Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trong và ngoài nước

Trong công tác chọn tạo giống ngô lai, các kỹ thuật như tạo dòng thuần bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá tính đa dạng di... Ý nghĩa khoa học và thực ti

Trong nền nông nghiệp Việt Nam, ngô là cây màu quan trọng nhất, đứng vị trí thứ hai sau lúa, được trồng nhiều ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa

vụ và hình thức canh tác Kể từ thập niên 90 đến nay, cuộc cách mạng ngô lai đã làm thay đổi căn bản nghề trồng ngô ở nước ta, đưa nước Việt Nam đứng trong hàng ngũ các nước trồng ngô tiên tiến trong khu vực Châu Á (Trần Hồng Uy,1997)[1]

Những năm gần đây, sản xuất ngô của nước ta đã có sự phát triển mạnh mẽ về diện tích, năng suất và sản lượng Tỷ lệ tăng trưởng bình quân trong 20 năm qua về diện tích là 7,5%, năng suất là 6,7% và sản lượng là 24,5% (TS.Bùi Mạnh Cường, 2007)[2] Đặc biệt việc khai thác tiềm năng năng suất thông qua ưu thế lai và đưa nhanh các giống ngô lai vào sản xuất trên quy mô rộng lớn là một trong những đóng góp quan trọng làm tăng sản lượng lương thực cả nước

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học (CNSH)

đã tạo ra những thay đổi kì diệu trong nhiều lĩnh vực Trong nông nghiệp CNSH được coi là phương tiện giải quyết các vấn đề khó khăn mà công tác chọn tạo giống truyền thống khó có thể thực hiện được hoặc nếu có thực hiện được thì mất nhiều thời gian

Trong công tác chọn tạo giống ngô lai, các kỹ thuật như tạo dòng thuần bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá tính đa dạng di

truyền của tập đoàn nguyên liệu đã được sử dụng và là trợ giúp đắc lực cho phương pháp truyền thống, góp phần đẩy nhanh việc xây dựng các tổ hợp lai ưu tú đáp nhu cầu ngày càng tăng về số lượng cũng như chủng loại giống ngô lai vào sản xuất, giảm thiểu một số công đoạn trong công tác chọn tạo Vì vậy, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thuần

Việt Nam tại Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội”

2 Mục tiêu của đề tài

- Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong phòng thí nghiệm

- Kiểm tra độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử

- Dựa trên chỉ thị phân tử SSR xác định mức độ đa hình và xây dựng sơ đồ phả

hệ của các dòng

- Dự đoán các tổ hợp lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

• Ý nghĩa khoa học

Đề tài nghiên cứu được thực hiện chi tiết, các vấn đề liên quan đến việc đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô, phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với mong muốn cung cấp thêm số liệu, thông tin và khả năng ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống lai trong điều kiện cụ thể ở Việt Nam

• Ý nghĩa thực tiễn

Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, kết hợp các phương pháp đánh giá đồng ruộng sẽ nhanh chóng xác định, chọn lọc tổ hợp lai cho năng suất cao

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: 20 dòng ngô thuần Việt Nam

- Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá độ thuần di truyền, khoảng cách di truyền giữa các dòng, phân nhóm và dự đoán ưu thế lai nhờ sử dụng chỉ thị SSR

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện nghiên cứu Ngô - Đan Phượng - Hà Nội

- Thời gian từ 23/02/2011 đến 22/05/2011

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

Cây ngô (Zea mays.L) thuộc chi Zea, phân họ ngô (Maydeae), họ phụ hòa thảo (Panicoideae), họ hòa thảo (Grmaineae), bộ hòa thảo (Grmainale), lớp một lá mầm (Cosmobionia) và có bộ nhiễm sắc thể 2n=20 Cây ngô là cây hàng năm với hệ thống rễ chùm phát triển, là loài cây giao phấn có hoa đơn tính cùng gốc

1.1 Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế

Trong lịch tiến hóa của khoảng một nghìn loài cây trồng phổ biến nhất trên trái đất hiện nay, chưa có loài cây trồng nào phát triển nhanh chóng và có nhiều công dụng cho con người như cây ngô (Cao Điểm Đắc, 1988)[3]

