Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05

Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 Tuyển chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacillus các chủng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ

VIỆN NGHIÊN CUU VA PHAT TRIEN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TUYẾN CHON VA TOI UU HOA HIEU SUAT DONG TU CUA VI KHUAN BACILLUS CAC CHUNG

KG.05, ST.02, VL.01, VL.05

CAN BO HUGNG DAN GS TS CAO NGOC DIEP

SINH VIÊN THỰC HIỆN TRÀN NGỌC HÂN MSSV: 3112462 LỚP: CNSH K37

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ

VIEN NGHIEN CUU VA PHAT TRIEN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUAN VAN TOT NGHIEP NGANH CONG NGHE SINH HOC

TUYEN CHON VA TOI UU HOA HIEU SUAT DONG TU CUA VI KHUAN BACILLUS CAC CHUNG

KG.05, ST.02, VL.01, VL.05

CAN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

GS TS CAO NGỌC ĐIỆP TRAN NGỌC HÂN

MSSV: 3112462 LỚP: CNSH K37

Trang 3

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

Cao Ngọc Điệp Trần Ngọc Hân

DUYỆT CỦA HỘI ĐÒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cân Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG

Trang 4

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy tôi trong thời gian học tập vừa qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy GS.TS Cao Ngọc Điệp - người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành tốt luận văn

Xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Liên - cố vấn học tập, người đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi khi vừa bước chân vào giảng đường đại học

Chân thành cám ơn anh Hồ Thanh Tâm, anh Trần Hoài Phong và chị Trần Thị Giang, các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ, tận tình chỉ day, diu dat và giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 37, các anh chị, các em trong

Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ về kiến thức cũng như

tỉnh thần để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã khích lệ và luôn ủng hộ tôi để tơi vững tin hồn thành tốt khóa học của mình

Kính chúc quý Thầy Cô luôn đổi dào sức khỏe để tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp trồng người

Trang 5

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Can Tho

TÓM LƯỢC

Đề tài “Tuyến chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vì khuẩn Bacillus các

ching KG.05, ST.02, VL.0I, VL.05.” được thực hiện với mục tiêu tuyển chon cap vi

khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất từ các chủng Bacillus cereus KG.05; Bacillus

megaterium VL.01; Bacillus aryabhattai ST.02; Bacillus sp VL.O5 duoc phan lap tir nước thai chan nuôi heo sau biogas, va toi wu hoa hiéu suất dong tu cua cap vi khuẩn

được chọn với điều kiện trong phòng thí nghiệm Bốn chủng vi khuẩn được tổ hợp

thành 6 cặp vi khuẩn: KG.05-VL.05; KG.05-VL.01; KG.05-ST.02; VL.01-VL.05; VL.01-

ST.02; VL.O5-ST.02 Ba cap vi khuẩn có hiệu suất dong tụ cao nhất tại mốc thời gian

đông tụ 6 giờ: KG.05-VL.05 (77,42%); KG.05-VL.0I (88,23%); VL.01-VL.05 (81,73%)

Khi kiếm tra hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuẩn này ở 7 mức giá trị của pH: 3; 4; 5; 6;

7; 8; 9 kết quả là tại pH = 7, ba cặp vi khuẩn đạt hiệu suất đồng tụ cao (73-76,13%),

khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99% so với hiệu suất đông tụ ở các giá trị pH còn lại

Các cation: Ca”, Mẹ”, KỲ, Na” với 6 néng dé: 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM,

60 mM của các muối tương ứng CaCl;, MgCl;, KCI, NaCl được sử dụng để kiểm tra

ảnh hưởng của chúng lên hiệu suất đông tụ; kết quả chọn được cặp cafion KỲ ở nông d6 30 mM KCI; Mẹg” ở nông d6 20 mM MgCl, tối ưu cho hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 Cuối cùng, thí nghiệm tương tác giữa các yếu tô pH, thời gian đồng tụ, loại calion tương ứng với các nông độ muối lên hiệu suất dong tu cua cap vi khuẩn Bacillus cereus KG.05 va Bacillus megaterium VL.O1 duoc thuc hién Két quả hiệu suất

đông tụ đạt cao nhất là 73,2% ở pH = 7; thời gian đông tụ là 6 giờ; với sự tác động

của cắp cation K ở nông độ 30 mM KCI; Mg”* ở nông độ 20 mM MgCh

Trang 6

MỤC LỤC TÓM LƯỢC 2 2-SS2EE2EE2E11221527112110211121121112112211211E T1 .1E 1.1.1 1e Eeeye i MUC LUC M0) Ye28:)0 100 v M9) E7 Y0:8:79 cm Ô vi

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮTT . -.2¿-22++22V2+++22EE+++2E2EEE+2222E2E222EErrrrkrrrrer vii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU . .2 22¿222+22ESE2SEEE22EEE+2EEEEE2EAE222EE2EEErrrkrrrrk 1 LoL Dat VAI G8 ooo eecccccccccssessssssssccssstssssssiseessstsssssissssssissesssissssassueesssssesssssneeessseeeesseee 1

ng co nẽn ` 1

CHUONG 2 LUGC KHAO TAI LIBU uieeeccescesccssessesssessessesssessscsecssvesusssessussesssssueseesaes 2 2.1 Tinh chất nước thải chan nuGi heO ccccccsssseessssssessssssecsssssescessseceessseesessseeeessee 2

2.1.1 Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xw ly biogas eee 2 2.1.2 Nước thải chăn nuôi heo sau DIOgØaS -ó- «c cS**tEsSeksEskeerskree 3

2.3 Một số yêu tố môi trường ảnh hưởng đến vi sinh vật

2.3.1 Chất dinh đưỡng -.-.¿-22-©2++t22Ex222112221112711122112222112212 2111 ce 5

2.3.2 Ảnh hưởng của pH - ¿2 ©+©2++E122E12215271122111711211211 211.221 5

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 2¿-22222++222++rtEEEkErrtrrkrrrrrrrrrrrrrrree 5

2.3.4 Ảnh của áp suất thẩm thấu -2-©++2E++2+EEE+2EELE2E12221xErkcee 5 2.4 Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải ¿ - 552 <+s+s+sssexss+ 6 “N0 in 0a e 6 2.4.2 Mang sinh hoc 2.5 SU GONG tu eee ceseeseneeseesseseeceesecseeeeeeseesseeeeeeeseseceeeesseesceeeeseeesaceeeeeesaeeentees 7 2.5.1 Khai MGM 7

2.5.2 Cơ chế của sự đơng tỤ :2-+2+2221222122711122112221122212 211.2 §

2.5.3 Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống xử lý nước thải -. 10

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1

Trang 7

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Can Tho E1 /( 0 11 3.2.2 Dung cụ và thiết bi 3.2.3 Hóa chất -::-+22222.L HH 2kg 1

3.3 Phương pháp nghiÊn CỨUu óc St t1 E111 11k TT TH TH nh HT tt, 12 3.3.1 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn -z2252cz+c++ 12

3.3.2 Phương pháp tính hiệu suất đơng tụ -. -¿©cc¿+22+z+ccxcsccsee 12 3.4 Tiến hành thí nghiệm . 2- 2£ ©+2+2E+£t2EE+tEE112211122111271127112 2221.212 12

3.4.1 Thí nghiệm 1: xác định cặp vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ CAO nhất 22:22 222222 22221112221111222111122211122111112211111221111122111112.17112.1711 E111 crrre 12

3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ 14

3.4.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của cdc cation Ca**, Mg”, K”, Na?

đến hiệu suất GONG 0 a3 15

3.4.3.1 Ảnh hưởng nồng độ muối của từng loại cation đến hiệu suất đông tụ L5

3.4.3.2 Ảnh hưởng của các cặp cation (cation hóa trị I + cation hóa trị II) đến

hiệu suất đông tụ

3.4.4 Thí nghiệm 4: khảo sát tính tương quan của yếu tố pH và cation ảnh

hưởng lên hiệu suất đơng tụ 22 ©+<22+2SEEE22E212222151271127111221122112 211 17 3.5 Phương pháp phân tích số liệu ¿-¿¿©+++22++++2E++tEESe+rxeesrxxrsrrxee 17 CHƯƠNG 4 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . -22-©22222+<c22EEttEEEtrEkerrrreree 18

4.1 Cặp vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất - - 18 4.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ

CU eee eee ene enn Eee E EEE EEE Een EEE EE Eden E dene Ea ented eRe Ea ented teeta ee ea eeeE 22

4.3.1 Anh hung nong d6 ctta NaC] o ceccccssseessssessssessssseesssessssesssseessseessssessseess 22

4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ của KCI -¿- -¿-©+++22++22x+2tExetrxerrrreree 23 4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ của CaC]; 2£ ©+<+22++t2EEE2E2EEetEExerrrrrree 24

4.3.4 Ảnh hưởng nồng độ của MgC|; -2-©22+22+z22EEeS2EEeEELerrrkrree 25

4.4 Cặp cation tối ưu cho hiệu suất đông tụ chớ 27 4.5 Mối tương quan giữa pH và nồng độ muối của các cation - 28

Trang 9

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Vi khuẩn Baciilus sau khi nhuộm Gram 2- 2 s£S£E2EE££Et2E2Exerxe2 3 Hình 2 Hệ vi sinh vật trong màng sinh hỌc -¿- c6 6xx + #kEkkstekerkrererrkree 7 Hình 3 Sự đông tụ giữa các chủng vi khuẩn -2-©22+22+z2Exzerkeerrreeerres 7

