vector plasmid PGEM3Z trong tạo dòng

• pGEM3Z rất giống vector p UC, cũng mang gene ampR và gene LacZ và chứa các nhóm vị trí cắt giới hạn với kích thước gần giống nhau. • Điểm đặc trưng của p GEM3Z là thêm vào 2 đoạn DNA ngắn, mỗi đoạn hoạt động như là 1promoter cho việc gắn enzyme RNA polymerase, 2 trình tự promoter đều nằm ngoài nhóm các vị trí cắt giới hạn và được sử dụng cho việc chuyển 1 đoạn DNA mới vào phân tử pGEM3Z. • Có nhiều trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn tạo thành đoạn polylinker dài

Cấu trúc plasmid và vai trò từng thành phần trong plasmid PGEM3Z. 1.Cấu trúc PGEM3Z: • Kích thước:~3000bp • Đoạn DNA chèn vào có kích thước <10kb. • pGEM-3Z rất giống vector p UC, cũng mang gene ampR và gene LacZ và chứa các nhóm vị trí cắt giới hạn với kích thước gần giống nhau. • Điểm đặc trưng của p GEM-3Z là thêm vào 2 đoạn DNA ngắn, mỗi đoạn hoạt động như là 1promoter cho việc gắn enzyme RNA polymerase, 2 trình tự promoter đều nằm ngoài nhóm các vị trí cắt giới hạn và được sử dụng cho việc chuyển 1 đoạn DNA mới vào phân tử pGEM-3Z. • Có nhiều trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn tạo thành đoạn polylinker dài. 2.Vai trò từng thành phần của PGEM3Z: • AmpR gene: Gene kháng lại Ampicillin tạo enzyme lactamase, ức chế chất kháng sinh Ampicillin trong dung môi. Như vậy, chúng ta có thể chọn lọc plasmid chứa pGEM3Z vì vi khuẩn này kháng Ampicillin. • Ori:Vector pGEM-3Z chứa điểm khởi đầu sao chép plasmid (ORI). • Promoters: Plasmid chứa thể thực khuẩn T7 và SP6 RNA polymerase promoter. SP6, và T7 RNA polymerase là Dna-phụ thuộc RNA polymerase với tính đặc hiệu nghiêm ngặt trình tự promoter tương ứng. Hai promoter sẽ thể hiện rõ việc dòng hóa gene khi polymerase thể thực khuẩn cung cấp cho quá trình phiên mã. • Vùng polylinker: được tạo thành từ nhiều vị trí enzyme cắt giới hạn cho phép chèn bất cứ đoạn DNA lạ nào. • LacZ: sàng lọc dòng tế bào mang plasmid PGEM3Z tái tổ hợp. I. Quá trình phát triển vector từ các cấu trúc tự nhiên.  Các plasmid dùng cho kĩ thuật tái tổ hợp DNA trải qua 3 thế hệ: • Thế hệ đầu tiên là các plasmid tự nhiên đến nay hầu như không được sử dụng nữa: Thế hệ đầu tiên đó là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên pSC101(StalayCohen), ColE1 đã góp phần đầu tiên vào lịch sử tạo dòng. Tuy vậy các plasmid này có rất ít những đặc tính cần thiết. Sau này , các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên vào một cấu trúc duy nhất. • Plasmid thế hệ thứ 2: Các plasmid thế hệ thứ 2 được cấu tạo phức tạp hơn bắt nguồn từ plasmid nhỏ và được cấu tạo thêm nhiều đoạn gen quí. pBR322 là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân dòng trong tế bào E.Coli. Các plasmid thế hệ thứ hai được cải tiến từ các plasmid thế hệ thứ nhất, chúng có thêm nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh. Một ứng dụng nữa của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt. • Plasmid thế hệ thứ 3: Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker . Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn. Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn:  Dãy pUC như: pUC18 , pUC19  Dãy Gemini: Plasmid pGEM3 , Plasmid pCR 2.1  Nhóm các plasmid Bluescript.  Như vậy plasmid PGEM3Z là plasmid thuộc thế hệ thứ 3, ngoài ưu điểm của các thế hệ trước, nó còn được cải tiến với nhiều ưu điểm vượt trội khác: kích thước nhỏ, tạo được nhiều bản sao trong tế bào chủ, có ứng dụng trong thu nhận RNA nhanh chóng. PGEM3Z có 2 promotor đặc trưng cho RNApolymerase SP6 và T7 ở hai bên vùng polylinker . Vì vậy nó cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong plasmid thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA. II. Cơ chế hoạt động của plasmid PGEM3Z : 1.Cách sử dụng PGEM3Z trong tạo dòng. • Tạo plasmid PGEM3Z tái tổ hợp : Đoạn DNA mục tiêu tối đa có thể chèn vào plasmid là 10kb. • PGEM3Z tái tổ hợp được đưa vào tế bào chủ bằng các biện pháp như : biến nạp, tải nạp hay vi tiêm. Thường được sử dụng là phương pháp biến nạp:  Hóa biến nạp.  