Nghiên cứu tuyển chọn một sốchủng vi khuẩn Bacilluscó hoạt tính enzyme proteaza kiềm

Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus, hoạt tính enzyme proteaza kiềm

i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS – TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS. Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Hà Nội, tháng 6 – 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Như ii MỤC LỤC Trang Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đại cương về Bacillus .4 1.2. Protease .10 1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease 10 1.2.2. Ứng dụng của protease 12 1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam .15 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng – Vật liệu .17 2.1.1. Đối tượng .17 2.1.2. Vật liệu .17 2.1.2.1.Thiết bị .17 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l): 18 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease 18 2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường 19 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Phương pháp phân lập 19 2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển 19 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn .20 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc .20 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống .20 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram .21 2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử .22 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase 22 iii 2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620nm ) .22 2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein 23 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, BM .24 2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM .25 Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Phân lập chủng Bacillus 27 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc .27 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào 28 3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase .30 3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba chủng Bs, Bm và BM .31 3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên môi trường không có chất cảm ứng 33 3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 34 3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan .34 3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 35 3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .37 3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 37 iv 3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .39 3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .41 3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu amylaza 41 3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza 44 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan .47 3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu .50 3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế 51 3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men 54 Phần IV KẾT LUẬN .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO .58 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs .27 Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm 28 Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM .28 Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs 29 Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM .29 Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm 30 Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM 32 Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 36 Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 36 Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 37 Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 39 Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 40 Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 40 Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bs .42 Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bm .42 Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng BM .43 Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bs .44 vi Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bm .45 Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng BM .45 Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO 3 .49 Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO 3 .50 Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm và BM .51 Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong môi trường bột đậu tương có CaCO 3 55 vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra: .31 Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có chất cảm ứng .33 Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan .34 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan .34 Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan .35 Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein .38 Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein .38 Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein .38 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sự sinh trưởng trên môi 43 trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM 43 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO 3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM .46 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM 48 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO 3 .48 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM .52 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO 3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza trên môi trường có bột đậu tương 53 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn . nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn. Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật . Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học kỹ thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình. Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản . là nhờ khả năng sinh enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng. 2 Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau: 1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọn các chủng Bacillus. 2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính cao. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 3 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU [...]... nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm 340C trong 24h Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính Catalase Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 nồng độ 10% lên phiến kính, dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính Nếu chủng vi khuẩn nào sinh enzyme catalase... rồi đợi khô Sau đó đem đi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 22 Nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thi đó là vi khuẩn Gram dương Nếu vi khuẩn nhuộm màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm 2.2.3.4 Phương pháp xác định sự hình thành bào tử Để xác định sự hình thành bào tử của vi khuẩn chúng tôi tiến hành theo phương pháp sốc nhiệt: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường thạch trong 72h,... ứng dụng protease trong sản xuất ở Vi t Nam Ở Vi t Nam protease chịu kiềm cũng đang được nghiên cứu ở Vi n công nghệ sinh học thuộc trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại Học Bách Khoa Hà Nội, vi n Công nghệ Thực Phẩm, vi n Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh và một số trường Đại Học, Vi n nghiên cứu khác Nhiều ứng dụng của protease... tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng không có khả năng trao đổi chất nên 6 có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm [1] Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất... bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magie của axit ribonucleic Khi nhuộm phức tạp muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại Tryphenylmetan (Genlatin violet, Oryatan violet, Metyl violet) chịu được dưới tác dụng của cồn, nghĩa là không bị mất màu dưới tác dụng của cồn Những vi khuẩn như vậy gọi là vi khuẩn Gram dương, ngược lại những vi. .. có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích: protease acid, trung tính và kiềm tính Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7] Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi. .. sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng Để làm đông tụ sữa có thể dùng rennin, pepxin hoặc một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ sữa được tách từ nấm mốc và vi khuẩn Trong số các enzyme này, rennin là enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa... khuẩn Gram dương, ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi xử lý như vậy gọi là vi khuẩn Gram âm Cách tiến hành: Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn hòa vào giọt nước Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng Để giọt nước bay hơi dần như vậy vi khuẩn sẽ bị gắn chặt vào phiến kính... thạch, nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng Phương pháp này không cho phép xác định chính xác hoạt độ của các enzyme amylase, protease, nhưng cho phép định tính sự có mặt của các enzyme này nhanh và đơn giản  Kiểm tra hoạt tính Protease trên môi trường chứa cazein: Dùng thuốc thử HgCl2 1% đổ lên bề mặt môi trường nuôi cấy Nếu vi khuẩn sinh protease thì sẽ có một vòng trong... thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ vi c nghiên cứu Bacillus subtilis [13] Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 m Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [13] Khuẩn lạc khô, . hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm . Với các nội dung sau: 1. Phân. đã được tuyển chọn. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính cao. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Vi n Sinh