Hình 4 Vi khuẩn chủng Ð megaferium VL.0I (A) và B cereus KG.05 (B) 8

Hình 5 Sự đông tụ nhờ roi trên bề mặt tế bào vi khuẩn -¿-ccc+ccesrxecrs 9 Hình 6 Hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn qua 5 thời điểm 18

Hình 7 Hiệu suất đông tụ ở 7 giá trị pH của các cặp vi khuẩn - - 20

Hình § Ảnh hưởng nồng độ của NaCl đến hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn 22

Hình 9 Ảnh hưởng nồng độ của KCI đến hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn 23

Hình 10 Ảnh hưởng nồng độ của CaCl; đến hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn 24

Hình 11 Ảnh hướng nồng độ của MgC1; đến hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn 25

Hình 12 Ảnh hưởng của các cặp cation lên hiệu suất đông tụ - 27

Trang 10

DANH SÁCH BẢNG

Bang 1 Tính chất nước thải chăn nuôi heo - ¿©2522 252222S++22Ex+svzxersrxeree 2 Bảng 2 Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải chăn nuôi gia súc 3 Bảng 3 Một số vi khuân có khả năng đơng tụ -.2:©252¿2255+22Sxcsccxersrxecee 8

Bảng 4 Tối ưu hóa hiệu suất đông tụ (%) của cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 29

Trang 11

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Can Tho BOD COD EDTA EGTA EPS LPS OD¢60 ODo ODs QCVN TSS

DANH SACH TU VIET TAT

Biochemical Oxygen Demand Chemical Oxygen Demand

Ethylene Diamine Tetra Acetic acid Ethylene Glycol Tra Acetic acid Exopolysaccharide

Lipopolysaccharide

D6 hap thụ quang ở bước sóng 660 nm

D6 hap thụ quang ở bước sóng 660 nm trước ly tam Độ hấp thụ quang ở bước sóng 660 nm sau ly tâm Quy chuẩn Việt Nam

Total Suspended Solids

Trang 12

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, chăn nuôi heo là một nghề đã có từ lâu, đến ngày nay nó được mở rộng với quy mô lớn tại các cơ sở chăn nuôi heo, đo nhu cầu tiêu thụ thịt ngày càng tăng Bên cạnh đó là sự phát sinh lượng nước thải lớn làm ô nhiễm môi trường Vấn đề

này được khắc phục bằng nhiều biện pháp: sinh học, hóa lý, cơ học, .Trong đó biện

pháp sinh học được sử dụng rộng rãi do có nhiều ưu điểm: an toàn, đễ thực hiện, giá thành rẻ, Đặc biệt là biện pháp ủ yếm khí (biogas) được nhiều người áp dụng, ngoài việc cải thiện tình trang 6 nhiễm còn có thể thu khí metan làm nhiên liệu Những lợi ích do ủ biogas đem lại là không thể phủ nhận, tuy nhiên các chỉ tiêu ô nhiễm vẫn còn ở mức khá cao, vì thế việc tiếp tục xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas là cần thiết

Sự kết tụ nhờ vi sinh vat (microbial flocculants) trong hệ thống bùn hoạt tinh, màng sinh học tỏ ra có hiệu quả khi được đưa vào các quy trình làm sạch nước thải, trong đó có chăn nuôi heo sau biogas, bằng cách tổng hợp các chất kết tụ sinh học (bioflocculants) làm lắng tụ vật chất lơ lửng có kích thước nhỏ Nhưng theo nhiều nghiên cứu gần đây các chủng vi khuẩn chiếm ưu thế lại không có khá năng kết tụ (ÑNon-flocculation bacteria), chúng có một cơ chế riêng ít được nói đến, trong đó quần thé vi khuẩn có khả năng đông tụ (Aggregation) lại có tỉ lệ cao, chúng cũng tham gia

vào quá trình lắng động, kết dính các vật chất có kích thước nhỏ, khó xử lý vì thế giữ vai trò

quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học, bùn sinh học (Malik et al., 2003) Đề tài “Tuyến chọn và tối ưu hóa hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Bacilius các

chúng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05” được thực hiện dé xác định các điều kiện tối ưu

tạo sự đông tụ của chung vi khuẩn cho hiệu suất đông tụ cao nhất, là tiền đề cho những nghiên cứu kế tiếp trong xử lý nước thải chăn nuôi heo một cách có hiệu quả

1.2 Mục tiêu của đề tài

Chọn cặp vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất từ 4 chủng B cereus KG.05; B megaterium VL.O1; Bacillus sp VL.05; B aryabhattai ST.02 được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau biogas, và xác định điều kiện tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ đạt được cao nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm

Trang 13

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tính chất nước thải chăn nuôi heo

2.1.1 Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xử lý biogas

Nước thải chăn nuôi heo bao gồm: nước vệ sinh vật nuôi, chuồng trại chứa phân, nước tiêu, thức ăn thừa chúng là tác nhân gây ra ô nhiễm môi trường do chứa nhiều các chất lơ lửng, hợp chất hữu cơ, hàm lượng N, P khá cao ngoài ra còn có coliform, trứng giun sán; là môi trường thuận lợi cho nhiều vi sinh vật gây bệnh phát triển, đặc biệt là sự biến thể của các virus làm bùng phát các dịch bệnh: lở mồm long móng, tai xanh trên heo, ảnh hưởng lớn đến nền kinh tế, sức khỏe con người và vật nuôi

Bảng 1 Tính chất nước thải chăn nuôi heo Thông số Đơn vị Giá trị pH 7,23-8,07 COD mg/l 2561-5028 BOD mg/l 1664-3268 TSS mg/l 1700-3218 N_NH; mg/l 304-471 N Tổng mg/l 512-594 P_Téng mg/l 13-62

(*Nguôn: hup:/moitruonghaidang.com/cong-nghe-xu-ly-nuoc-thai-chan-nuoi-heo, ngdy 7/1/2014)

Theo Từ Thụy Hạnh (2013), trong thành phan chất rắn của nước thải, chất hữu cơ

chiếm 70-80% gồm các chất hydrocacbon, acid amin chất béo và các dẫn xuất của chúng có trong phân và thức ăn thừa Chất vô cơ chiếm 20-30% gồm cát, đất, muối

clorua, SO/Z đặc biệt là hàm lượng đạm trong nước thải rất cao do hệ tiêu hóa của

gia súc có khả năng hấp thu kém thành phần nitơ Chỉ có 30% lượng nitơ đưa vào cơ

thể vật nuôi chuyển hóa thành sản phẩm, 70% còn lại bị bài tiết ra ngoài dưới dạng NH**, NOx, NO; (Jongbloes va Lenis, 1992) Lân là thành phần tương đối ít, chiếm

0,25-1,4% trong thức ăn thừa và một ít trong nước tiểu của heo tồn tại chủ yếu ở

dạng HPO,”, HạPO¿, PO¿”, và photphate hữu co

Trang 14

2.1.2 Nước thải chăn nuôi heo sau biogas

Sau khi qua xử lý bằng cách ủ biogas, các chất hữu cơ có trong nước thải chăn nuôi heo được chuyên hóa có hiệu quả: COD giảm 76,3%; SS giảm 86,1% và 51,2% vi sinh vật gây bệnh bị tiêu diệt; nhưng các chất dinh dưỡng (N, P) được xử lý chỉ một phần: N giảm 11,8%; P giảm 7,0% (Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu, 2012)

Nước thải sau khi qua xử lý biogas, nếu thải trực tiếp ra ngồi mơi trường sẽ ảnh hưởng đến hệ sinh thái tự nhiên, do hàm lượng các chất ô nhiễm vẫn chưa đạt các chỉ tiêu an toàn cho phép, nhất là các thành phần dinh dưỡng còn ở mức cao, cần được tiếp tục xử lý trước khi thải vào môi trường

Bảng 2 Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải chăn nuôi gia súc Giới hạn tố đa Tên chỉ tiêu Don vi tinh A B pH 6-9 5,5-9 COD mg/l 50 100 BOD mg/l 30 50 TSS mg/l 50 100 N_NH3 mg/l 5 10 N Tổng mg/l 15 30 P_Téng mg/l 4 6 (*Nguén: QCQG 01-79:2011/BNNPTNT) 2.2 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus SY ee a: „ Hm.à”.- ếs+ — ea

Hinh 1 Vi khuan Bacillus sau khi nhu6m Gram

(*Nguon: hitp:/Nib.jiangnan.edu.cn/asm/115-introduce.him, ngày 20/2/2014)

Trang 15

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Can Tho Phân loại Giới: Bacteria Nganh: Firmicutes Lop: Bacilli Bo: Bacillaceae Ho: Bacillaceae Chi: Bacillus

(*Nguon: http://en.wikipedia.orghviki/Bacillus, ngdy 31/12/2013)

Bacillus 1a mét chỉ vi khuẩn Gram dương có hình que, tạo bảo tử, hiếu khí hoặc

yém khi Bacillus duoc tìm thấy ở nhiều môi trường với nhiều chủng loài khác nhau và

được ứng dụng nhiều trong cuộc sống, có tác động đáng kể đến hoạt động của con người trên nhiều lĩnh vực: từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm,

xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi kim loại nặng, sản xuất chế phẩm sinh học, nhiên

liệu sinh hoc cu thé 1a, B thuringiensis duge su dung rong rai để tiêu diệt côn trùng có hai, B subtilis 1a chung san xuat một loạt các peptide có hoạt tính sinh học cao (Shalini et al., 2009) Theo nghiên cứu cua Singh et al (2013), B.subtilis NG220 duoc ứng dụng để xử lý nước thải của các nhà máy sản xuất đường một cách hiệu qua, đồng thời tạo ra poly /Ø-hydroxybutyrate là thành phần tổng hợp nhựa phân hủy sinh hoc B aferrimus, B megaterium, B nato, B panis, B pumilis giúp cải thiện môi trường, kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh, tăng cường miễn địch cho các loài thủy sinh trong nuôi trồng thủy sản

