Bài giảng DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật, với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp hoặc

DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH

I./TỔNG QUAN VỀ THUỐC KHÁNG SINH

1 Thế nào là thuốc kháng sinh ?

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị

Phân loại :

- Kháng sinh tự nhiên : penicillin , streptomycin

- Kháng sinh bán tổng hợp : ampicillin

- Kháng sinh tổng hợp : sulfonamide , quinolones

Các nhóm kháng sinh chính sử dụng trong nông nghiệp :

- B-lactam : penicillin , cephalosporine…

- Aminoglycosides : streptomycine…

- Polypeptide

- Tetracycline : chlortetracycline…

- Phenicol : chloramphenicol…

- Macrolides : erythromycin…

- Sulfonamide : sulfamethazine…

- Diaminopyrimidine : trimethoprim…

- Quinolones : acid nalidicine…

- Nitrofuran : furazolidone…

- Carbadox

Công thức rất khác nhau và phức tạp

2 Đơn vị kháng sinh

Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, g/ml, hay đơn vị kháng sinh

UI/ml (hay UI/g, International Unit

Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tối thiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn,vd:

o với penicillin là số miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trường

canh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm

định;

o với Streptomicin là số miligam pha trong 1 ml môi trường canh thang và

kiểm định bằng vi khuẩn Escherichia coli)

3 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu :

Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm hay tiêu diệt một cách chọn lọc các chủng vi sinh gây bệnh, trong khi không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người bệnh được điều trị Đặc tính này được biểu thị qua hai giá trị là:

Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt là MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal Concentration -

Viết tắt là MBC), xác định trên các đối tượng vi sinh vật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho mỗi chất kháng sinh

4 Tác dụng của thuốc kháng sinh

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tác động thường gặp là

làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất

Thuốc kháng sinh dược dùng để phòng và trị bệnh gia súc , nhưng phần lớn trên 90 % thuốc được sử dụng như nhửng chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi và ngư nghiệp Thuốc kháng sinh được trộn vào thức ăn hổn hợp với những nồng độ thật thấp để giúp thú mau lớn và tăng trọng nhanh

5 Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm

o Dùng quá nhiều loại, không kiểm soát được

o Do sử dụng vào phòng, điều trị bệnh và làm chất phụ gia thức ăn

o Điều kiện vệ sinh môi trường phức tạp, ô nhiễm  người chăn nuôi phải

sử dụng kháng sinh để hạn chế sự phát triển của mầm bệnh

o Thuốc phòng trị bệnh trong chăn nuôi được dùng tùy tiện, không theo hướng dẫn

o Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh

o Có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi như: Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc

o Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh

o Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh cho con vật

o Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho vật nuôi để bảo quản sản phẩm từ động vật lâu hư

o Có thể cho thẳng kháng sinh vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm, tránh hư hỏng

o Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo quản

6 ảnh hưởng của dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm

o Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm chăn nuôi tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ

 Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn tồn dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây kháng thuốc của E.Coli

 Khi E.Coli đã kháng thuốc thì nó có thể chuyền plasmid kháng thuốc của

nó cho các loại vi khuẩn gây bệnh khác sống trong đường ruột

o Ảnh hưởng ngay lập tức sau khi tiêu thụ sản phẩm:

- Phản ứng quá mẫn cảm đối với người nhạy cảm kháng sinh,

- Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh,

o Ảnh hưởng muộn hơn khi tiêu thụ thực phẩm tồn dư kháng sinh:

- Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn

- Gây tốn kém về mặt kinh tế

o Tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc

o Các loại vi sinh vật kháng thuốc này có thể truyền sang người

-Khó khăn trong điều trị bệnh cho con người

o Làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể, tạo ra con giống yếu ớt: -Không sống được khi không có kháng sinh

-Một số kháng sinh, hóa dược có thể gây ung thư cho người tiêu thụ -Chloramphenicol có thể gây suy tủy

7 Chỉ tiêu cho phép

- Các hóa chất , kháng sinh cấm sử dụng trong thủy sản :

Aristolochia spp và các chế phẩm từ chúng, Chloramphenicol ,Chloroform Chlorpromazine ,Colchicine ,Dapsone ,Dimetridazole ,Metronidazole

Nitrofuran (bao gồm cả Furazolidone) ,Ronidazole ,Green Malachite (Xanh Malachite) ,Ipronidazole ,Các Nitroimidazole khác ,Clenbuterol

Diethylstibestrol (DES) ,Glycopeptides ,Trichlorfon (Dipterex)

- Các hóa chất , kháng sinh hạn chế sử dụng : tùy theo từng loại mà dư lượng tối đa cho phép nằm trong khoảng 50 – 1000ppb ???

