẩn nuôi cấy nhiệt độ 370C vòng 34 h Kiểm tra ống thử Nếu có Clostridium perfringens sinh H2S tạo khuẩn lạc đen to hạt đậu xanh tạo thành FeS 7.2 Vật liệu - Tủ ấm 370C - Nồi cách thuỷ - Giá đựng ống nghiệm có nhiều lỗ - Pipet chia độ 10-1ml vơ trùng - Dung dịch sunfat sắt II 5% vô khuẩn - Dung dịch nước muối sinh lý 8,5%o đóng ống 9ml, tiệt trùng 1210C/15phút 23 - Thạch Wilson-Blair đóng ống 10ml Công thức: Pepton 10g Cao thịt 5g Dextrose 10g Natri clorua 5g Natri sunfite 0,5g Agar Nước cất 7.3 15g 1000ml Tiến hành - Chuẩn bị mẫu: mẫu nước cách thuỷ 800C/5phút để diệt tạp khuẩn - Thạch ống Wilson- Blair đun chảy hoàn toàn, ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu, thể tích mẫu, để nguội 50-600C, thêm vô trùng giọt sunfat sắt II 5% - Tuỳ theo dự tính mức độ bẩn mẫu nước mà cấy 10ml, 5ml hay 1ml Dùng pipet hút mẫu nước cấy xuống tận đáy ống nghiệm Cần tránh tạo bọt cấy cách vừa thả mẫu từ từ vừa xoay nhẹ pipet rút pipet lên Trộn mẫu với môi trường Làm lạnh nhanh vịi nước cho đơng thạch Quấn giấy đầu ống thạch Mỗi mẫu cấy đậm độ khác - Ủ mẫu 370C/34 giờ, lấy đọc kết - Đếm tất khuẩn lạc đen, to hạt đậu xanh tạo thành sunfua sắt 7.4 Báo cáo kết quả: - Tính tốn số khuẩn lạc nuôi cấy 10ml mẫu nước - Kiểm tra chứng âm tính dương tính với loại môi trường pha chế Tài liệu tham khảo American Public Health Association, Standard Method For Examination of Water and Waste water Sixteenth edition Trung tâm tiêu chuẩn – Chất lượng (1996) Chất lượng nước- Phát đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt E Coli giả định 24 Trường đại học Y Hà Nội (1999), Thực tập vệ sinh môi trường vệ sinh lao động, Hà Nội 1999 Viện Y học lao động Vệ sinh môi trường (2002), Thường quy kỹ thuật Y học lao động vệ sinh môi trường, Hà Nội 25 ... vi khuẩn hiếu khí sống nước để đánh giá thay đổi vi? ??c xử lý nước hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho vi? ??c xử lý nước hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho vi? ??c đánh giá chất lượng vi. .. xuất (nước nguồn, lắng, lọc v.v ) Hoặc đánh giá tình trạng nhiễm vi sinh vật dịng sơng ao, hồ giếng nước vùng khác 2.1 Dụng cụ lấy mẫu: Tất dụng cụ lấy mẫu nước để xét nghiệm vi khuẩn nước cần... ) tình hình vệ sinh nguồn nước, nguồn gây nhiễm nước xung quanh nguồn nước Yêu cầu xét nghiệm mục đích sử dụng nguồn nước Cơ quan yêu cầu xét nghiệm 2.3 Bảo quản vận chuyển Mẫu nước sau lấy mẫu