Bacillus có thể sống riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi Do có bao tir

nên chúng có thể kháng lại các điều kiện bất lợi của môi trường rất có hiệu quả: chúng

có thể sống trong môi trường có pH biến động cao, có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng áp suất cao Đặc biệt vi khuẩn Bacillus còn có bao nhay được cấu tạo từ các polypeptide đóng vai trò dự trữ thức ăn, bảo vệ vi khuẩn khỏi các điều kiện bất

lợi (Trần Thị Thu Hiền, 2012)

Các vi khuẩn thuộc chỉ Bacillus dễ nuôi cấy, thường mọc tốt trên môi trường có

nguồn cacbon là đường, acid hữu cơ, rượu với nguồn nitơ duy nhất là ammonium, ngoài ra còn có một số dạng phân lập cần vitamin để tăng trưởng Môi trường sống

Trang 16

chủ yếu của Bacillus 1a dat, nuéc va bun (Green et al., 1999) 2.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hướng đến vi sinh vat

2.3.1 Chất dinh dưỡng

Các nguyên tố cần thiết chính cho sự tăng trưởng của vi sinh vật bao gồm C, H, O,N, S, P, K, Mg, Ca cùng các nguyên tố vi lượng có trong nước, các ion vô cơ, những phân tử nhỏ hay các đại phân tử Trong đó calcium là thành phần cấu tạo tế bào vi khuẩn, cần cho chức năng của enzyme và sự chống chiệu nhiệt độ cao Magnesium cần cho chức năng của enzyme và giúp cho màng tế bào bềnh vững (Cao Ngọc Điệp

và Nguyễn Hữu Hiệp, 201 1)

2.3.2 Ánh hưởng của pH

PH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật Mỗi vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất Mặc dù vi sinh vật thường có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH khá rộng và xa với pH tốt nhất của chúng, nhưng tính chịu đựng của chúng cũng có giới hạn nhất định Sự biến đổi pH của môi trường sẽ làm thay đối trạng thái điện ly của phân tử các chất dinh dưỡng cũng như thay đổi tính thắm trên màng của các vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng

et al., 2012)

2.3.3 Ánh hướng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và tồn tại của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ có hai tác dụng lên vi sinh vật: khi nhiệt độ môi trường tăng vận tốc phản ứng hóa học hay phản ứng có enzyme xúc tác gia tăng làm cho cường độ của vi sinh vật tăng theo Đồng thời khi nhiệt độ gia tăng làm các protein,

acid nhân và các thành phần khác rất dễ bị thay đổi bản chất vì vậy ảnh hưởng đến

các hoạt động, thậm chí là sự sinh tồn của các tế bào vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và

Nguyễn Hữu Hiệp, 201 1)

2.3.4 Ảnh của áp suất thắm thấu

Màng tế bào chất của vi khuẩn là bán thấm đo các hiện tượng thẩm thấu và

việc điều chỉnh thâm áp qua các hệ thồng permeaza đều có liên quan đến màng này Trong môi trường ưu trương tế bào bị co nguyên sinh và có thể bị chết nếu thời gian kéo dài Trong môi trường nhược trương do có thành tế bào vững chắc nên nước từ môi trường đi truyền vào bên trong tế bào khó gây ra hiện vỡ sinh chất như

Trang 17

ở tế bào thực vật (Nguyễn Lân Dũng et al., 2012) 2.4 Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải

Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là phương pháp sử dụng khả năng sống và hoạt động của vi sinh vật để khoáng hóa các chất hữu cơ có trong nước thải thành các chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước Các vi sinh vật tồn tại trong môi

trường thực hiện quá trình trao đổi chất để tăng sinh khối, tạo sản phẩm cần thiết cho

nhu cầu sinh hoá của tế bào Vi sinh vật phân hủy các chat có trong nước thải, thường có hai kiểu sinh trưởng: sinh trưởng lơ lửng (bùn hoạt tính) và sinh trưởng dính bám (màng sinh học)

2.4.1 Bùn hoạt tính

Bùn hoạt tính bao gồm những vi sinh vật sống kết lại thành dạng hạt hoặc dạng

bông với trung tâm là các chất rắn lơ lửng chiếm 40% Các hạt bông bùn này khi được

khuấy đáo và thối khí sẽ dần dần lớn lên do tiếp tục hấp phụ nhiều hạt rắn nhỏ, tế bào vi sinh vật, nguyên sinh động vật (Nguyễn Văn Phước, 2007) Trong quá trình hình thành bùn hoạt tính các vi sinh vật có trong bùn sử dụng các chất đinh đưỡng, chất hữu cơ có trong nước thải làm nguồn thức ăn để tổng hợp năng lượng và các thành phần cấu tạo nên tế bào mới Những hạt bông bùn sẽ lắng xuống đáy khi chúng đủ lớn hoặc ngừng các hoạt động thổi khí, khuấy trộn Sau đó, vi sinh vật yếm khí đưới đáy bùn tiếp tục quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ này

2.4.2 Màng sinh học

Màng sinh học là tập hợp nhiều dòng vi khuẩn khác nhau, có hoạt tính oxy hóa các chất hữu cơ khi chúng tiếp xúc với màng Màng sinh học thường có các kênh thông nhau như một hệ thống tuần hoàn giúp cộng đồng vi khuẩn có thể loại thải các chất độc hại cũng như tiết và hấp thu các sản phẩm trao đổi chất, trao đổi vật liệu di truyền, sản xuất các phân tử tín hiệu như peptide hoặc đựa vào cấu trúc bề mặt như tính ky nước, roi, fimbriae, độ bám dính không đặc hiệu giữa các loài vi khuẩn, phối hợp các hoạt động trong quá trình sinh trưởng và phát triển để có thể duy trì tính toàn vẹn của cộng đồng đa loài màng sinh hoc (Costerton et al., 1995)

Các thành phần trong màng sinh học khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố,

thông thường thành phần chính là nước và vi khuẩn, tiếp theo là exopolysaccharides là rào cản vật lý giúp chóng lại các điều kiện bất lợi từ môi trường như: sự khô hạn,

Trang 18

tia tử ngoại, sự thay đổi của pH, các chất độc, (Sutherland et al., 2001)

Hình 2 Hé vi sinh vat trong mang sinh học

(*Nguôn: hup:/microwavesscience.blogspot.com/, ngày 6/1/2014)

2.5 Sự đông tụ 2.5.1 Khái niệm

- Sự đông tụ được định nghĩa là sự nhận biết và kết dính của các tế bảo vi khuẩn

với nhau Khác với sự kết tụ, sự đông tụ chỉ xảy ra ở các tế bào vi khuẩn nhất định

(Rickard et al, 2002) Sự đông tụ được phân biệt thành sự tự đông tụ (autoaggregation) và sự đồng đông tụ (coautoagsregation)

- Sự tự đông tụ là sự nhận biết và kết dính của các tế bào vi khuẩn giống nhau về mặt đi truyền

- Sự đồng đông tụ là sự nhận biết và kết dính của các tế bào vi khuẩn khác nhau về mat di truyén (Kolenbrander va Anderson, 1989) Lan dau tién duoc Gibbons va Nygaard (1970) phát hiện ở vi khuẩn gây ra mảng bám trên răng Kế từ đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự đồng đông tụ xảy ra giữa các loài vi khuẩn cụ thé trong những môi trường khác nhau: diều của gà, đường tiết niệu ở phụ nữ, ruột người,

trong nước ngọt,

nước thải (Min và Rickard, 2009)

Hình 3 Sự đông tụ giữa các chúng vi khuẩn

(*Nguôn: Kimehhayarasy et al., 2009)

Trang 19

Hình 4 Vi khuẩn ching B megaterium VL.01 (A) va B cereus KG.05 (B) (*Nguôn: Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2013)

Bảng 3 Một số vi khuẩn có khả năng đông tụ

Vi khuẩn có khả năng đông tụ Tac gia

Flavobacterium spp Sakka et al (1981) Pseudomonas spp Sakka et al (1981) Lactobacillus Vandevoorde et al (1992)

Acinetobacter johnsonii S35 Malik và Kakii (2003)

A junii $33 Malik va Kakii (2003)

Bacillus cereus Kimchhayarasy et al (2009) Blastomonas natatoria Kimchhayarasy et al (2009) Mycobacterium sp Kimchhayarasy et al (2009) Thermomonas Kimchhayarasy et al (2009) Enterobacteriaceae Kimchhayarasy et al (2009)

Sphingomonas natatoria 2.1gfp Min va Rickad (2009) Micrococcus luteus 2.13 Min va Rickad (2009)

2.5.2 Cơ chế của sự đông tụ

Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính ky nước của bề mặt tế bào và các thành phần cấu tạo tham gia vào các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau

Sự đông tụ xảy ra là kết quả sự hình thành của các exopolysaccharides (EPSs),

một polyme được tiết ra từ các tế bào vi khuẩn, đóng một vai trò quan trọng để hấp phụ và là cầu nối giữa các bề mặt tế bào vi khuẩn (Tenney và Stumm, 1965)