II./PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH STREPTOMYCIN

1 Thuốc kháng sinh streptomycine

Năm 1943 Waksman S.A nhà khoa học Mỹ đã chiết được streptomycin từ streptomyces grisus Năm 1952, Waksman S.A đã được trao giải Nobel

Ưu điểm : streptomycine là kháng sinh phổ rộng có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn gram âm Có tác dụng tốt trên trực khuẩn lao , nhất là vi khuẩn lao ở giai đoạn sinh sản nhanh Ngoài ra còn có tác dụng trên trực khuẩn gây bệnh dịch hạch và trực khuẩn đường ruột

Khuyết điểm : Streptomycine gây độc đối với thính giác mạnh nhất trong nhóm : rối loạn tiền đình , ù tai , giảm thính lực và điếc không hồi phục Gây độc đối với thận , gây dị ứng : mày đay , viêm da , ban da , viêm miệng , shock phản vệ , ức chế dẫn truyền thần kinh cơ , trường hợp nặng gây suy

hô hấp , liệt hô hấp , liệt cơ

Tên : 5-(2,4-diguanidino-3,5,6-trihydroxy-cyclohexoxy)- 4-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-methylamino-tetrahydropyran-2-yl] oxy-3-hydroxy-2-methyl-tetrahydrofuran-3-carbaldehyde

Công thức hóa học : C21H39N7O12

2 Đặc tính chung

Streptomycin là 1 bazơ hữu cơ chiết ra từ nấm streptomyces globisporus streptomyxini hay từ các loài sinh vật khác hoặc có được bằng các phương pháp tổng hợp Các streptomycin đều tạo muối với axit vô cơ Các loại muối của kháng sinh thường là sunfat, clohydrat, photphat và có cảc phức chất canxiclorua của streptomycin clohydrat Các muối này tan trong nước, hầu như không tan trong clorofooc, cồn và ête

3 Nguyên tắc

Thuỷ phân streptomycin bằng kiềm cho maltol là Methyl-3-hydroxy-7pyron Sự tạo thành maltol xảy ra hoàn toàn định lượng cho phép xác định được streptomycin

Maltol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thủy phân bằng cách dùng clorofooc

để chiết khỏi dung dịch mẫu trong môi trường axit, sau đó giải chiết maltol bằng dung dịch kiềm trong nước Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía đặc trưng và đo mật độ quang của phức màu này ở sóng 525 nm để xác định streptomycin Nồng độ của streptomycin được xác định theo phương pháp đường chuẩn

4 Lấy mẫu

- Nên lấy mẫu ở dạng còn nguyên bao gói

- Nếu phải lấy mẫu một phần:

a Dụng cụ chứa mẫu phải sạch, khô, không có lỗ rò, miệng rộng có nắp đậy, vô trùng, có kích thước phù hợp với mẫu cần lấy

b Tốt nhất là dụng cụ chứa mẫu bằng nhựa hay kim loại, hạn chế sử dụng dụng cụ bằng thủy tinh

c Dùng các dụng cụ vô trùng để lấy mẫu vào dụng cụ chứa, không dùng tay tiếp xúc với mẫu

d Sản phẩm khô, có thể dùng hộp kim loại hay bao PE có thể bịt kín được

e Lấy ít nhất 100g cho mỗi mẫu, không được lấy mẫu đầy bình chứa

f Đối với mẫu lỏng phải phải kiểm soát nhiệt độ tại thời điểm lấy mẫu

5 Dụng cụ , thiết bị và hóa chất

a Dụng cụ , thiết bị :

+ Máy trắc quang UV-VIS

+ Cuvét thủy tinh có chiều dày 2 cm

+ Máy xay sinh tố

+ Máy ly tâm

+ Bình định mức các loại

+ Pipet các loại

+ Phễu chiết cỡ 250 ml

+ Một số dụng cụ khác

b Hóa chất : Dùng hoá chất có độ tinh khiết phân tích

- Axit clohydric, dung dịch 1M

- Natrihydroxyt, dung dịch 1N

- Thuốc thử: phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% trong

axit sunfuric 1N

- Clorofooc

- Dung dịch gốc tiêu chuẩn streptomycin sunphat nồng độ 1mg/ml

- Nước cất 2 lần

6 Tiến hành thử

o Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lượng a = 20g cho vào máy xay sinh tố Thêm 10 ml nước cất vào và cho máy chạy trong 5 phút Cho 5 ml axit clohydric 1 M vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất Đun trong bếp cách thuỷ sôi trong

10 phút Để nguội, ly tâm lắng cặn, lấy dung dịch nước trong cho vào phễu chiết, thêm 10 ml clorofooc, lắc trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút cho phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu cơ vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natrihydroxyt 1N và 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2% trong axit và nước cất đến 20 ml Lắc mạnh trong 30 phút, sau

