Báo cáo thí nghiệm công nghệ vi sinh

Bài 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT A. TÓM TẮT LÝ THUYẾT 1. Khái quát các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật: Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm:  Phân lập từ tự nhiên,  Gây đột biến,  Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn,  Bảo quản giống. 2. Một số phương pháp phát hiện giống vi sinh vật có đặc tính mong muốn: Việc phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào:  Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ như kháng sinh, sắc tố, …  Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường  Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật  Sự thay đổi hình thái 3. Một số phương pháp bảo quản giống: Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, nhưng không có cách nào hoàn hảo cả. Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường mang tính kinh nghiệm. 3.1. Giữ giống trên thạch Cấy chuyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường mới. Phương pháp này hay được áp dụng mặc dù tốn nhiều công sức và có thể dẫn đến thoái hóa chủng. Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý thành phần môi trường để tránh thoái hóa chủng. Giống có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 – 5 0C Thời gian cấy chuyền thường từ 1 tuần đến 1 tháng, tùy theo chủng 3.2. Giữ giống dưới lớp dầu khoáng: Khi giữ giống ở 4 – 5 0C, môi trường thường có hiện tượng bị khô làm giống bị chết hoặc giảm hoạt tính. Để khắc phục người ta cho lên bề mặt môi trường một lớp dầu trơ (dầu khoáng, parafin, vaselin, …) Thực hiện như sau: giống sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng trong điều kiện tối ưu đến giai đoạn logarit hoặc đến khi bào tử chín. Sau đó phủ một lớp dầu khoảng 10 mm trên bề mặt môi trường, và gắn kín nút bông bằng parafin. Giữ ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 – 7 0C. Dưới lớp dầu khoáng, vi sinh vật vẫn duy trì sự sống và các chủng hiếu khí vẫn sinh trưởng với tốc độ chậm. Và trong quá trình bảo quản có thể lấy chủng ra bằng cách chọc que cấy qua lớp dầu mà không làm hỏng tình trạng chủng. Cách này giữ chủng được lâu, có thể lên đến nhiều năm, do vậy phải nghiên cứu điều kiện môi trường để đảm bảo dự trữ dinh dưỡng và chống các sản phẩm chuyển hóa hay acid tạo ra trong quá trình sinh trưởng. Thường chọn môi trường giàu protein và có lượng đường tối thiểu. 3.3. Giữ giống trong cát: Phương pháp này thường chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử. Do đặc tính của chủng có khả năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt và nếu gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm thành dạng dinh dưỡng. Thực hiện bằng cách: cát sông được rửa nước cho sạch bụi, có thể rửa bằng cách đun với HCl và rửa lại bằng nước. Rây để lấy các hạt mịn. Sấy khô cát 120 0C trong 3 – 4 giờ. Phân thành từng liều nhỏ trong ống nghiệm và tiệt trùng bằng tủ sấy 160 – 180 0C trong 2 – 3 giờ hoặc 120 0C hai lần cách ngày, mỗi lần 1 giờ. Kiểm tra độ vô trùng của cát. Chủng được nuôi cấy đến khi bào tử chín, đổ cát đã thanh trùng vào và cho bào tử bám vào cát. Đổ cát có dính bào tử vào ống nghiệm khô vô trùng, hút kiệt ẩm và nút kín. Bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc 4 – 5 0C

Bài 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

A TÓM TẮT LÝ THUYẾT

1 Khái quát các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật:

Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm:

 Phân lập từ tự nhiên,

 Gây đột biến,

 Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn,

 Bảo quản giống

2 Một số phương pháp phát hiện giống vi sinh vật có đặc tính mong muốn:

Việc phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào:

 Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ như kháng sinh, sắc tố, …

 Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường

 Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật

 Sự thay đổi hình thái

3 Một số phương pháp bảo quản giống:

Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, nhưng không có cách nào hoàn hảo cả Việclựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường mang tính kinh nghiệm

3.1 Giữ giống trên thạch

Cấy chuyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường mới

Phương pháp này hay được áp dụng mặc dù tốn nhiều công sức và có thể dẫn đến thoái hóachủng Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý thành phần môi trường để tránh thoái hóachủng

Giống có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 – 5 0C

Thời gian cấy chuyền thường từ 1 tuần đến 1 tháng, tùy theo chủng

3.2.Giữ giống dưới lớp dầu khoáng:

Khi giữ giống ở 4 – 5 0C, môi trường thường có hiện tượng bị khô làm giống bị chết hoặc giảmhoạt tính Để khắc phục người ta cho lên bề mặt môi trường một lớp dầu trơ (dầu khoáng,parafin, vaselin, …)