Trang 20

Một số vi khuẩn Gram dương trên bề mặt ngoài còn có lipopolysaccharide (LPS) Một LPS gồm có ba thành phần: lipid A, oligosaccharides và O-kháng nguyên Thường cấu trúc O-kháng nguyên không đồng nhất trong các LPSs giúp tế bảo vi khuẩn có thê thích nghỉ trong các trường hợp môi trường có biến động Cấu trúc của

LPS bij biến đổi sẽ ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn thông qua

làm thay đổi tính ky nước của bề mặt tế bào (Sutherland et al., 2001) Dé làm rõ hơn vấn đề này, một nghiên cứu của Kimchhayarasy et al., (2009) được tiến hành Ông

gây đột biến dòng A johnsonii S35 có bề mặt gồ ghề hiệu suất đông tụ 88% bằng cách

cấy chuyển nhiều lần; kết quả kiểm tra hiệu suất đông tụ chỉ còn 20%, gần như mắt khả năng đông tụ, và đặc điểm bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát có sự thay đổi từ lồi lõm thành bề mặt tế bào tương đối nhẫn hơn

Bên cạnh đó, sự hình thành của các roi-một loại protein ngoại bào đóng một vai trò quang trong trong quá trình kết dính, đông tụ của hai chủng vi khuẩn SI và AH (Chen, 2007)

Hình 5 Sự đông tụ nhờ roi trên bề mặt tế bào vi khuẩn (*Nguén: Chen, 2007)

Su kết dính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại lectin

trên tế bào này với một oligosaccharide trên tế bào kia Sự đông tụ ngừng lại nếu

protein lectin bị biến tính do nhiệt độ hoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose, galactose, hoặc các đường đơn khác), chúng liên kết với protein lectin khóa hoạt động của protein này (Kolenbrander and Anderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al, 1997) Đề làm rõ vai trò liên kết protein lectin-oligosaccharide, các tế bào vi khuẩn có khả năng đông tụ được xử lý với actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với periodate dé cắt cầu nối carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ (Malik et al., 2003)

Trang 21

2.5.3 Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống xử lý nước thải

Trong thí nghiệm của Malike et al (2003) có 52 dòng vi khuẩn được phân lập từ

bùn hoạt tính trong đó các dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ chiếm 31%, 11% là các

dòng vi khuẩn bị lắng tụ còn lại 58% là các dòng vi khuẩn không có khả năng kết tụ Trong nhiều nghiên cứu khác các dòng vi khuẩn này cũng chiếm một tỉ lệ cao và trước đây chúng bị xem là một trong các nguyên nhân gây đục nước vì thế chúng ít được đề

cập đến Nhưng về sau, nhiều nghiên cứu chứng minh chúng giữ một vai trò quan

trọng trong quá trình làm sạch nước trong các hệ thống bùn hoạt tính và màng sinh học nhờ vào khả năng đông tụ

Sự đông tụ, két dinh (Adherence) và lắng (Settlement) là các quá trình quan trọng

trong vận hành bùn hoạt tính Sự đông tụ và kết đính được biết là quá trình kết tụ sinh

học (Biofloculation), lắng xuống tạo thành bùn Các quá trình được vận hành một cách tuần hoản Vì vậy, quá trình bùn hoạt tính hoạt động hiệu quả phải đảm bảo các hạt bùn được lắng tốt Sự đông tụ và lắng tốt quyết định độ sạch và trong của nước sau xử lý Tuy nhiên, quá trình bùn hoạt tính thường gặp nhiều sự có như sự phát triển quá nhiều của vi khuẩn dạng sợi hoặc bùn kém chất lượng như bùn lắng kém hay bùn tạo khối (Kimchhayarasy et al., 2009)

Nhiều nghiên cứu về sự đông tụ của vi sinh vật trong các hệ thống sinh học đã cho thấy vai trò sự đông tụ là yếu tố cần thiết cho sự hình thành màng sinh học (Saginur et al., 2006) Sự đông tụ góp phần tham gia vào quá trình hình thành và phát triển màng sinh học, bước đầu tiên là sự kết dính của tế bào đơn trong môi trường đến

bề mặt vật liệu Sau đó chủ yếu là sự đông tụ, từ các tế bào đơn lẻ hoặc từ một nhóm

các tế bào khác nhau hoặc một nhóm các tế bào giống nhau về mặt đi truyền sẽ kết dính

với những tế bào kết dính với bề mặt vật liệu trước đó Quá trình này được tiếp diễn và

tạo thành màng sinh học đa chủng vi sinh vật Min và Rickard (2009) đã chứng minh rằng sự đông tụ tăng cường độ bám dính giữa các màng sinh học nước ngọt phù du, vi khuẩn và nó có khả năng đóng góp vào sự phát triển của màng sinh học trong môi trường tĩnh hay chảy

Trang 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện từ 7/2013 - 12/2013 tại phòng vi sinh vật môi trường và vi

sinh vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học

Cần Thơ

3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu

Bốn chúng vi khuan Bacillus cereus KG.05; Bacillus megaterium VL.O1; Bacillus

sp VL.05; Bacillus aryabhattai ST.02 (Hé Thanh Tam va Cao Ngoc Diép, 2013) được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: cốc 250 ml, 1000 ml; ống đong 10 ml, 25 ml, 200 ml; tube eppendorf 2 ml; bình tam giác 150 ml, 250 ml, 500 ml; micropipette: 10 4l, 200 pl, 1000 pl; dau cone xanh, vàng; ống falcon 50 ml

- Thiết bị: máy khuấy từ; máy microwave; pH kế Orion 420A; máy vortex IKA;

cân điện tử Sartorius; tủ say EHRET; tu u vi sinh vat Incucell 111; may lac GFL 3005;

Trang 23

Môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn đông tụ được pha bằng cách thêm vào môi trường polypepton lỏng 20 g agar trong l lít nước cất (Kimchhayarasy et al., 2009)

- Muối sử dụng trong kiểm tra cation: CaC];, MgsCl;, NaCl, KCI

- Dung dịch chuẩn pH: acid acetic, NaOH 3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn

- 50 ml môi trường polypepton đặc sau khi microwave được chế vào các ống thạch nghiêng và được khử trùng trong nồi nhiệt ướt ở 121°C trong 15 phút

- Khuẩn lạc đã ròng từ ống thạch nghiêng đang trữ trong tủ lạnh được chuyền sang ống thạch nghiêng mới bằng que cấy và ủ trong tủ ủ ở 30°C trong 2 ngày

- Mỗi ống thạch nghiêng được thêm vào I ml nước cất, lắc đều 100 wl dịch huyền phù vi khuẩn được hút cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 mi môi trường polypepton lỏng (môi trường đã được khử trùng trong nỗi khử trùng nhiệt ướt ở 121°C trong 15 phút) và đặt trên máy lắc có tốc độ quay 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C trong

24 giờ - thời gian sự tự đông tụ đạt tối ưu (Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2013)

3.3.2 Phương pháp tính hiệu suất đông tụ

Sử dụng phương pháp của kimchchayarasy et al (2009) đo quang phổ kế ở bước sóng 660 nm (ODạø) trước và sau ly tâm 700 vòng/phút trong 2 phút đề tính khả năng

đông tụ của các cặp vi Chỉ số đo ODạøo trước ly tâm (OD) là để xác định mật số vi

khuẩn trong dung dịch, trong đó có sự hiện diện đồng thời của các tế bào vi khuẩn đã đông tụ và tế bảo chưa tham gia vào đông tụ Chỉ số đo ODssg của phần trên dung dịch sau ly tam (ODs) là mật số tế bào vi khuẩn chưa đông tụ

Hiệu suất đông tụ = ODo~ ODS 100 (%) ODo

*Ghi chú: ODụ là d6 hap thụ quang ở bước sóng 660 nm trước ly tâm ODs la độ hắp thụ quang ở bước sóng 660 nm sau ly tam

3.4 Tiến hành thí nghiệm

3.4.1 Thí nghiệm 1: xác định cặp vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất

Mục đích: chọn được cap vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất, xác định thời gian để sự đông tụ đạt được hiệu suất tối ưu

Trang 24

Từ các chủng vi khuẩn: KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 có khả năng tự đông tụ cao

đã được xác định qua các thí nghiệm của Hỗ Thanh Tâm va Cao Ngọc Điệp (2013), chúng được tổ hợp theo từng cặp đề kiểm tra hiệu suất đông tụ theo phương pháp của Kimchhayarasy et al (2009)

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu chéo nhau (trực giao), gồm 2 nhân tố tác động là thời gian có 5 mức: 1 giờ; 3 giờ; 6 giờ; 9 giờ; 12 giờ và cặp vi khuẩn

với 4 chủng vi khuẩn: KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 được tổ hợp thành 6 cặp vi khuẩn:

KG.05-VL.05; KG.05-VL.01; KG.05-ST.02; VL.01-VL.05; VL.01-ST.02; VL.05-ST.02

Téng cộng có 5 x 6 = 30 nghiệm thức, với 3 lần lập lại nên có 90 đơn vị thí nghiệm được thực hiện

Các bước tiễn hành:

- Mỗi chủng vi khuẩn được chủng vào bình tam giác 500 ml chứa 200 ml môi trường lỏng và đặt trên máy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ

- Chuẩn bị dung dịch muối chứa vi khuẩn:

+ 1000 ml dung dich muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaC];), pH = 7 được chuẩn bị

+ Micropipette 1000 ul được sử dụng để hút (n-1) x 50 ml dich vi khuẩn sau khi

nhân tăng sinh khối cho vào tube eppendorf._ 2 ml (n là số chủng vi khuẩn)

