Phân tích ADN ty thể của người để xác định cá thể và huyết thống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌG Tự NHIÊN PHÂN TÍCH ADN TY THE CỦA NGƯỜI ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ VÀ HUYẾT THÔNG ■ MÃ SỐ: QT 05-23 CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: CHU VĂN MAN ! ĐAi H O C Q U Ổ C GIA HÀ NÓI I 'S U N g ta m f HÒNG TIN 'H V ẺN : & 2Ể HÀ NỘI - 2005 ỈL Báo cáo để tà i QT 05-23 Tên đề tài: Phân tích ADN ty thể cùa nsười dể xác định cá thể huyết thốn MẢ SƠ: ỌT 05-23 Chủ trì đề tài: Chu văn Mẩn Các cán tham gia: - PGS.TS Nguyễn Văn Mùi ĐHKHTN, Đ H Q G Hà nội - CN Hoàng Thị Hồng Lê, Khoa Sinh ĐHKHTN ĐHQG Hà nội - Nguyễn Van Minh, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội Báo cáo để tà i QT 05-23 T ên đề tài: Phân tích ADN ty thể người để xác định cá thể huyết thống Mă số: QT 05-23 Chủ trì để tài: Chu Văn Mẫn Các cán tham gia: - PGS.TS Nguyễn Văn Mùi, ĐHKHTN, Đ HQ G Hà nội - CN Hoàng Thị Hồng Lê, Khoa Sinh ĐHKHTN Đ HQ G Hà nội - Nguyễn Van Minh, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG H nội M ục tiêu nội dung nghiên cứu: + Xác định phương pháp tách chiết ADN ty thê từ tóc rmười, góp phần vào việc giám định gen xác định quan hệ huyẽì ihốns nhận dạng cá người + Giải trình tự ADN ty thể từ thân tóc người Các kết đạt được: + Đã xác định phương pháp tách chiết A DN ty thể từ thân chân tóc người việc sử dụng dung dịch Chelex 10% dung dịch DTT Sản phẩm thu có đủ độ để nhân cặp mồi ty thể L I 5965 H I 6491, L I 5997 H I 6401 đoạn HV1 + Đ ã hồn thiện quy trình kỹ thuật nhân ADN ty thể cặp mồi L I 5965 H I 6491, L I 5997 H I 6401 từ tóc người Việt + Giải trình tự nucleotit đoạn ADN sản phẩm nhân mồi LI 5997 từ thân tóc cá thể gia đình hệ cho kết quả: - Giữa bà ngoại mẹ khơng có khác biệt vùng siêu biến HVI - Giữa mẹ (và bà ngoại) có khác cặp nucleotit vị trí 143 (theo trình tự ADN người vị trí 16175 hệ gen ty thể chuẩn) cặp A-T, bà mẹ cặp G-C - Giữa bố có tới cặp nu khác vị trí 18(trons; hệ gen tv thể chuẩn vị trí 16050), T bố G: vị trí 91 (trong hệ gen ty thể chuẩn vị trí 16123) G ,và bố C: vị trí 145(trong hệ°en tvthể chuẩn vị trí 16175) A bố G: vị trí 292 (trong hệ ơen tythể chuẩn vị trí 16324)của A bố G Kết luận: dung dịch DTT dùng để tách chiết ADN từ thán tóc người, giải đươc khó khãn nghiên cứu xác định cá thể huyết thống mẫu vật bị phân huỷ, nghiên cứu hài cốt cổ nhãn Kết trẽn cho thây khác biêt di truyền hệ sen ty thể dòng bà-mẹ-con gái bố - gái Đổng thời vùng siêu biến HVI (được đãc trưng bằns cặp mồi sử dun2 Lí 5965 H I 6491 L I 5997 H I 6401) thực vùna có nhiều biến đối o' cấp độ phán tử, điểu cho phép xác định xác lới mức cá -Tình hình kinh phí đề tài: T o n s kinh phí cấp: M ua hố chất, dụng cụ: Th khốn chu vén mơn: Thơng tin liên lạc vãn phịng phẩm: Qn lý hành chi phí.khác: 20 000000 đ 12 000000 đ 000000 đ xooooo đ 200000 đ Báo cáo để tà i QT 05-23 Subject o f scientific research 2005 Tile: Analysis mitochondria DNA of human for individual determination and dercent ■’ C ode: Ọ T 05-23 Leader o f