Trước hết ngô là cây ngũ cốc nuôi sống gần 1/3 dân số toàn cầu Toàn thế giới

sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực Ngô là lương thực chính của người dân khu vực Đông Nam Phi, Tây Phi, Nam Á… Ngô là thành phần quan trọng bậc nhất trong thức ăn chăn nuôi Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn chăn nuôi tổng hợp là

từ ngô, 71% sản lượng ngô thế giới làm thức ăn chăn nuôi (Ngô Hữu Tình,2003)[8].Ngô còn là một loại hàng hóa xuất khẩu của ngành nông nghiệp, trên thế giới hàm lượng ngô xuất nhập khẩu khoảng 70 triệu tấn Bên cạnh đó ngô còn đem lại nhiều lợi nhuận cho người dân Theo thống kê của ISAAA, ở Philippine, có ít nhất

200 ngàn người nông dân hưởng lợi từ cây ngô CNSH trong năm 2008 Nghiên cứu

về tác động của giống ngô này đến kinh tế - xã hội cho thấy trong niên vụ

2003-2004, ngô CNSH làm thu nhập cho người dân thêm 7482 peso/ha (khoảng 135USD) trong mùa khô, còn trong mùa mưa thì thu nhập tăng thêm là 7080 peso/ha (khoảng 125USD) Sử dụng số liệu năm 2008, các nhà khoa học đã tính được rằng ngô Bt có thể cho thu nhập cao hơn từ 5-14% trong mùa mưa và từ 20-48% trong mùa khô (Clive James, 2008)

1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trên thế giới

Nhờ có vai trò quan trọng trong nền kinh tế mà cây ngô ngày càng được quan tâm và phát triển Ngô là một trong ba cây lương thực lấy hạt quan trọng nhất trong nền nông toàn cầu và được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới đem lại năng

suất và sản lượng cao nhất trong các loại ngũ cốc Thực vậy, năm 2009 theo số liệu của tổ chức Nông nghiệp và lương thực LHQ (FAO) về sản xuất ngô: Diện tích toàn thế giới là 159,53 triệu ha, Năng suất trung bình là 5,18 tấn/ha, tổng sản lượng817,1 triệu tấn Năm 2009, phần lớn sản lượng ngô thế giới tập trung ở các nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và Ấn Độ, chiếm trên 75% (FAOSTAT, 2009).

Bảng 1.1: Tình hình sản xuất ngô ở một số nước dẫn đầu trên thế giới năm từ 2004

Năm 2009 diện tích trồng ngô ở các nước Đông Nam Á là 8,212 triệu ha, năng suất bình quân đạt 31,3 tạ / ha với tổng sản lượng 25,67 triệu tấn (USDA, 2010) [23]

Kể từ khi ngô được phát hiện ở châu Mỹ và du nhập vào các khu vực khác trên thế giới, trong một khoảng thời gian dài năng suất chỉ đạt khoảng 0,1-0,2 tấn/ha Nhưng đến nay nhờ những ứng dụng rộng rãi nhiều tiến bộ khoa học về kĩ thuật di truyền chọn giống, các biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến, cơ giới hoá… đặc biệt là khai thác và sử

dụng ưu thế lai ở ngô trong quá trình chọn giống.

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô ở Việt Nam

Trong nền nông nghiệp Việt Nam, cây ngô là cây màu quan trọng, cây lương thực thứ hai sau lúa nước Ngô được đưa vào Việt Nam cách đây khoảng 300 năm, mặc dù cây lương thực đứng thứ hai nhưng do truyền thống trồng lúa nước nên ngô vẫn chưa được chú trọng, không phát huy được tiềm năng của nó (Ngô Hữu Tình, 2009)[9] Ngày nay, sản xuất ngô đã được phổ biến rộng khắp cả nước từ vùng núi cao đến đồng bằng, trung du Năm 2009, diện tích ngô cả nước là 1086.8 nghìn ha, năng suất đạt 40,8 tạ/ha và sản lượng ngô là 4431,8 nghìn tấn Nhưng 9 tháng đầu năm 2009, Việt Nam đã phải nhập hơn 0,8 triệu tấn ngô, do nhu cầu dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi tăng mạnh

Hiện nay thị phần giống ngô lai của Việt Nam chiếm khoảng trên 60%, chủ yếu là giống lai đơn được áp dụng vào sản xuất ở tất cả các vùng sinh thái trong cả nước.Trong những năm gần đây Viện Nghiên cứu Ngô đã liên kết với các Viện thành viên trong VAAS và các công ty trong nước và đã nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu và chuyển giao nhanh các kết quả nghiên cứu phục vụ sản xuất, như các giống ngô LVN4, LVN9, LVN14, LVN99…