+ Sinh khối tế bào sau khi thu được bằng cách ly tâm 11000 vòng/phút trong 10 phút được rửa 2 lần với dung dịch muối đã chuẩn bị và hòa tan bằng dung dịch muối này (để các tế bào vi khuẩn tách rời nhau, dịch vi khuẩn trong tube duoc trộn đều bằng may vortex)

+ Sinh khối tế bào được chứa trong bình tam giác có dung tich 250 ml thém dung dich muối đến 50 ml va lac đều

+ 50 ml dung địch muối chứa vi khuẩn được chuyển vào tube eppendorf 2 ml, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút 1,5 ml dịch vi khuẩn lơ lửng phía trên mỗi tube được chuyền vào bình tam giác có dung tích 250 ml (đề loại bỏ các tế bào tự đông tụ ở day tube ly tâm) và điều chinh OD¢¢o = 0,3

- Phối trộn vi khuẩn: các chủng vi khuẩn được tổ hợp thành từng cặp bằng cách phối trộn 20 mi địch vi khuẩn của mỗi chủng cho vào bình tam giác có dung tích 150

ml và đặt trên máy lắc 120 vòng/phút ở 30°C

Trang 25

- Kiểm tra chỉ số OD:

+ Tại các thời điểm 1 giờ; 3 giờ; 6 giờ; 9 giờ; 12 giờ 1,5 ml dịch vi khuẩn của mỗi cặp được đo OD¿¿g; sau 10 phút để yên, 2 ml dịch vi khuẩn phía trên bình tam giác được chuyển vào tube eppendorf 2 mi, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, ding micropipette hit 1.5 ml dich vi khuẩn lơ lửng phía trên để đo ODạgøo

+ Từ các số đo ODạøo tính hiệu suất đông tụ theo công thức: ODo- ODs

0 x 100 (%)

*Ghi chit: ODo la a6 hap thu quang 6 buéc sóng 660 nm trieéc ly tam

ODs la độ hắp thụ quang ở bước sóng 660 nm sau ly tam

4s Chon cap vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất và thời gian tối ưu cho sự đông tụ của các cặp vi khuẩn đó

3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hướng của pH đến hiệu suất đông tụ Mục đích: xác định giá trị pH tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn ở thời điểm tối ưu đạt được cao nhất

Qua thí nghiệm 1, cặp vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất tại thời gian tối ưu cho sự đông tụ được chọn để tiến hành kiểm tra hiệu suất đông tụ dưới sự ảnh hưởng của các giá trị pH khác nhau

Bé tri thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, 1 nhân tố tác

động là pH với 7 mức: 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 Tổng cộng số nghiệm thức là 7, số đơn vị thí

nghiệm: 7 x 3 lần lặp lai = 21

Các bước tiễn hành:

- Nhân sinh khối mỗi chủng vi khuẩn trong bình tam giác 250 ml chứa 100 mÏ

môi trường trong 24 giờ

- Chuẩn bị địch vi khuẩn đối với mỗi giá trị pH:

+ 300ml dung dich mudi (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl;) được chuẩn bị và điều

chính pH về giá trị dang khảo sát

+50 ml dich nhân sinh khối vi khuân của mỗi chủng được rút vào tube eppendorf 2 ml và ly tâm 11000 vong/phtt trong 10 phút

+ Sinh khối tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl,) Và chứa trong dung địch muối này trong bình tam giác có dung tích 250 ml,

Trang 26

sau đó thêm đung địch muối đến 50 mi và lắc đều

+ 50 ml dịch muối chứa vi khuẩn được chuyên vào tube eppendorf 2 ml, ly tam nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút 1,5 ml dịch vi khuẩn lơ lửng phía trên mỗi tube duoc chuyền vào bình tam giác có dung tích 250 ml và điều chỉnh OD¢¢o = 0,3

- Phối trộn vi khuẩn: đối với mỗi giá trị pH, các chủng vi khuẩn sau khi được chuẩn bị riêng biệt được tổ hợp thành cặp vi khuẩn chứa trong ống falcon 50 ml, méi chủng sử dụng 10 ml, sau đó, đặt trên máy lắc 120 vòng/phút ở 30°C

- Kiểm tra chỉ số OD: đến thời điểm hiệu suất tụ đạt tối ưu (đã xác định ở thí

nghiệm 1), su dung micropipett rut 1,5 ml dich vi khuan do OD¢¢o, Sau 10 phút để yên, dịch vi khuẩn được cho vào tube ly tâm 700 vòng/phút trong 2 phút, 1,5 ml dich vi khuẩn phía trên được hút bằng micropipett để đo ODạao

- Các số đo OD được sử dụng để tính hiệu suất đông tụ theo công thức như ở thí nghiệm 1

œ< Giá trị pH cho hiệu suất đông tụ cao nhất được chọn

3.4.3 Thí nghiệm 3: kháo sát ảnh hưởng của các cation Ca”°, Mg”*, K*, Na?

đến hiệu suất đông tụ

3.4.3.1 Ảnh hướng nồng độ muối của từng loại cation đến hiệu suất đông tụ

Mục đích: xác định nồng độ muối của từng loại cation tối ưu nhất cho sự đông tụ

của cặp vi khuẩn

Cặp vi khuẩn, thời gian, giá trị pH cho hiệu suất đông tụ cao nhất được chọn từ thí

nghiệm 1, 2 để tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của các catlon với các loại muối: CaCl,

MgCh, KCI, NaCl dén hiệu suất đông tụ

Bố trí thí nghiệm đối với mỗi logi cation: thi nghiệm được bồ trí ngẫu nhiên hoàn

toàn, 1 nhân tố tác động là nồng độ muối với 6 mức nồng độ: 10 mM; 20 mM; 30 mM;

40 mM; 50 mM; 60 mM Số nghiệm thức là 6, số đơn vị thí nghiệm: 6 x 3 lần lặp lại = 18

Các bước tiễn hành dối với từng loại cation:

- Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong các bình tam giác 250 ml chứa 100 mI môi trường trong 24 giờ

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn đối với mỗi loại cation, mỗi nồng độ muối:

+ 300 ml dung dịch muối với nồng độ đang khảo sát được chuẩn bị, và pH được

Trang 27

chỉnh về giá trị tối ưu cho hiệu suất đông tụ

+ Sinh khối vi khuẩn được thu lấy từ 50 ml địch vi khuẩn đã tăng sinh

+ Dung dịch muối được dùng để rửa sinh khối vi khuẩn 2 lần và chứa sinh khối

vi khuẩn

+ Dung dịch muối chứa vi khuẩn được ly tâm 700 vòng/phút trong 2 phút, 75%

dich vi khuan nam 6 phan trên được chứa trong bình tam giác 250 ml va chinh OD¢q = 0,3

- Phối trộn vi khuẩn: đối với từng nồng độ muối, 2 chủng vi khuẩn được tổ hợp

thành cặp vi khuân, mỗi chủng sử đụng 10 mi chứa trong ống falcon 50 ml, sau đó, đặt

trên máy lắc 120 vòng/phút ở 30°C

- Chí số OD được kiểm tra tương tự như 2 thí nghiệm trên

< Cation với nồng nồng độ muối cho hiệu suất đông tụ tối ưu được chọn

3.4.3.2 Ánh hưởng cúa các cặp cation (cation hóa trị I + cation hóa trị II) đến hiệu suất đông tụ

Mục đích: xác định cặp muối cho hiệu hiệu suất đông tụ cao nhất

Giá trị pH và nồng độ muối của từng loại cation cho hiệu suất đông tối ưu được chọn, để kiểm tra ảnh hưởng của các cặp cation đến sự đông tụ của cặp vi khuẩn cho hiệu suất đông tụ cao nhất tại thời điểm tối ưu

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần lặp lại,

1 nhân tố tác động là cặp cation Do có 2 loại cation hóa trị I (NaCl và KCD, 2 loại

cation hóa trị II (CaCl; và MgCl;) nên tổng cộng có 4 nghiệm thức: Mg”-K”, Mg”-Na', Ca?*-K*, Ca**-Na’*, sé don vi thi nghiệm: 4 x 3 lần lặp lại = 12

Tiến hành thí nghiệm:

- Mỗi chủng vi khuân được nhân tăng sinh khối trong bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường

- Chuẩn bị địch vi khuẩn cho mỗi cặp cation:

+ 300 ml dung dich hỗn hop 2 muối được chuẩn bị và chỉnh pH về giá trị tối ưu nhất

+ Sinh khối của từng chủng vi khuẩn được thu, rửa và chứa tương tự như các thí

nghiệm trên Chỉ khác là dung dịch muối được sử dụng là cặp muối đã được chuẩn bị

Sau đó, dung địch muối chứa vi khuẩn được ly tâm 700 vòng/phút trong 2 phút, 75% dịch vi khuẩn ở phần trên được chứa trong bình tam giác 250 ml va chinh ODg = 0,3

Trang 28

- Phối trộn vi khuẩn: đối với mỗi cặp cation, 2 chủng vi khuẩn được tổ hợp thành I cặp và chứa trong ống falcon 50 ml, mỗi chủng vi khuẩn sử dụng 10 ml

- Các chỉ số OD được kiểm tra tương tự như các thí nghiệm trên 4 Cap mudi cho hiệu suất đông tụ cao nhất được chọn