reasearch: Chu Van Man Reasearch o f cooperation: Dr Nguyen Van Mui; Bs Hoang Thi Horn: Le; Nguyen van Minh O bject and contens o f research: + Establish a method to isolate mitochondrial DNA from human hair, gene determination in the dercent relationshif and human identities + DNA sequencing from human hair trunk R esults o f reasearch: + The method to isolate mitochondrial DNA from human hair been established by using 10% Chelex solution and DTT Obtained products were pure anough to amplify mitochondrial primers LI 5965 and HJ6491, L I 5997 and H I 6401 at HVI fragment + Completion of mitochondrial DNA amplifying protocol by mitochondrial primer sets, L I 5965 and H I 6491, L 15997 and H I 6401 two from Vietnamese human hair trunks and root + Nucleotide sequence from Iv 15997 amplifvins products from hair trunks of person beloneins to a 3-2eneration family save the followina results: * There was no difference between the supervarianble region HVI mother and gxandmather % Between child and mather (and orandmother) there was a difference of one nucletide at position 143 (according to the DMA sequence of the child and at position 16175 according to the mitochondria DNA sequence of human) A-T in child and G-C in mother * Between child and father, there was different nucleotides at following positions: nucleotide T in child and G in father at position 18 (at position 16050 according to the mitochondria DNA sequence of human); G in child and c in father at position 91 (at position 16123 according to the mitochondria DNA sequence of human): A in child and G in father at position 145 (at position 16175 according to the DNA mitochondria sequence of human); A in child and G in father at position 292 (at position 16324 according to the mitochondria DNA sequence of human) Báo cáo đê tà i QT 05-23 * In conclusion, DTT solution used to isolate DNA from human hair trunks solve the problems in, determining identity and dercent relationshif while samples were decomposed Results of DNA sequence show the differences in mitochondrial genomes among grangmather - mother - daughter and father - daushter In addition, the supervariable regiong HVI (specialised by two primer sets, L I 5965 and H16491, L15997 and H16401) is really a regions with lots of molecular variations, allowing the accurate determination of indentities Xác nhận BCN Khoa Sinh học Chú trì đề tài PHÓ CHỦ NHIÊM KHOA POSTS tyẨ tu i ĩotú m Ẩ yẲ Ịa Xác nhặn Trường PHÔ HlÊu ĨRUỎNG P S S T S '^ f ể J o M í n Ắ Báo cáo đề tà i QT 05-23 1- M ỤC LỤC 1- Mục lục 2- Các chữ viết tắt 3- Lời mờ đầu 4- Nội dung 4.1 - Lịch sử nghiên cứu 4.2- Các rối loạn chức ty thể 4.3- Giám định ADN khoa học hình pháp y 4.4- Nghiên cứu ADN ty thể Việt Nam 4.5- Sinh học phân tử ứng dụng khoa học hình 5- Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 5.1- Nguyên liệu, hoá chất thiết bị 5.2- Phương pháp nghiên cứu 6- Kết thảo luận 6.1- Tách chiết ADN 6.2- Sản phẩm PCR nhuộm bạc 6.3- Phương pháp tách chiết ADN chân tóc người sử dụng dung dịch Chelex 6.4- Phương