Điện biến nạp : • Cách thức hoạt động của PGEM3Z trong tế bào chủ : sau khi được đưa vào bên trong tế bào chủ E.coli PGEM3Z tồn tại độc lập bên trong tế bào chủ. Số lượng bản sao PGEM3Z trong tế bào từ vài chục đến vài trăm. Thông thường các plasmid có kích thước nhỏ sẽ sao chép đôc lập nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn tuy nhiên plasmid PGEM3Z thì không sử dụng được RNA polymerase của tế bào vi khuẩn E.coli để phiên mã tạo RNA. Thay vào đó promoter T7 trên PGEM3Z được bám bởi RNA polymerase T7 phage và promoter SP6 được bám bởi RNA polymerase của SP6 phage. Những RNA polymerase này được tổng hợp trong suốt quá trình ecoli bị nhiễm một hay nhiểu phage và các gene của phage được phiên mã. Các enzyme này thường được chọn để phiên mã trong phòng thí nghiệm như những enzyme hoạt động rất tích cực, có thể tổng hợp 1-2mg RNA mỗi phút. RNA polymerase T7 và RNA polymerase SP6 bám vào 2 promoter tương ứng trên plasmid sau đó đoạn DNA mục tiêu được phiên mã tạo RNA. Ở đây điểm đặc biệt là PGEM3Z có 2 promoter T7, SP6 có chiều phiên mã ngược nhau nên sau quá trình phiên mã ta sẽ thu được các đoạn RNA ngắn khác nhau phục vụ cho quá trình nghiên cứu và thí nghiệm. • Nuôi cấy tế bào vi khuẩn trong môi trường chọn lọc có ampicilin và sàng lọc dòng tế bào mang PGEM3Z tái tổ hợp trên môi trường X-gal. Dòng tế bào có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ cho khuẩn lạc màu trắng còn dòng tế bào không chứa plasmid hay quá trình tái tổ hợp không thành công sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. III. Ví dụ cụ thể về ứng dụng của plasmid PGEM3Z. Tạo dòng đoạn gen của estrogen receptor- beta và sự biểu hiện của nó trong phôi chuột Để nghiên cứu những tác động biểu hiện của estrogen receptor-beta (ERbeta) trong sự phát triển của phôi chuột, các mồi của ER beta đã được thiết kế, đoạn ERbeta lần đầu tiên được thu được bằng RT-PCR và dòng hóa vào trong plasmid pGEM- 3Z. Sau đó các plasmid tái tổ hợp được làm thẳng ra bằng các enzyme hạn chế EcoRand Hind. Sử dụng SP6 và T7 RNA polymerase, các digoxigenin đánh dấu đầu dò sense và anti- sense được phiên mã trong ống nghiệm. Sau đó sự biểu hiện của ERbeta trong phôi chuột đã được kiểm tra với các đầu dò lai tại chỗ. Kết quả cho thấy ERbeta được thể hiện trong não, ống thần kinh cột sống, bộ phận sinh dục, màng tim, vòm hàm dưới. Những kết quả này cho thấy rằng ERbeta đóng vai trò điều chỉnh trong phân biệt giới tính, phân biệt nguyên sơ của ống thần kinh, sự phân biệt sự khác nhau của ba túi tiểu não và tủy sống, sự khác biệt của xương và sụn theo thời gian, sựphát triển của màng ngoài tim và cấu hình khác biệt của hàm dưới ở phôi chuột. (School of Life Science, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China. zhangzifengsuper@xznu.edu.cn 2008 Mar;30(3):347-51 ). IV. Tài liệu tham khảo: 1.School of Life Science, Xuzhou Normal University, Xuzhou, China. zhangzifengsuper@xznu.edu.cn 2.http://delliss.people.cofc.edu/virtuallabbook/LabReadings/RE_GelElectrophoresis/RE_Dige st_GelElect09.pdf. 3.http://d.violet.vn/uploads/resources/570/610039/c4.pdf . 4. http://ipmbgazette.weebly.com/uploads/1/0/3/0/1030249/giang.pdf . 5.“gene cloning and DNA analysis an introduction sixth edition”-T.A.bBrown.