3.4.4 Thí nghiệm 4: khảo sát tính tương quan của yếu tố pH và cation ảnh hướng lên hiệu suất đông tụ

Mục đích: tìm điều kiện tối ưu nhất cho sự đông tụ của cặp vi khuẩn được chọn khi khảo sát mối tương quan của hai yếu tố pH và cation

Từ các thí nghiệm trên, cặp vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất; gia tri pH toi uu nhat va 2 gia tri gan tối ưu cho sự đông tụ được chọn; trong cặp cation cho hiệu suất đông tụ cao nhất, đối với mỗi loại cation chọn nồng độ tối ưu nhất và 2 nồng độ gần tối ưu, để tiến hành thí nghiệm khảo sát tính tương quan của các nhân tố ảnh

hưởng đến hiệu suất đông tụ

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bé trí ngẫu theo kiểu chéo nhau Có 2 nhân tố là pH và cặp cation; nhân tố pH có 3 mức: pH cho hiệu suất đông tụ cao nhất, 2 giá trị pH cho hiệu suất đông tụ gần tối ưu; nhân tố cặp cation có 9 cặp: đo cặp cation có 2 loại cation, mỗi loại cation chọn 3 nồng độ muôi: nồng độ cho hiệu suất đông tụ cao nhất và 2 nồng độ cho hiệu suất đông tụ gần tối ưu Tổng cộng có 3 x 9 = 27 nghiệm thức, 27 x 3 lần lặp lại = 81 đơn vị thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm: các bước tiễn hành tương tự nhưng thí nghiệm trên với

dung dịch muối được chuẩn bị theo từng cặp, từng giá trị pH đang khảo sát «< Giá trị pH, cặp cation với nồng độ tối ưu được chọn

3.5 Phương pháp phân tích số liệu

- Phần mềm Microsoft Excel 2003 được sử đụng để nhập liệu và tính các thông số cơ bản, phần mềm Minitab 1ó được sử dụng trong phân tích ANOVA và tính sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê mức 1%

Trang 29

CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Cặp vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tu cao nhất

Bốn chủng vi khuẩn Bacillus cereus KG.05; Bacillus megateriun VL.01; Bacillus

aryabhattai ST.02 và Bacilius sp VL.05 được tô hợp thành 6 cặp vi khuẩn KG.05-

VL.05, KG.05-VL.01, KG.05-ST.02, VL.01-VL.05, VL.05-ST.02, VL.01-ST.02 để kiểm tra thời gian đông tụ tốt nhất của các cặp vi khuẩn Đồng thời dựa vào thí nghiệm này có thể chọn được cap vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn được ghi nhận tại 5 thời

điểm 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ " —eeVL01-VL05 1 Poe ST.02-VL.05 oe — + -KG.05-VL.05 2 — —S§T02-VL0I = 704 av — ++ KG.05-VL01 sa ⁄ —— KG.05-8T.02 S 504 5 404 = 2 304 20 4 \ 10 + 0 1 + 3 6 " 9 12

Thoi gian (gio)

Hình 6 Hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn qua 5 thời điểm

Từ kết quả thống kê, sự khác biệt của các giá tri hiệu suất đông tụ được kiểm tra và có thể nhận định, thời gian đông tụ và sự tổ hợp các chung vi khuẩn có sự tương tác qua lại khi tác động lên hiệu suất đông tụ Hiệu suất đông tụ đạt được cao nhất ở thời

điểm 6 giờ, với các giá trị hiệu suất đông tụ nằm trong khoảng từ 77,42-88,23%, khác

biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99% so với hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn tại các mốc thời gian còn lại Tại mốc thời gian I giờ, hiệu suất đông tụ của 6 cặp vi khuẩn ở mức thấp (25,61-48,81%) Có sự gia tăng ở thời điểm 3 giờ và đạt hiệu suất đông tụ cao nhất (63,06-88,23%) tại mốc 6 giờ, thời điểm sự đông tụ đạt được tối ưu

Trang 30

nhất trong các mốc thời gian được khảo sát 88,23% là hiệu suất đông tụ của cặp vi

khuẩn KG.05-VL.01, kế đến là cặp VL.01-VL.05 (81,73%) và KG.05-VL.05

(77,42%) Qua thời điểm tối ưu hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đều giảm va giảm thấp nhất (12,05-27,65%) ở mốc thời gian 12 giờ (hình 6)

Hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuẩn KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 và KG.05-

VL.05 đều đạt cao nhất ở mốc 6 giờ, khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý

nghĩa 1% so với các cặp vi khuẩn và các mốc thời gian còn lại Nhưng hiệu suất đông tụ giữa 3 cặp vi khuẩn này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê khi so sánh

chúng với nhau Vì thế, ca 3 cap vi khuẩn KG.05-VL.01, VL.01-VL.05, KG.05-VL.05 được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo cùng với thời gian đông tụ cao nhất là

6 giờ

Sự đông tụ giữa các chủng vi khuẩn có liên quan đến thời gian tương tác của chúng, điều này được chứng minh qua nhiều nghiên cứu Rickard et al., (2000) theo dõi sự đông tụ của các cặp vi khuân tổ hợp từ các chủng B natatoria 2.1; B natatoria

2,6; B natatoria 2,3; M luteus 2.13 Két quả là thời gian đầu, sự đông tụ của các cặp

vi khuẩn không đáng kể hoặc không diễn ra Đến một thời điểm tối ưu thì hiệu suất đông tụ tăng đến một giá trị tối đa, tùy thuộc vào đặc điểm của từng chủng vi khuẩn và sự tương tác giữa chúng trong quá trình kết dính Sự đông tụ của các cặp vi khuẩn được duy trì cho đến 50 giờ, sau đó các cặp vi khuẩn tách nhau và phân tán, quá trình đông tụ dừng lại Một trường hợp khác, sự đông tụ của 2 chủng vi khuẩn

Propioniferax PG-02 va Commamonas sp Sau khi qua thời gian sự đông tụ đạt được

hiệu suất đông tụ cao nhất, hiện tượng phân tán của các cum té bao trong dung dich được ghi nhận lại Và điều này được giải thích là do sự tích tụ của phenol gây độc cho các chủng vi khuẩn khi thời gian kéo dài, làm suy thoái và chết các tế bào vi khuẩn (Chen, 2007)

Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng đông tụ của 6 cặp vi khuẩn ở các mốc thời gian khác nhau là phù hợp với các nghiên cứu này Hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn ở giai đoạn đầu còn thấp, sau đó tăng dần và đạt cao nhất tại thời điểm 6 giờ; thời gian khảo sát tiếp theo, hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn giảm xuống thấp gần như không đáng kể Nguyên nhân là giai đoạn đầu tô hợp các chủng vi khuẩn với nhau, chúng cần có thời gian thích nghi và nhận biết, tương tác với chủng vi khuẩn kết cặp đề hình thành các liên kết trong đông tụ, cũng như cần thời gian dé chúng gom tụ

Trang 31

nhờ tính ky nước của bề mặt tế bào nên mốc thời gian đầu kiểm tra hiệu suất đông tụ thấp Bước qua giai đoạn tối ưu cho quá trình đông tụ, sự tích tụ các chất độc do chúng loại thải làm giảm hiệu suất đông tụ Trong các tổ hợp cặp vi khuẩn, ba cặp vi khuẩn

KG.05-VL.01, KG.05-VL.05, VL.01-VL.05 có hiệu suất đông tụ cao (77,42-88,23%)

so với các cặp vi khuẩn còn lại Nguyên nhân là do cả 3 chủng KG.05, VL.01, VL.05 đều có tính ky nước cao (yếu tố quan trọng trong quá trình đông tụ) và đạt hiệu suất tự đông tụ cao hơn so với chủng ST.02 (Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2013) Đó là một trong những lý đo 3 cặp vi khuẩn ST.02-VL.01, ST.02-VL.05 và KG.05-ST.02 có

hiệu suất đông tụ thấp hơn có ý nghĩa về mặt thồng kê so với 3 KG.05-VL.01, KG.05- VL.05, VL.01-VL.05 Đây còn là kết quả của sự kết đôi phụ thuộc và thời gian thu

sinh khối của các chủng vi khuẩn dé tiến hành tổ hợp các chủng vi khuẩn với nhau (Rickard et al., 2000)

4.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ

Ba cặp vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 có hiệu suất đông

Trang 32

Dưới sự ảnh hưởng của những giá trị pH, hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuẩn có sự thay đối trong khoảng 19,02-76,13% ứng với các giá trị pH khác nhau Khi pH = 3,

hiệu suất đông tụ của cả 3 cặp vi khuẩn đều thấp (19,02-32,92%), qua các giá trị pH:

4; 5; 6 hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn tăng dần và đạt cao nhất ở pH= 7 Cụ

thể là, hiệu suất đông tụ của cặp KG.05-VL.01 cao nhất 76,13%, kế đến là cặp VL.01-

VL.05 (74,1%) và KG.05-VL.05 (72,95%) Sau đó pH được nâng lên 8 và 9 thì hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuẩn cùng giảm Ba cặp vi khuẩn đều có hiệu suất đông tụ cao nhất ở pH =7 so với hiệu suất đông tụ ở các giá trị pH còn lại, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1% Ba giá trị hiệu suất đông tụ này được so

sánh với nhau, kết quả là sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê Vì vậy, cả 3

cặp vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 đều được chọn cùng với thời điểm tối ưu 6 giờ, pH = 7 cho hiệu suất đông tụ đạt cao nhất