pháp tách chiết ADN chân tóc người sử dụng dung dịch DTT 7- Kết luận dể nghị 8- Tài liệu tham kháo 9- Phụ lục trang 6 8 10 12 12 13 15 15 17 22 22 22 24 27 38 39 41 C Á C C H Ữ V IẾ T T Ấ T ADN ADNmt Bp CI DTT dNTPs: EDTA: HV1 HV2 NST PCR RFLP TE MED Axit deoxyribonucleic Gen ty thể (Mitochondrion DNA) Cặp bazơ nitơ ( Base pairs ) Chloroform : isoamyalcohol (24:1) Dithiothreitol Các deoxyribonucleotit ỉthylen Diamin Tetra Axetic Đoạn siêu biến (Hyperariable) Đoạn siêu biến (Hyperariable) Nhiễm sắc thể Phản ứng chuỗi trùng hợp Đa hình mảnh cắt giới hạn (Polymerase Chain Reaction) N,N,N.N Tetra Methyl Ethvlen Diamin Báo cáo đề tài QT 05-23 * ' /s - LỜI MỞ ĐẨU Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật công nghệ thông tin vào nhữns năm cuối kỷ XX - đầu kỷ XXI Sinh học phân tử Côn2 nghệ gen có bước phát triển nhảy vọt, đặc biệt việc giải mã °en người Bộ gen người gồm phần : Bộ sen nhãn (23 cặp nhiễm sác thê = 3.2 tý bp) gen tế bào chất (genome ty thể - 16569 bp) Việc giai mã gen ty thê góp phần lớn việc chẩn đốn, điều trị bệnh liên quan đến di truyền ty thể, khoa học hình pháp y Trinh tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể người có kích thước 16569 bp cơng bố vào năm 1981 Cho đến nay, có hàn2 ngàn trình tự đoạn gen ty dân tộc khác giới giải mã đăn° ký trona ngân hàng trình tự gen quốc tế : EMBL/EBI (Anh), Gcnbank (Mỹ) Hệ °en ty thẻ ]à kiểu đơn di truyền hoàn toàn theo mẫu hệ cơng cụ hữu hiệu để phản tích di truyền quần thể người Hiện nay, người ta biết đến hàng trăm bệnh di truyền ty thể đột biến ADN Phân tích đột biến ADN ty thể dùng để chẩn đốn nhanh xác hướng điều trị số bệnh Xác định so sánh trinh tự ADN ty thể, đoạn siêu biến (hypervariable) H V HV2 D-Loop phương pháp có độ tin cậy cao xác, sử dụng rộng rãi khoa học hình pháp y giới đễ giám định cá thể huyết thống Vì nên việc nghiên cứu ADN ty thể có ý nghĩa thực tiễn cao Nhưng thời gian mục đích cho phép nén chúng tơi tiến hành đề tài dựa ứng dụns vào khoa học hình pháp V Cơng nghệ gen ứng dụna vào khoa học hình giới biết đến lẩn vào nãm 1985 nhờ cơng trình nghiên cứu Alex Jeffrey cộng Đâv cơng nghệ có tính đột phá khoa học hình sự, giúp giải vụ án tưởng chừne bế tắc Tuy nhiên, nước ta việc ạiám định ADN ty thể xác định huyết thống bắt đầu Ngoài số đề tài Viên cơng nghệ sinh học Viện khoa học hình - Bộ Cơng an dã tiến hành giám định ADN ty thể sử dụng tổ hợp cặp mồi cho đoạn siêu biến H V l,để giải nhừns vụ việc mang tính hình s ự n h u n a chưa có tính chất phổ cáp rộns rãi Xuất phát từ tinh hình trẽn mà chúns tiến hành thực đề tài “Phân tích ADN ty người dể xác định cá thê huyêt thốns nhằm góp phán vào việc giám định gen xác định quan hệ huyết thốn" nhận dang cá thể người Báo cáo để tà i QT ()o-23 4- NỘI DUNG CHÍNH 4.1 Lịch sử nghiên cứu Bộ gen người gồm phần : Bộ gen nhân (23 cặp nhiễm sãc thể = 3.2 tỷ bp) gen tế bào chất (aenome ty thể = 16569 bp) 4.1.1 Cấn trúc A D N /V the lìgười Ty thê (phần lớn bào quan có chứa enzym chịu trách nhiệm san xuất nãng lượng) quan tử sán xuất nãns lượng tẽ bào