Thực hiện như sau: giống sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng trongđiều kiện tối ưu đến giai đoạn logarit hoặc đến khi bào tử chín Sau đó phủ một lớp dầu khoảng

10 mm trên bề mặt môi trường, và gắn kín nút bông bằng parafin Giữ ở nhiệt độ phòng hoặc ở

4 – 7 0C

Dưới lớp dầu khoáng, vi sinh vật vẫn duy trì sự sống và các chủng hiếu khí vẫn sinh trưởng vớitốc độ chậm Và trong quá trình bảo quản có thể lấy chủng ra bằng cách chọc que cấy qua lớpdầu mà không làm hỏng tình trạng chủng

Cách này giữ chủng được lâu, có thể lên đến nhiều năm, do vậy phải nghiên cứu điều kiện môitrường để đảm bảo dự trữ dinh dưỡng và chống các sản phẩm chuyển hóa hay acid tạo ra trongquá trình sinh trưởng Thường chọn môi trường giàu protein và có lượng đường tối thiểu

3.3.Giữ giống trong cát:

Phương pháp này thường chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử Do đặc tính của chủng có khảnăng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt và nếu gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm thànhdạng dinh dưỡng

Thực hiện bằng cách: cát sông được rửa nước cho sạch bụi, có thể rửa bằng cách đun với HCl

và rửa lại bằng nước Rây để lấy các hạt mịn Sấy khô cát 120 0C trong 3 – 4 giờ Phân thànhtừng liều nhỏ trong ống nghiệm và tiệt trùng bằng tủ sấy 160 – 180 0C trong 2 – 3 giờ hoặc 120

0C hai lần cách ngày, mỗi lần 1 giờ Kiểm tra độ vô trùng của cát

Chủng được nuôi cấy đến khi bào tử chín, đổ cát đã thanh trùng vào và cho bào tử bám vào cát

Đổ cát có dính bào tử vào ống nghiệm khô vô trùng, hút kiệt ẩm và nút kín Bảo quản ở nhiệt

độ phòng hoặc 4 – 5 0C

3.4.Đông lạnh:

Là làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật đã phát triển từ từ đến độ lạnh sâu -20 đến -30 0C,tốt nhất là -80 0C Khi làm lạnh cần chú ý tốc độ làm lạnh thích hợp và phải thêm các tác nhânbảo vệ chống đông thích hợp như glycerin (10 – 15%), sữa (~5%), lòng trắng trứng, …

Tùy độ lạnh mà thời gian bảo quản khác nhau, nếu ở -20 0C, khoảng 6 tháng, còn ở -80 0Ckhoảng 10 năm Khi cần sử dụng thì làm tan băng bằng cách lấy chủng ra và đặt vào bếp cáchthủy 37 0C Không làm tan băng nhiều lần Hoặc có thể dùng que cấy cứng cạo lấy một ít visinh vật đang đông đá rồi cấy lên môi trường thích hợp, phần còn lại trả nhanh về tủ đông

3.5.Đông khô:

Là quá trình làm khô ở áp suất (>1 mbar) và nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông đặc của mẫu)

Ở nhiệt độ này và áp suất đủ thấp, nước đá trong mẫu sẽ thăng hoa Do nước được lấy đi từdạng rắn thành dạng hơi nên nồng độ chất tan trong mẫu sẽ không tăng dần lên như các lúc bayhơi từ dạng lỏng, nên ít ảnh hưởng đến chất lượng sinh học của mẫu, đồng thời khi mẫu khô sẽ

có cấu trúc xốp, dễ dàng lấy lại trạng thái ban đầu khi thêm nước vào

Mẫu sau khi đông khô có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài Phương pháp rấtđắt tiền nhưng cho phép bảo quản giống rất tốt, cho khả năng phục hồi cao mà ít ảnh hưởng đếnhoạt tính

B NỘI DUNG THỰC TẬP

1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có đặc tính mong muốn:

 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym amylase

 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym protease

2 Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật:

 Xác định khả năng sinh kháng sinh của E.coli

 Xác định khả năng sinh kháng sinh của S.aureus

3 Ly trích chủng có tiềm năng và lưu chủng:

 Phân lập và phát hiện các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym protease