Trong một nghiên cứu của Ryan và Russell (2013) về việc ứng dụng hiện tượng

đông tụ của các tế bào vi khuẩn để thu sinh khối của vi tảo trong quy trình sản xuất Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất đông tụ của các tế bào vi khuan ching Bacillus sp được kiểm tra; kết quả là hiện tượng đông tụ không xảy ra hoặc xảy ra nhưng không đáng kể khi được khảo sát với pH = 6 và pH = 7; tai pH = 8 sự đông tụ được ghi nhận nhưng hiệu suất không cao Khi pH = 9 hiệu suất đông tụ đạt được cao và tiếp tục pH được nâng lên 10, hiệu suất đông tụ có sự gia tăng nhưng khác biệt không ý nghĩa so với hiệu suất đông tụ đạt được ở giá trị pH = 9 Một nghiên cứu khác Min et al., (2010) về ảnh hưởng của yếu tố pH đến hiệu suất đông tụ của các chủng vi khuẩn trong bùn

hoạt tính ở các giá trị pH từ 3 đến 9, kết quả là hiệu suất đông tụ tăng khi nâng pH từ 3

đến 7 và đạt cao nhất khi pH = 7; sau đó có sự giảm xuống của hiệu suất đông tụ do pH tiếp tục được kiềm hóa Tương tự với thí nghiệm của Kimchhayarasy et al., (2009) pH =7 là giá trị tối ưu cho các chủng vi khuẩn đông tụ được phân lập trong bùn hoạt tính Trong thí nghiệm này đã kiểm tra sự ảnh hưởng của pH lên hiệu suất đông tụ của 3 cặp chủng vi khuẩn KG.05-VL.01, VL.01-VL.05, KG.05-VL.05 cũng có sự thay đổi khi các giá trị pH được điều chỉnh ở các mức khác nhau Điều này cho thấy, pH môi trường tác động rất lớn đối với quá trình đông tụ của các chủng vi khuẩn Và tùy vào điều kiện môi trường sống, cấu trúc bề mặt của các tế bào vi khuẩn có các thành phần

không giống nhau do đó pH tối ưu cho hiệu suất đông tụ của chúng cũng khác nhau

Các giá trị pH khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến hiệu suất đông tụ của các chủng vi

Trang 33

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ

khuẩn Điều này được giải thích là do pH ảnh hưởng lên điện tích trên bề mặt các

protein ở màng ngoài của tế bào vi khuẩn; thông qua đó ánh hưởng đến hiệu suất đông

tụ, vì một trong các cơ chế gây ra hiện tượng đông tụ đã được chứng minh dựa vào liên kết giữa protein lectin của tế bào này với oligosaccharide của tế bào kia Sự chênh lệch điện tích do pH làm ảnh hưởng đến tương tác định hướng của protein và oligosaccharide khong còn đặc hiệu (Ryan và Russell, 2013)

Bên cạnh đó, nước thải chăn nuôi heo sau biogas có pH dao động trong khoảng 6,97-7,95 (Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn Vĩnh Long); pH này thích hợp cho

các cặp vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 đông tụ để gom tụ các

chất lơ lửng khó lắng trong các bê chứa nước thải sau biogas

4.3 Ảnh hướng của các cation với các nồng độ muối tương ứng đến hiệu suất đông tụ

Các cation: Ca’*, Mg”*, K*, Na* cia céc mudi CaCh, MgCl, KCI, NaCl duge sir

dụng để kiểm tra hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuân KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 với pH = 7 và thời gian bắt cặp tối ưu là 6 giờ Mỗi loại muối khảo sát ở

6 nồng độ: 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM 4.3.1 Ảnh hướng nồng độ của NaCl

Qua kết quả phân tích thống kê, các nồng độ khác nhau của muối cation Na” ảnh

Trang 34

Ở nồng độ 30 mM NaCl, ba cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 (71,63%), VL.01-VL.05 (66,67%) KG.05-VL.05 (63,69%) có hiệu suất đông tụ cao nhất so hiệu suất đông tụ ở

các nồng độ muối còn lại Khi so sánh các hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuẩn này ở cùng nồng độ muối 30 mM, cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 có hiệu suất đông tụ cao nhất khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99%, nhưng khác biệt không có ý nghĩa về mặt

thống kê so với hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn VL.01-VL.05 Khi mới bắt đầu kiểm

tra với nồng độ 10 mM cả 3 cặp vi khuẩn đều có hiệu suất đông tụ thấp (34,35-43,12%) và nồng độ muối được tăng lên 20 mM hiệu suất cũng tăng theo va đạt tối ưu tại nồng

độ 30 mM Khi tiếp tục tăng nồng độ 40 mM, 50 mM, 60 mM hiệu suất đông tụ của các

cặp vi khuẩn có xu hướng giám khi nồng độ càng cao, tùy theo đặc điểm của từng cặp vi khuẩn mà có những biến động nhiều hay ít khác nhau về hiệu suất đông tụ

4.3.2 Ánh hưởng nồng độ của KCI

Hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi khuẩn KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 và KG.05- VL.05 đều đạt tối ưu ở nồng độ 30 mM KCI (66,94-69,64%) khác biệt có ý nghĩa so với

Trang 35

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ

Kết quả phân tích thống kê, có sự tương tác của 2 nhân tố cặp vi khuẩn và nồng độ

muối khác nhau lên hiệu suất đông tụ Hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn ở nồng độ

10 mM KCI (39,21-46,94%) và tăng dần lên khi nồng độ KCI được tăng lên cuối cùng

hiệu suất đông tụ của cả 3 cặp đều đạt tối ưu tại nồng độ muối 30 mM Sau đó, hiệu suất đông tụ theo chiều hướng giảm dần khi nồng độ KCI được nâng đần đến 60 mM; ở nồng độ 60 mM hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đạt thấp nhất

4.3.3 Ánh hưởng nồng độ của CaCl;

Trong các nồng độ muối CaCl duoc khao sat, 20 mM là nong độ tối ưu cho cho hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn Ở nồng độ này hiệu suất đông tụ của 3 cặp vi

khuẩn đạt cao nhất (66,31-69,1%) so với hiệu suất đông tụ tại các nồng độ muối còn lại,

sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với mức tin cậy 99% Qua kiểm tra ở 6

nồng độ muối CaCl;, nồng đô 10 mM cho hiệu suất đông tụ 42,93-46,76% vẫn còn thấp

so với hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuân ở nồng độ tối ưu (20 mM) Khi CaCl; ở nồng độ cao hơn 20 mM thì hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn càng giảm khi nồng

Trang 36

4.3.4 Ảnh hưởng nồng độ của MgCl;

Kết quả thí nghiệm với ảnh hưởng của MgC]; ở các nồng độ muối khác nhau cho hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn có các giá trị khác nhau Trong đó, cặp vi khuẩn

KG.05-VL.01 đạt hiệu suất đông tụ cao nhất (71,83%) ở nồng độ muối 20 mM MgC];, sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức tin cậy 99% Và ở các nồng độ thấp

hơn hay cao hơn 20 mM hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đều thấp hơn so với hiệu suất đông tụ tại nồng độ muối 20 mM 80 3 71.83 66.8 ~ Ss 542 5295 WKGOS-VL05 OKGOS-VLOI BVLOL-VLO5 59.44— 10.79 2 S5 54.8653.59 a 5 6.67 46: 6.96 4448 42.19 lụn 4108 36.7 7.55 346 605 Hiệu suất đông tụ (%) Oo os s és 21 10 2 30 40 50 60 Nông độ muôi (mM)

Hình 11 Ánh hưởng nồng độ của MgC]; đến hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn Từ các kết quả trên có thể nhận định, hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đều chịu sự ảnh hưởng của 4 loại cation với các nồng độ muối khác nhau Trong đó cation hóa trị I (NaCI và KCI) ở nồng độ muối 30 mM là điều kiện tối ưu cho sự đông tụ của các cặp vi khuẩn; ở cation hóa trị II (CaCl, va MgCl,), 20 mM là nồng độ muối

tối ưu đối với hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn

Nguyên nhân sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị hiệu suất đông tụ ở các nồng độ khác nhau có thể được giả thích như sau: sự thay đổi nồng độ hay điện tích ion trong môi trường sẽ làm thay đôi cấu trúc bề mặt tế bào của các chủng vi khuẩn,

dẫn đến hiệu suất đông tụ bị ảnh hưởng Hơn nữa liên kết giữa các chủng vi khuẩn là

nhờ liên kết lectin-oligosaccharide các thành phần ngoại bào lipopolysaccharides (LPSs), exoposaccharides (EPSs); protein lectin và các thành phần này chịu sự tác động của điện tích trong môi trường nên nông độ muôi của các cation cũng sẽ ảnh

Trang 37

hưởng đến hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn Nồng độ muối của từng loại cation

khảo sát ban đầu thấp so với nhu cầu của các chủng vi khuẩn nên hiệu suất đông tụ của

các cặp vi khuẩn chưa đạt cao nhất Khi khảo sát đến nồng độ thích hợp cho hoạt động của chúng, hiệu suất đông tụ đạt tối ưu Tiếp tục tăng nồng độ muối của các cation, lượng dư thừa của các cation làm thay đổi tính thấm của màng, thay đổi cấu trúc bề mặt tế bào vi khuân nên hiệu suất đông tụ càng giảm khi lượng dư cation càng nhiều

Một nghiên cứu của Min et al., (2010) khi khảo sát các yếu tố hóa lý ảnh hưởng đến sự đông tụ của 2 chủng vi khuẩn Sphingomonas nafatoria 2.1 gfp va Micrococcus luteus 2.13 trong bun hoạt tính của nước thải sinh hoạt Tế bào vi khuẩn được pha loãng trong các dung dịch có nồng độ khác nhau của các muối CaCl;, MgCl;, MgSO,

va NaCl, KCl, sự đông tụ bị hạn chế khi nồng độ muối NaCl, KCI (cation hóa trị I) ở