đó để yên trong 20 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước Dung dịch này dùng để đo mật độ quang, xác định streptomycin ở bước sóng 525 nm

o Pha dẫy chuẩn

Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin sunphat nồng độ 1 mg/ml, tính toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1

- 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 µg/ml trong các bình định mức có thể tích 20 ml sau đó thuỷ phân bằng kiềm, đun cách thuỷ cho sôi 10 phút, để nguội rồi cho

2 ml dung dịch thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2%, định mức bằng nước cất đến 20 ml rồi để sau 20 phút mới tiến hành đo

Cách pha :

Sử dụng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin có nồng độ 1mg/ml (gọi là dung dịch A)

- Pha dung dịch streptomycin nồng độ 10 µg/ml: lấy 1ml dung dịch A, pha loãng và định mức bằng nước cất đến 100 ml (dung dịch này gọi là B)

- Pha dãy dung dịch chuẩn: Lấy 6 bình định mức có thể tích 20 ml cho lần lượt vào các bình từ số 1 đến số 6 một lượng như sau: 0,2 - 1,0 - 2,0 - 3,0

- 4,0 - 5,0 ml dung dịch B Thêm vào mỗi bình 2 ml natrihydroxyt 1N và lượng nước đến 10 ml Đun cách thuỷ cho sôi để thủy phân trong 10 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2% trong axit, lắc kỹ và định mức bằng nước cất đến 20 ml

- Như vậy, ta được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ là : 0,1 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 -2,5 µg/ml

o Mẫu trắng:

Mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điều kiện như mẫu phân tích nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho có cùng thể tích

o Tiến hành thử

+ Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút);

+ Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm Dùng mẫu trắng ở kênh

so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần;

+ Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D-C Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tương ứng ;

+ Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường chuẩn đã dựng được

o Tính kết quả

Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Co = (Cx V) / a Tính bằng g/g

Trong đó:

- a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g)

- V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml)

- Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn

III./ĐỀ XUẤT – GIẢI PHÁP

a.Hạn chế của thuốc kháng sinh :

Sự kháng thuốc

Trong số các bệnh thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những

vụ dịch bệnh có qui mô lớn Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh

để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc (antibiotic resistence) và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của vật nuôi như một chất kích thích sinh trưởng

Mặc dù thuốc kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và động vật , nhưng việc sử dụng bừa bãi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như gây độc , biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng bị kháng thuốc

b.Thay thế :

- Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra một giải pháp mới, hiệu quả thay thế cho việc sử dụng kháng sinh: MICROCIN – với thành phần chính là hợp chất Reuterin , được chiết từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri có hoạt tính sinh học cao, phổ kháng khuẩn rộng Sản phẩm này không gây hại cho động vật và con người, hơn nữa hoàn toàn không có ảnh hưởng xấu tới môi trường

- Reuterin được chiết bằng cách phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus reuteri kết hợp với công nghệ ghen tái tổ hợp để sản xuất ra enzyme được cố định có khả năng sản xuất số lượng lớn Reuterin Quy trình sản xuất Reuterin gồm nhiều công đoạn: lên men, tách chiết, phân đoạn, kiểm tra hoạt

lực Lactobacillus reuteri được lên men trong 24 giờ ở 37oCvới điều kiện yếm khí, sau đó ly tâm thu phần dung dịch trong, thực hiện quá trình tinh sạch Reuterin, thu các sản phẩm bằng phương pháp HPLC Cuối cùng kiểm tra hoạt lực của 3-HPA theo phương pháp MIC

c.Quản lý

Quản lý nhằm giúp tránh sự hình thành khả năng kháng đối với các loại kháng sinh hiện đang sử dụng Việc sử dụng cẩn trọng và có hệ thống các loại kháng sinh sẽ giải quyết được một nửa các vấn đề gây ra hiện tượng kháng thuốc kháng sinh Nên sử dụng các kháng sinh với liều lượng cao hơn một chút để cho toàn bộ hệ vi sinh vật bị giảm xuống trước khi những đột biến có cơ hội xảy ra Vấn đề cũng có thể được giải quyết bằng cách kết hợp hai loại kháng sinh khác nhau có hình thức tác dụng khác nhau lên vi sinh vật Lý do là các vi sinh vật rất ít có khả năng kháng được cả hai loại kháng sinh khác nhau

Những biện pháp trên không chỉ giúp cho việc loại trừ các vi sinh vật gây bệnh mà còn giảm nguy cơ hình thành các vi sinh vật kháng thuốc

Tài liệu tham khảo :

www.thanhnien.com.vn

www.wikipedia.org

www.ykhoa.net

Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản

Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005

Bài giảng về kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội

Trương Minh Hạnh, Bài giảng về công nghệ dược phẩm, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng,2007