Vi sinh vật từ mẫu đất sau khi được cấy trên thạch gelatin, đem ủ thì sẽ phát triển Khi đemtráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch TCA 50% thì nền môi trường sẽ đục vìgelatin bị tủa Nếu chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinhvật mọc sẽ có vòng sáng, trong do gelatin đã bị thuỷ phân nên không bị tủa Đường kínhcủa vòng phân giải gelatin tỉ lệ với hoạt tính

1.2 Tiến hành:

ủ 37 0 C / 24h tráng bề mặt thạch bằng thuốc thử thích hợp

Mẫu đất và

10 ml đệm PBS vortex

7

5 Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật

1.3 Nguyên tắc:

1.4 Tiến hành:

Trải đều vi khuẩn E.coli / S.aureus lên mặt thạch

Đục lỗ 5 lỗ trong bản thạch

Nhỏ vào 5 lỗ lần lượt các dịch chứa:

chủng vi khuẩn B1, B2, B3, B4 và lỗ chứng chỉ chứa môi trường

Để yên để chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

Ủ 37oC trong 16 – 18 giờ

Đọc kết quả

D KẾT QUẢ THỰC TẬP

6 Phân lập và phát hiện các chủng vi khuẩn có đặc tính mong muốn

Trên hộp thạch thấy xuất hiện 3 loại khóm

Dựa vào có sự xuất hiện của vòng tròn sáng xung quanh khóm hay không sau khi cho thuốc thử

ta xác định được khả năng sinh Amylasae hay Protease của các chủng trên như sau:

Chủng Mô tả khóm Trên thạchtinh bột Trên thạchgelatin

Kết luận về khả năng

tạo

Amylase ngoại bào

Protease ngoại bào

1 Khóm lớn, đường kính

khoảng 5 - 8 mm, màu

trắng, rìa gợn đều, có tâm

Vòng sáng trên nền tím than

Vòng trong trên nền trắngđục

3 Khóm nhỏ, tròn, màu vàng,

đường kính khoảng 1 mm

Vòng sáng trên nền tím than

Vòng trong trên nền trắngđục

7 Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật

 E.coli có khả năng sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B1, B3

S.aureus có khả năng sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B3

Bài 3 TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

8 TÓM TẮT LÝ THUYẾT

Enzym amylase có ứng dụng quan trọng trong công nghiệp, thực phẩm, y dược Trong nhữngnăm gần đây amylase được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học để sản xuất gluose làm dịchtiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sảnxuất một số thuốc

Enzym amylase có thể thu nhận từ động vât, vi sinh vật và thực vật, tuy nhiên enzym để có thểứng dụng trong y dược cần trải qua các bước tinh chế từ enzym thô

Thu enzym thô

Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp cơ học (xay),

chiết amylase bằng đệm phosphat.

Loại tạp thô (các mảnh tế bào) bằng rây

Loại tinh bột (để lắng rồi gạn lọc lấy phần dịch)

Lọc phần dịch 2 lần qua giấy để loại hoàn toàn tinh bột

Dịch enzyme thô

Tinh chế enzym amylase bằng alginat

Tạo liên kết giữa amylase với sodium alginat 2%

(15 ml dịch chiết thu được cho vào 75 ml dung dịch sodium alginate 2%

Khuấy, ủ 1 giờ)

Tạo cấu trúc mạng lưới bắt giữ amylase (dùng 15 ml dung dịch CaCl 2 0.7M)

Lọc lấy phần gel có amylase

Tách amylase từ mạng lưới gel alginat (dùng 75 ml dung dịch glucose 2%,

để ở 4 0 C trong 12 giờ.)

Bỏ phần gel thu được phần dịch tinh chế có amylase.

Xác định hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh

chế bằng OD280

Ly tâm 15000 vòng/phút

Pha loãng mẫu enzym thô 10 lần, mẫu enzym tinh chế 5 lần

Lấy 1 ml mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm

Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel

Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel:

Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel: đo mật độ quang của dung dịchsau khi thực hiện phản ứng màu với Iode

 Ống thử: tiến hành pha như sơ đồ bên dưới

 Ống kiểm tra: Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên

nhưng cho dung dịch acid sulfosalicylic vào trước rồi mới cho dung dịch enzyme vào

 Dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra được pha loãng 5 lần Sau

đó, lấy 0,1 ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra sau khi pha loãng đócho vào ống nghiệm khô rồi thêm 0,9 ml dung dịch iod pha loãng 150 lần, so màu ở bướcsóng 560 nm

0,5 ml dung dịch Tricloacetic acid – TCA5%

Giữ ở 300C

30 phút

0,1 ml dd enzyme

Thêm 0,1 ml dd tinh bột 1%

0,1 ml dd NaCl 0,1%

0,2 ml dd đệm phosphat 0.05M pH6

(Vortex)