90 mM, trong khi đó nồng độ các muối CaCh, MgCh, MgSO, (cation hóa trị II) chỉ cần 40 mM Tương tự trong thí nghiệm này, để đạt được hiệu suất đông tụ cao nhất cần có nồng độ muối của cation hóa trị I (30 mM) cao hơn nồng độ muối của cation hóa trị II (20 mM) Ryan và Russell (2013) cũng đã kiểm tra ảnh hưởng của cation hóa trị II Ca?" và Mg”” của 2 muối tương ứng CaCl; và MgSO¿ đến hiệu suất đông tụ của

các chúng Bacillus sp kết quá là hiệu suất đông tụ đạt tối ưu khi nồng độ muối là 0,8 mM đối với CaCl; và l6 mM đối với MgSO¿; nồng độ muối thấp hay cao hơn 0,8 đối

với CaCl;; thấp hay cao hơn 16 mM đối với MgSO¿ hiện tượng đông tụ có hiệu suất rất thấp hoặc không quan sát được Đồng thời để khẳng định được tầm quan trọng của các cation trong quá trình đông tụ, thí nghiệm với EDTA có ái lực cao hơn đối với

Ca** va EGTA có ái lực cao hơn đối với Mg” được thực hiện Trong đó EDTA và

EDTA có tác dụng hấp thu các cation có trong môi trường Kết quả sự đông tụ đã không diễn ra do môi trường không có sự hiện điện của cation Ca?" và Mg” Ảnh

hưởng của Ca?” va Mg”* đến quá trình đông tụ được giải thích như sau Đối với vi

khuẩn Gram dương, vách tế bào có các thành phần peptidoglycan (chiếm 95%) và acid teichoic mang điện tich 4m, nén cdc cation Ca** va Mg”* cé thé gắn kết vào bề mặt tế bào thông qua liên kết ion với các thành phần này; làm giảm điện tích âm trên bề mặt các tế bào vi khuẩn vì thế chúng không còn bị ngăn cản bởi lực đấy tĩnh điện cùng dấu, dẫn đến chúng có thể kết cụm với nhau thông qua các tương tác khác

Mặt đù nồng độ muối tối ưu của các cation trong thí nghiệm với các cặp vi khuẩn bacillus KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 cao hơn so với các kết quả thí

Trang 38

nghiệm của các nghiên cứu trên, nhưng cũng đã thể hiện được vai trò quan trọng của các cation trong qua trình đông tụ của các cặp vi khuẩn Ở nồng độ quá acid hay quá

kiềm sẽ làm ức chế, giảm hiệu suất đông tụ Mặt khác, mỗi chủng vi khuẩn sẽ phù hợp

với từng loại cation ở nồng độ nhất định để chúng hoạt động tối ưu nhất (Lương Đức Pham, 2009)

Thuc té trong môi trường nước thải chăn nuôi heo tồn tại rất nhiều loại cation hóa trị I, II cùng với nhau Vì thế chúng sẽ cùng tác động lên hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn Vậy nên, thí nghiệm tiếp theo được thực hiện để tìm được cặp cation tối ưu hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn

4.4 Cặp cation tối ưu cho hiệu suất đông tụ

Các cation Ca””, Mg”, K°, Na” được tổ hợp thành 4 cặp cation (cation héa tri I + II) tương ứng với 4 loại muối có nồng độ cho hiệu suất đông tụ cao từ thí nghiệm trên:

30 mM NaCl + 20 mM MgCh, 30 mM NaCl + 20 mM CaCh, 30 mM KCl + 20 mM

MgCh, 30 mM KCI + 20 mM CaCh Thi nghiệm được thực hiện trên 3 cặp vi khuẩn

Trang 39

Kết quả thí nghiệm cho thấy sự kết hợp của các cation tác động khác nhau đến hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn KG.05-VL.01, KG.05-VL.05, VL.01-VL.05 với mức ý nghĩa 1% Nhìn chung hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đạt hiệu suất đông tụ cao (73,33-94,89%), trong đó cao nhất là 94,89% khi khảo sát ảnh hưởng của cặp cation Mg”-K† lên hiệu suất đông tụ của cap vi khuẩn KG.05-VL.01, khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với 3 cặp cation còn lại và các cặp vi khuẩn còn lại Do trong thành phần nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) sự hiện diện cation Mg”” và KỶ rất cao, đây là yếu tố tồn đư từ thức ăn thừa hoặc từ chất thải (phân, nước tiểu ) của heo thải loại khi thực hiện công nghệ xử ly biogas thi cac cation nay giảm không đáng kế (Nguyễn Thị Thu Hà, 2008) Theo nghiên cứu của Ben et al., (2012) K” có ảnh hưởng tác động hợp tác hơn so với Na” Trong thí nghiệm kiểm tra từng nồng độ tối ưu của các cation cho hiệu suất đông tụ cao thì Na” và K” đều tạo được hiệu suất đông tụ cao nhất ở cùng nồng độ 30 mM và các giá trị của hiệu suất đông tụ khác biệt không

có ý nghĩa về mặt thống kê Nhưng khi ở nồng độ muối 30 mM K” phối hợp với cation

Mg”* tai nong do muối 20 mM, kết quả hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đạt được cao, trong đó cao nhất là cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 (94,89%) Bên cạnh đó, để sống được trong môi trường này, các vi sinh vật phải thích nghi, cân bằng quá trình trao đổi, tính thấm thấu của màng Đối với vi khuẩn đông tụ, các cation còn tham gia

vào cầu nói hữu ích cho sự kết dính của các tế bào vi khuẩn với nhau, qua đó làm tăng

hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn Tùy vào đặc tính của từng chủng và sự kết đôi

giữa các tế bào với nhau, cặp muối cation hóa tri I va II sé có nồng độ thích hợp để

hiệu suất đông tụ đạt tối ưu Từ kết quả thí nghiệm có thể nhận định, cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 có hiệu suất đông tụ cao nhất khi khảo sát với cặp cation Mg”-K”

tương ứng với cặp muối 20 mM MgCl; + 30 mM KCI

4.5 Mối tương quan giữa pH và nồng độ muối của các cafion

Từ các thí nghiệm trên, giá trị pH được chọn ở 3 mức: 6; 7; 8 Hai loại cation được chọn là Mg”* tương ứng với nồng độ 10 mM, 20 mM, 30 mM MgCl;; K” tương ứng với 20 mM, 30 mM, 40 mM KCI Hai loại cation này được tổ hợp thành các cặp cation với các nồng độ trên để kiểm tra hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn KG.05- VL.01 thí nghiệm được thực hiện ở thời gian tối ưu 6 giờ cho sự đông tụ

Từ kết quả thống kê, cặp muối KCI-MgC]; ở các nồng độ khác nhau ảnh hưởng

khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 với mức tin cậy 99%

Trang 40

Hiệu suất đông tụ của cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 nằm trong khoảng 23,06-73,2% tính

trên tất cả các cặp muối và các pH Trong đó, hiệu suất đông tụ đạt cao nhất là 73,2% tại pH = 7 ứng với cặp muối KCI.30-MgC];.20 Hiệu suất này cao nhất, có ý nghĩa về

mặt thống kê so với các hiệu suất đông tụ chịu sự ảnh hưởng của các giá trị pH và các nồng độ muối còn lại Bảng 4 Tối ưu hóa hiệu suất đông tụ (%) của cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 H P 6 7 8 Cặp muối KCI.20-MgCI;.10 36,718 43,5%, 30,20ciah KCI.20-MgCI;20 44.2496 54,35% 47,14 KCI.20-MgCI;.30 49,70% 50,2 38,665" KCI.30-MgCI;.10 40,07% 56,69° 44,27 KCI.30-MgCI;.20 45.3218 73,18" 56,55 KCI.30-MgCI;.30 43,480 54,04% 32,591 KCI.40-MgCI;.10 33,54 38,25 n 41,22 KCI.40-MgCI;.20 34,300 53,56" 23,06" KCI.40-MgCI;.30 21,07" 34,590 45,071

*Ghi chú: Ý nghĩa của các cặp muối theo thứ tự là: (loại muối).(nông độ muối )-(loại muối).(nông độ muối)

Cac ky tu chit ở phân mũ của hiệu suất đồng tụ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 99% Nếu ít nhất

một ký tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê và ngược lại

Do trong môi trường sống, các sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau cùng tác động, nên hiệu suất đông tụ của các cặp đòng vi khuẩn không chỉ đơn thuần dựa vào tính ky nước của bề mặt tế bào hay chỉ đựa vào đặc tính liên kết của các thành phần ngoại bào, mà còn có các yếu tố môi trường ngoài tương tác nhau làm ảnh

hưởng lên hiệu suất đông tụ của chúng Nên tùy vào đặc điểm của từng cặp vi khuẩn,

tính thích nghỉ với môi trường sống chúng sẽ đạt hiệu suất đông tụ cao nhất ở các điều

kiện khác nhau Qua kiểm tra thí nghiệm, cặp vi khuẩn KG.05-VL.01 đạt hiệu suất

đông tụ tối ưu khi pH = 7, thời gian bắt cặp là 6 giờ và có sự kết hợp của KỶ ở nồng độ

muối KCI là 30 mM và Mg”” ở nồng độ muối MgCl; là 20 mM

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	8,99 MB