Bảng1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2005 – 2009

(1000 ha)

Năng suất Tạ/ ha

Sản lượng (1000 tấn)

Bảng 1.3 Dự kiến diện tích, năng suất và sản lượng ngô cả nước

đến năm 2020

( ha )

Năng suất ( tạ / ha)

Sản lượng Triệu tấn

Nguồn: Chiến lược pháp triển cây ngô đến năm 2020[14]

-Cải thiện thu nhập và đời sống cho người sản xuất ngô, nâng cao hiệu quả sử dụng đất, lao động và vốn đầu tư

-Đẩy mạnh nghiên cứu chọn tạo giống ngô lai đảm bảo đủ sức cạnh tranh trên thị trường trong nước và xuất khẩu

-Đảm bảo cung cấp giống ngô lai Việt Nam chiếm 51-55% thị phần ngô lai của

cả nước nhằm chủ động hạt giống với giá bán phù hợp với khả năng đầu tư của nông dân

-Nghiên cứu các giải pháp về khoa học kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất ngô, tăng thu nhập cho người trồng ngô, bảo vệ môi trường sinh thái, góp phần xây dựng nền nông nghiệp bền vững

1.3 Cơ sở khoa học

1.3.1 Ưu thế lai (ƯTL) - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng trong chọn tạo giống ngô

ƯTL là hiện tượng di truyền, trong đó con lai biểu hiện sức sống, các đặc tính hình thái, sinh lý, khả năng thích nghi, khả năng chống chịu và năng suất hơn hẳn

bố mẹ (Nguyễn Lộc, 1997) [5] Người đầu tiên quan sát thấy hiện tượng ƯTL ở ngô

là Charles Darwin, ông nhận thấy những cây giao phối phát triển cao hơn những cây

tự phối 20% trong tác phẩm “ Tác động của giao phối và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản năm 1876

Năm 1878 nhà nghiên cứu người Mỹ tên Beal đã áp dụng thực tế ƯTL trong việc tạo giống ngô lai giữa giống Ông thu được những cặp lai hơn hẳn các giống bố

mẹ về năng suất từ 10-15%

Năm 1904 Shull lần đầu tiên tiến hành tự thụ cưỡng bức ở ngô để thu được các

dòng chuẩn và đã tạo ra những giống lai từ các dòng chuẩn này Năm 1913 chính Shull đã đưa vào tài liệu khoa học thuật ngữ “Hetetosis” để chỉ ƯTL (Hetetosis là từ rút gọn của Stimulus of heetrozygosis) Từ năm 1918 Jones đề xuất sử dụng lai kéo trong sản xuất để giảm giá thành hạt giống thì việc áp dụng ƯTL vào trồng trọt, chăn nuôi được phát triển nhanh chóng.

ƯTL của những cơ chế dị hợp tử biểu hiện ở tổ hợp lai trên các tính trạng đã được các nhà di truyền chọn giống chia làm 5 dạng biểu hiện chính:

- Ưu thế lai về hình thái

- Ưu thế lai về năng suất

- Ưu thế lai về tính thích ứng

- Ưu thế lai về tính chín sớm

- Ưu thế lai về sinh lý, sinh hóa

Đối với cây ngô, ƯTL về năng suất có vai trò quan trọng nhất, thể hiện qua sự tăng của các yếu tố cấu thành năng suất như chiều dài bắp, số hàng hạt, số hạt/hàng,

tỉ lệ hạt/cây… Theo Richey (1927) ƯTL về năng suất ở ngô với các giống lai đơn có thể đạt từ 193% đến 263% so với trung bình của bố mẹ (Trích dẫn theo Mai Xuân Triệu, 1998) Trong những năm gần đây, phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các dòng thuần dựa vào chỉ thị phân tử để phân nhóm cách biệt di truyền đã giảm bớt được khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, rút ngắn thời gian đánh giá Phương pháp này không phụ thuộc vào môi trường và mùa vụ, do đó tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức cho các nhà tạo giống

1.3.2 Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống

1.3.2.1 Đa dạng di truyền của cây ngô:

Sự đa dạng di truyền của cây ngô được thể hiện ở tất cả các tính trạng của cây, bông cờ và bắp Các nghiên cứu cho thấy: Ngô có mức độ sai khác về di truyền rất lớn trong cùng một quần thể hoặc các quần thể chéo nhau Các nghiên cứu ở mức độ phân tử cũng cho thấy mức độ đa dạng của ngô cao hơn 3-10 lần so với những loài thân thảo khác (Buckler và cs, 2001) [17] Các nhà chọn giống đã dựa vào sự đa dạng tự nhiên để lựa chọn các giống /loài tốt, từ đó cải tiến nhằm nâng cao chỉ tiêu

về số lượng và chất lượng và chất lượng của giống, ở ngô, năng suất hiện tại cao gấp

55 lần so với năng suất của các giống ngô tổ tiên (Buckler và cs,2001)[17]

1.3.2.2 Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống

Các nghiên cứu về hiện tượng ƯTL cho thấy sự khác biệt di truyền của bố và

mẹ có ảnh hưởng rất lớn tới sự biểu hiện ƯTL của các tổ hợp lai đơn, Shull G,H (1948) đã kết luận: ƯTL sinh lý của một cơ thể được biểu hiện qua sự phát triển nhanh, qua chiều cao và ƯTL có mối tương quan thuận với độ không giống nhau trong giao tử mà từ đó con lai được hình thành Sự khác nhau giữa giao tử càng nhiều thì sự biểu hiện ƯTL ở con lai càng lớn (trích theo Ngô Hữu Tình và cs, 1997) [7]

Cây ngô là loài cây giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng và dị hợp tử về kiểu gen, vì thế những thông tin về đa dạng di truyền của các nguồn gen là rất cần thiết và vô cùng hữu ích trong công tác đánh giá dòng, phân nhóm ƯTL và dự đoán

tổ hợp lai ưu tú có khả năng cho năng suất cao

Đa dạng di truyền có tầm quan trọng hết sức to lớn trong chọn tạo giống ngô, đặc biệt là cho chương trình tạo giống ngô lai Chính vì vậy, cây ngô đã được mô tả, thu thập và bảo tồn rất tốt ở các trung tâm đa dạng di truyền Ngày nay, có khoảng

15 000 mẫu giống ngô được thu thập từ các nước khác nhau trên thế giới (Ngô Hữư Tình và cs, 1997) [7] Ở Việt Nam, nguồn gen ngô được bảo tồn tại Viện nghiên cứu Ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự do; 3 000 dòng tự phối và được trồng ở khắp các vùng miền trong cả nước

1.3.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai

Nguyên tắc cơ bản trong công tác tạo giống cây trồng là việc xác định và khai thác các kiểu ƯTL giữa các nguồn vật liệu nghiên cứu (Hallauer và Miranda, 1988) [18] Đối với ngô, thông tin về đa dạng di truyền giữa các dòng sẽ giúp cho các nhà chọn tạo giống quyết định được kế hoạch lai tạo, cải tạo dòng và phân nhóm ƯTL Công tác này mang tính quyết định chủ yếu để dẫn đến sự thành công trong bất cứ chương trình chọn tạo giống ngô lai nào Chính vì thế mà các nhà chọn tạo giống ngô mong muốn mô tả được sự đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu trong và giữa các nhóm ƯTL và mối quan hệ di truyền giữa chúng (Messmer và cs, 1992) [20]

Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể được đánh giá thông qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thị hình thái như kiểu nội nhũ, chỉ thị phân tử như: chỉ thị isozyme và gần đây là chỉ thị DNA

Các chỉ thị phân tử DNA có thể được chia làm hai nhóm chính sau: chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP dựa vào các băng DNA trên gel điện di có thể phát hiện các thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử (Becker và cs, 1995) [16] và chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: RAPD, AFLP, SSR, STS…Trong những năm gần đây, nhiều chỉ thị thuộc nhóm này

đã thành công trong nghiên cứu đa dạng di truyền

* Chỉ thị RFLP (Restiction Fragment Lengh Polymorphism)

Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn) được sử dụng

rộng rãi trong đánh giá tính đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến hóa và phân loại các loài của nhiều nhóm thực vật và trong lập bản đồ di truyền Chỉ thị RFLP được sử dụng như là mẫu chuẩn để xác định sự có mặt hay thiếu vắng các đoạn nhiễm sắc thể nhất định Khả năng theo dõi quá trình di truyền các đoạn nhiễm sắc thể cho phép sử dụng kĩ thuật RFLP trong chọn tạo giống cây trồng (Lê Trần Bình

và cs, 1997)

Khả năng phân biệt của chỉ thị RFLP đã được nghiên cứu rộng rãi ở ngô, như

xác lập mối quan hệ với năng suất và UTL, đánh giá đa dạng di truyền Chỉ thị này không những phát hiện được những cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử mà còn phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn Vì thế mà phương pháp này còn được gọi là chỉ thị đồng trội Tuy nhiên, phương pháp này có quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, yêu cầu số lượng DNA lớn, chất lượng DNA cao, sử dụng chất phóng xạ gây nguy hiểm cho người Do đó xu hướng sử dụng các chỉ thị phân

tử đơn giản hơn trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR

* Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DAN)

Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân ngẫu nhiên Kỹ thuật này đã được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như lập bản đồ

di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác định giống cây trồng… Ở Việt Nam chỉ thị RAPD cũng đã được Ts.Bùi Mạnh Cường và cs (2000,2003) nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai

Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là quy trình phân tích đơn giản, nhanh, rẻ tiền và cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn, an toàn với người thực hiện, tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là mức độ phát hiện sự đa hình thấp

* Chỉ thị AFLP (Amplified Length Polymorphism)

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, DNA nhân được cắt bằng enzym giới hạn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, sau đó được gắn với các đoạn nucleotide ngắn (adapter) vào hai đầu nhờ enzym ligase Mồi của phản ứng được thiết kế trên trình tự của các đoạn adapter có gắn thêm các đoạn từ một vài nucleotide Kỹ thuật AFLP cho phép phát hiện được đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân chọn lọc Trên cây ngô chỉ thị AFLP được các nhà khoa học ứng dụng trong đánh giá mối quan hệ giữa đa hình phân tử với sự biểu hiện ở giống ngô lai (Ajmone-Marsan và cs,1998)

* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh là sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide đơn giản cực ngắn (chỉ từ 1-6 cặp base) Các SSR xuất hiện phổ biến trong bộ gen của sing vật nhân thực (Eukaryote) Tuy nhiên tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi

đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đợn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng trăm ngàn lần và nhiều hơn Phương thức lặp lại cũng rất phức tạp và đa dạng, chủ yếu có ba dạng sau: (1) lặp lại hoàn toàn; (2) lặp lại không hoàn toàn; (3) lặp lại phức tạp.

Kỹ thuật SSR cho phép chúng ta phát hiện được tính đa hình về độ dài các trật

tự nucleotide lặp lại đơn giản Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide Do sự khác nhau về số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số lần lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR khuếch đại sẽ được phân tách trong quá trình điện di

Trên đối tượng là cây ngô, các nhà khoa học cũng đã sử dụng chỉ thị SSR trong nhiều nghiên cứu khác nhau, Senior và Heun (1993) đã công bố, do sự biến đổi cao trong số đơn vị lặp lại nên chỉ thị SSR cung cấp mức độ đa hình cao ở ngô Kết quả

dự đoán của chỉ thị SSR nhanh, đáng tin cậy và có khả năng lặp lại, chuẩn xác và có hiệu quả hơn phân tích RFLP Phân tích SSR sử dụng gel agarose chất lượng cao rất hữu ích trong đánh giá đa dạng di truyền của các dòng tự phối ở ngô

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân

tử trên cây trồng được nhiều nhà khoa học đề cập, quan tâm nghiên cứu và đã thu được những kết quả khả quan như công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Liên và cs (2003) “Ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn dòng lúa chịu hạn” Một số tác giả đã có những công trình nghiên cứu đa dạng di truyền các nguồn vật liệu ngô bằng chỉ thị SSR phục vụ nghiên cứu về khả năng kết hợp và xác định cặp lai:

Nguyễn Thị Phương Đoài (2004)[6] đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 30 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau Kết quả xác định được khoảng cách di truyền của các dòng ngô nghiên cứu biến động từ 0,47-0,86 và được phân thành 3 nhóm ưu thế lai

Phan Xuân Hào và cs (2004)[11] đã sử dụng 41 mồi SSR để phân tích đa dạng

di truyền của 88 dòng ngô ( 51 dòng có nguồn gốc Việt Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT) Trong đó có 16 dòng QPM ( Quality Protein Maize), 6 dòng tham khảo từ AMBIONET Kết quả xác định được sơ đồ phả hệ giữa các dòng

nghên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ cấp.