Ty thể thường có dạng thn dạnơ hình trứng Ở cá tê bào thực vật tế bào động vật có chứa ty thể Sô' lượng ty tế bào thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, có vài ty thể tế bào biểu bì hàng nsàn ty thể tế bào vân Khơng giống bào quan khác, ty thè có màng riêng biệt M àns tương đối xốp, có chứa protein gọi Porin Tuv nhiên, màng trono kháng tập trung lon cực âm có phospholnpid gọi Cardiolopin Ngồi ra, màng cịn tính xoắn cao với cấc nếp gấp iĩọi cristae, chúng làm cho diện tích bể mặt tiếp xúc cùa tế bào tăng lên Màng có enzym xúc tác cho q trình hơ hấp tế bào, qua để cung cấp lượng cho tế bào [20] Không gian trona màng gọi chất gian bào chất gian bào màng trong, chuỗi phản ứng hoa học xảy để cung cấp lượng cho tế bào Đường axit béo bị phân huv thành hai đơn bị cacbon, sau vào chuồi phản ứng axit citric hay chu trình Krebs Đường bị phán huỷ tế bào chất axit béo bị phân huỷ ty chu trình p oxi hố Chu trinh axil citric sinh electron đẽ vào chuỗi vận chuyển điện tử Tiếp theo, trình sản xuất nàng lượna proton sinh electron thông qua chuỗi vận chuyển điện tử, trình cịn gọi q trình tổng hợp ATP - nãng lượng sinh học đáu tiên hệ thống sinh vật học ADN có màns sinh chất khác biệt so với ADN trons nhãn tế bào ADN ty tổn tron2 NST đơn mạch vịna hồn ADNmt có kích Ihưóc 16569 bp 2ồm 37 sen ADNmt mã hoa cho 13 polypeptit trons chuỏi hỏ hấp ADN ty thê mã hoá cho protein phức hệ I IV chuỗi vận chuyến điện tử Như biết, ADNmt cũna mã hoá cho ARNr cho cá trinh tống hợp ATP Ngồi ra, ADN ty có chứa cytochrom B đay yếu tố quan trọng khác kh ôn thiếu chuỗi vận chuyên điện tử mà ADNmt mã hố phẩn ADN nhân mã hoá nốt phán cịn lại [20], Hệ gen ty thể hồn chỉnh nsười đẩu tiên Anderson tác si ả khác tai Cambridse (Anh) công bô vào năm 1981 chinh sửa lại vào năm 1999 (Anderson cl uì., 1981; Andrew ct ư! 1999) Đãv hệ sen ty thê cua đai diên nsưòi đa tráng coi trình lự chn Cho đến nav có 186 trình tự hồn chinh “ínom e ty na ười ihuộc ch Ún" tộc dán tộc khác n°hiẽn cứu đãns kv trona Nsũin hàne trình lự aen quốc tế EMBL (EBI)/Genbank/DDBJ(Insman 2003) Các cons bố cho thấy trình tự ADN t\ cua chúng tộc dân lộc khác có nhữna khác biệt định, v ề cấu trúc, aenome ty ihế người phán lử ADN mạch vòns, bao gồm 37 sen mã hoá cho 13 chuỗi polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào 22tARN 2i ARN dược di truyén theo mầu hệ [6] Sơ đổ hình ! Báo cáo đề tà i QT 05-23 KS ATPase 8/6 ■ C o m p lex I ItRHAạ I ICytochrome b im Complex H I rRNAs Hình : Cấu trúc ADN tv ó' người 4.1.2 Q trình tiến hóa A D N ty th ể người Do đặc điểm : di truyền theo mẫu hệ, mức độ đột biến cao số lượng bún lớn không tái tổ hợp ADN ty công cụ híĩu hiệu cho nghiến cứu tiến hố người Các biên ADN ty the trung tính tránh khỏi khơng bị loại bỏ q trình chọn lọc tự nhiên đẽ trở thành phố biến theo xu di truyền Nghiên cứu phân loại nhóm kiểu đon/nhóm đơn bội hay dịng pha hệ tiến hành sớm vào đầu thập kỷ 80 sở sử dụng enzvm hạn chế đế cắt ADN ty thê người sau tách tinh (Brown, 1980; Denaro et £// 1981: Johnson et £//.,1983, Cann