Lắc đều(Vortex)

Ly tâm 10.000

vòng/phút trong 1 phút

y = 0.0692x - 0.0402R² = 0.9917

V (ml)

Tổng protein

(A 280 )

Tổng hoạt tính Hoạt tính

chuyên biệt

(U/A 280 )

Hiệu suấtTổng protein

A 280

(%)

Hiệu suất tổng hoạt tính protein

(%)

Mứctinh chế

12 NHẬN XÉT

1 Tổng lượng protein:

Tổng lượng trong mẫu dịch enzym thô là A280 = 98,1

Tổng lượng trong mẫu dịch enzym sau tinh chế là A280 = 69

Hiệu suất tinh chế enzym H% = 70,3%

Như vậy, quá trình tinh chế đã giúp loại đi một lượng các protein, trong đó các các protein

không phải là enzym amylase Nhờ đó mẫu dịch enzym amylase sau tinh chế tinh khiết hơn sovới mẫu dịch enzym thô ban đầu

2 Tổng hoạt tính của enzym:

Tổng hoạt tính của enzym thô là U = 5917,5

Tổng hoạt tính của enzym sau tinh chế là U = 4033,9

Như vậy, sau tinh chế thì tổng hoạt tính của dịch enzym bị giảm đi so với dịch thô

3 Hoạt tính chuyên biệt của enzym:

Hoạt tính chuyên biệt của enzym thô là 60,3

Hoạt tính chuyên biệt của enzym tinh chế là 58,46

Qua kết quả thực tập nhận thấy quá trình tinh chế amylase của nhóm làm vẫn chưa đạt kết quảtốt vì trong quá trình tinh chế amylase đã làm mất đi một lượng enzym amylase, làm giảm đimột phần hoạt tính của amylase

5 Nguyên nhân có thể là do:

 Thao tác tinh chế enzym chưa chính xác:

- Tỉ lệ các chất cần cho quá trình tinh chế cho vào chưa thật chuẩn,

- Thời gian ủ, nhiệt độ ủ chưa tuân thủ chặt chẽ,

- Quá trình lọc bỏ tủa thu dịch chứa enzym không cẩn thận nên có thể làmmất đi một lượng enzym amylase,

- Xác định tổng thể tích dịch lọc chứa enzym thô, dịch lọc chứa enzym sautinh chế còn sai số,

 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính Amylase chưa thật đúng

 Thao tác đo quang chưa chính xác gây sai số

Bài 4

CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINAT

13 TÓM TẮT LÝ THUYẾT

Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả năng

chuyển hóa tinh bột và các chất tự thành hỗn hợp cyclodextrin ở các mức độ polymer hóa từ 6,

7 và 8 đơn vị glucose (ứng với α-CD, β-CD và γ-CD) Việc cố định sẽ tận dụng được khả năngtái sử dụng của các CGTase đắt tiền, và tăng cường tính ổn định cũng như hoạt tính enzym

Dựa vào bản chất các liên kết giữa chất mang và enzym, người ta phân loại các phương pháp

cố định enzym sau:

 Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion…

 Phương pháp liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzym và chất mang để tạo

phức giữa enzym-chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

 Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa trên nguyên tắc sự bắt giữ của enzym

vào một mạng lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được nhưng không cho enzymkhuếch tán vào môi trường

 Phương pháp tạo vi nang: enzym được giữ trong các bao vi thể có màng bán thẩm dày

200 Å (cellulose, polysaccarid)

14 NỘI DUNG THỰC TẬP

5. Cố định enzym CGTase lên alginat bằng phương pháp bắt giữ

6. Xác định hoạt tính CGTase sau khi cố định lên alginat bằng phương pháp bắt giữ

7. Cố định enzym CGTase lên alginat bằng phương pháp hấp phụ

8. Xác định hoạt tính CGTase sau khi cố định lên alginat bằng phương pháp hấp phụ

9. Nhận xét, so sánh về hai phương pháp cố định enzym: phương pháp bắt giữ, và phương pháp hấp phụ

15 HÓA CHẤT

10. Maltodextrin 4%: Là cơ chất dùng để xác định hoạt tính của CGTase.

11. Enzym CGTase: Toruzyme ® 3.0 L, Novozymes

13. Phenolphtalein 0,02% (trong đệm Na2CO3/NaHCO3 125 mM, pH 10,5): Chất tạo màu

14. Đệm Tris-HCl 50 mM pH8

15. BSA 0,1 mg/ml: Dùng để xây dựng đường chuẩn định lượng protein

16. Thuốc thử Bradford: Tạo màu với BSA giúp đo OD595

17. Alginat 2%: Là chất mang, nơi enzym CGTase được cố định vào

16 TIẾN HÀNH

Sơ đồ tóm tắt qui trình tiến hành:

Cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ

Tạo dung dịch alginate 2%

Trộn lẫn enzym với chất mang

(Thêm 2ml CGTase vào 20 ml dung dịch alginate 2%)

Tạo liên kết giữa polyme và các ion đa hóa trị

để tạo cấu trúc mạng lưới bắt giữ enzym

(Nhỏ từ từ hỗn hợp enzym và alginat vào 40 ml dung dịch CaCl 2 0,2 M

Vừa nhỏ vừa xoay nhẹ becher)

Rửa phức hợp gel Calci alginat – enzym bằng đệm Tris-HCl

( 3 lần, mỗi lần dùng 15 ml đệm Tris-HCl)

Thu hạt gel Thu dịch rửa

Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định

Xây dựng đường chuẩn Cprotein (µg/ml) = f(OD595)

Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase

Xác định hàm lượng protein trong dịch rửa

Tính toán được hàm lượng protein cố định

Xác định hoạt tính CGTase cố định

Xây dựng đường chuẩn ∆OD550 = f(Cβ-CD (µg/ml))

Xác định hoạt tính của CGTase ban đầu

Xác định hoạt tính của CGTase cố định

Nhận xét về Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định bằng

phương pháp bắt giữ

Cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ

Tạo dung dịch alginate 2%

Tạo cấu trúc chất mang hấp phụ dạng gel Calci alginat

(Nhỏ từ từ 20 ml alginat vào 40 ml dung dịch CaCl 2 0,2 M)

Thu hạt gel Ca-alginat

Hấp phụ enzym vào hạt gel Ca-alginat

(Cho hạt gel vào 20 ml đệm Tris-HCl pH8,

thêm 2 ml enzym CGTase vào dung dịch.

Cố định enzym trên gel trong 1 giờ)

Rửa hạt gel Calci alginat – enzym bằng đệm Tris-HCl

( 3 lần, mỗi lần dùng 15 ml đệm Tris-HCl)

Thu hạt gel Thu dịch rửa

Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định

Xây dựng đường chuẩn Cprotein (µg/ml) = f(OD595)

Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase

Xác định hàm lượng protein trong dịch rửa

Tính toán được hàm lượng protein cố định

Xác định hoạt tính CGTase cố định

Xây dựng đường chuẩn ∆OD550 = f(Cβ-CD (µg/ml))

Xác định hoạt tính của CGTase ban đầu

Xác định hoạt tính của CGTase cố định

Nhận xét về Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định bằng

phương pháp hấp phụ

Điểm khác biệt giữa cách cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ và phương pháp hấp phụ:

Cố định enzym bằng

phương pháp bắt giữ Cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ

Hạt gel Ca-aglinate được tạo ra cùng lúc

với quá trình bắt giữ enzym

Thời gian bắt giữ enzym nhanh

Hạt gel Ca-aglinate được tạo ra trước rồi mới hấp phụ enzym

Thời gian để hấp phụ enzym lâu

Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định

3.1 Nguyên tắc xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định

Phương pháp dựa trên sự thay đổi λmax của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue khi tạo phứchợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm

có λmax 465 nm Khi kết hợp protein thì thuốc nhuộm có λmax595 nm

Trước tiên ta xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein đã biết trước nồng độ Sau đó thựchiện đo dung dịch thử để xác định hàm lượng protein Từ đồ thị chuẩn và các giá trị mật độquang đo được của mẫu thử chứa protein cần xác định, suy ra hàm lượng protein mẫu đo(tương ứng với giá trị trục hoành)

Công thức tính:

Hàm lượng protein có trong 1 ml enzym: mg protein/ml enzym = n*x*10-3

Với n: hệ số pha loãng x: nồng độ protein có trong mẫu thử suy ra từ đường chuẩn (μg/ml)

Hàm lượng protein cố định: m pr cố định = m pr ban đầu – m pr không cố định

Hiệu suất cố định protein: H% = m pr cố định / m pr ban đầu (%)

3.2 Cách xác định hàm lượng và hiệu suất hoạt tính protein cố

định

 Xây dựng đường chuẩn định lượng protein C protein (µg/ml) = f(OD 595 )

Pha dung dịch BSA với các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml từ dung dịch BSA 0,1 mg/ml