Hiện nay sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở ngô đặc biệt là chỉ thị SSR đang được Viện Nghiên cứu Ngô tiếp tục nghiên cứu và phát triển Với những ưu điểm vượt trội và lớn mạnh của ngành CNSH, việc áp dụng phương pháp này là cần thiết để hỗ trợ phương pháp truyền thống trong công tác tạo giống ngô lai, góp phần nhanh chóng xác định được các tổ hợp ngô lai có ưu thế lai cao phục vụ sản xuất

1.3.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai cây ngô ở Việt Nam

Những năm trước đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng di truyền của các dòng ngô thuần và dự đoán ƯTL chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, …

Mai Xuân Triệu (1998) [4] đã sử dụng phương pháp phân tích nhóm của Mahalanobis để phân loại dòng thuần theo sự cách biệt về di truyền (phân loại dưới loài) của 24 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau của Viện nghiên cứu Ngô, Kết quả 24 dòng đã được phân thành 4 nhóm

Bùi Mạnh Cường và cs (2000) [1] đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD với 35 cặp mồi để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 7 dòng ngô đường tại Viện nghiên cứu Ngô Kết quả đã chia được 7 dòng ngô nghiên cứu thành 2 nhóm cách biệt di truyền

Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007) [10] đã sử dụng 36 mồi SSR để phân tích đa hình của 8 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau trong tập đoàn nguyên liệu của Viện nghiên cứu Ngô Kết quả khảo sát đánh giá các tổ hợp lai trên đồng ruộng và chỉ ra mối tương quan thuận giữa khoảng cách di truyền với năng suất của con lai F1 ở 8 dòng ngô nghiên cứu…

Gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền

và dự đoán ưu thế lai ở các đối tượng cây trồng nói chung và ở cây ngô nói riêng

đang ngày càng phát triển.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Gồm 20 dòng ngô thuần của Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô – Đan Phượng – Hà Nội

Bảng 2.1: Danh sách các dòng ngô nghiên cứu

Máy PCR 9700, máy quang phổ kế Ultrospec, máy chạy điện di gel agarose

và polyacrylamide, máy khuấy từ gia nhiệt, máy li tâm, máy đo pH, máy soi chụp gel, tủ lạnh sâu (-80 độ C), tủ lạnh, tủ đông, lò vi sóng… và các trang thiết bị khác

sử dụng trong nghiên cứu.

Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống eppendof, đầu côn các loại, lược gel, ống bơm gel…

- Hóa chất tách chiết DNA:

Bao gồm các loại hóa chất như EDTA, CTAB, chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Amino acetic

Đệm tách chiết DNA của mẫu lá: CTAB 2%( Tris-HCl 10mM, pH 8,0, EDTA 10mM, NaCl 100mM, beta-Mercatoethanol 0,5%,), TE( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0 )

- Hóa chất chạy phản ứng PCR:

+ Đệm PCR 1X( 10mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 5mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen

+ MgCl2 của Fementas, Invitrogen

+ dNTPs của Fementas, Invitrogen

+ Mồi: hệ thống mồi SSR dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi AMBIONET (bảng 2.2)

Bảng 2.2: Danh sách 20 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô

- Kiểm tra đánh giá độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử

- Dùng chỉ thị phân tử SSR đánh giá khoảng cách di truyền, và xây dựng sơ

đồ phả hệ của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng

- Hà Nội

- Xác định mức độ đa hình, phân nhóm ưu thế lai và dự đoán các tổ hợp lai

ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm

Tách DNA tổng số

Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, lấy lá non lúc cây được 3 – 4 lá Quy trình tách triết theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) [15].

- Kết tủa DNA với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate, đảo đều

ở -20°C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13,000 vòng/phút trong thời gian 10 phút

- Rửa tủa DNA trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút

- Làm khô DNA sau đó hòa tan DNA trong 100µl dung dịch TE và bảo quản

ở 20°C

• Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số

Độ tinh sạch và nồng độ của DNA tổng số được đo bằng máy đo quang phổ ( Ultrospec UV/Visible-65 spectrophotomrter)

Nồng độ DNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (µg/µl) =( OD260 x 50 x 50 µg/ml)/1000

Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 260

50 là hệ số pha loãng

50 µg/ml là hằng số

Tỷ lệ OD260/OD280 (OD280 là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 280nm) phản ánh

độ tinh sạch của mẫu Tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8-2,0 thì DNA được coi là sạch

• Chạy phản ứng PCR (PCR- Polymerase Chain Reaction):

Bảng 2.3: Thành phần của 1 phản ứng PCR

Chạy chương trình phản ứng PCR: phản ứng được tiến hành trong plate 96 giếng và chạy theo phương trình cụ thể

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Biến tính sản phẩm PCR và marker DNA có khối lượng chuẩn ( thang chuẩn

ФX174 DNA/HinfI, 20ŋg /µl) được biến tính ở 20°C trong 5 phút, sau đó ngay lập

tức làm lạnh và giữ lạnh cho đến khi tra mẫu vào bản gel

• Điện di sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR và thang chuẩn sau khi biến tính và sốc nhiệt trong đá lạnh được đưa vào chạy điện di trên gel polyacrylamide 4,5% và sau đó nhuộm bạc để biểu hiện sản phẩm điện di

- Sau khi điện di xong, cố định tấm kính bám gel bằng dung dịch cố định gel ( Glacial acetic acid 10%) trong 20 phút, lắc nhẹ

- Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cố định, rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5 phút

- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút, lắc nhẹ

- Bản gel được rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5-10 giây

- Đưa bản gel vào dung dịch hiện, lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất hiện, sau

đó đổ trực tiếp dung dịch cố định (đã dùng ở trên) lên trên bản gel để dừng phản ứng hiện, duy trì trong 4-6 phút

- Rửa sạch lại bằng nước cất hai lần và để bản gel khô ở nhiệt độ phòng

2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thống kê và xử lý theo hướng dẫn của AMBIONET – CIMMYT

(2004)[15] Dựa vào thang chuẩn phiX174/HinfI, số liệu được đọc theo quy ước:

các alen xuất hiện băng DNA (1), không xuất hiện băng (0),và khuyết số liệu (9) Kết quả được phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2,1

• Hệ số PIC (Polymorphic Information Content- Chỉ số thông tin đa

hình),

PIC = 1- ΣPi ; Trong đó : Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i

• Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi dòng ngô

Số mồi xuất hiện ≥ 2 alen/1 locus SSR

H% = x 100

Tổng số mồi sử dụng – số mồi khuyết số liệu

• Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) được tính cho từng dòng và từng mồi

Số mồi khuyết số liệuM% dòng = x 100

Tổng số mồi sử dụng

Số dòng khuyết số liệu

Tổng số dòng nghiên cứu

• Khoảng cách di truyền (GD)

GD = 1 – GSTrong đó: GD là khoảng cách di truyền

GS là độ tương đồng di truyền được tính theo hệ số

Jaccard( Lanza và cs, 1997)

• Phân nhóm bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Meyhod with Arithmetical Averages),

Bảng 3.1: Độ tinh sạch và nồng độ DNA của các dòng ngô

(OD 260 / OD 280 )

Nồng độ DNA (µg/,ml)

Ngoài ra chúng tôi còn tiến hành kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng

phương pháp điện di trên gel agarose 1% Kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.1

Hình 3.1:kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số

Hình 3.1 cho thấy các mẫu DNA đều xuất hiện một băng duy nhất, rõ nét, điều đó chứng tỏ DNA tách chiết đạt độ tinh sạch cao

Như vậy, sản phẩm tách chiết DNA tổng số của 20 dòng ngô nghiên cứu đáp ứng được yêu cầu về chất lượng và số lượng, đảm bảo đạt tiêu chuẩn để sử dụng cho các bước tiếp theo của thí nghiệm

3.2 Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền

Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của 20 dòng ngô tẻ, chúng tôi tiến hành sử dụng sản phẩm DNA tách chiết được trên làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với 20 mồi nghiên cứu Sản phẩm PCR của từng mồi được điện di trên gel acrylamide (điện di đứng)

3.2.1 Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô nghiên cứu

Theo hướng dẫn của AMBIONET- CIMMYT thì giá trị M% phải nhỏ hơn 15%