nghiên cứu ứng dụng multiplex pcr phát hiện sự hiện diện của e-coli và s.aureus mang gen sinh độc tố trong thức ăn nhanh tại tp.hcm

• Độc tố đường ruột enterotoxin và đặc điểm của nó: Độc tố enterotoxin là những protein ngắn do S.aureus tiết vào trong môi trường và là nguyên nhân chủ yếu trong các vụ ngộ độc thực ph

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHKT TRẺ

# "

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NCKH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR

PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI, S.AUREUS MANG GEN SINH ĐỘC TỐ TRONG

THỨC ĂN NHANH TẠI TP.HCM

Chủ nhiệm đề tài : ThS Diệp Thế Tài

Cơ quan chủ trì : Sở Khoa học – Công nghệ TP.HCM

TP HCM - 7 / 2007

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NCKH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR

PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI, S.AUREUS MANG GEN SINH ĐỘC TỐ TRONG

THỨC ĂN NHANH TẠI TP.HCM

( Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu )

Chủ nhiệm đề tài : ThS Diệp Thế Tài

DANH SÁCH CỘNG TÁC VIÊN

1 PGS TS Trương Thị Xuân Liên

2 ThS Phẩm Minh Thu

3 BS Nguyễn Thị Phương Lan

4 Th.S Trần Chí Thành

5 CN Nguyễn Thị Nguyệt

LỜI MỞ ĐẦU

An toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng đối với sức khỏe con người và ảnh hưởng đến đời sống của toàn xã hội Trong số những vụ ngộ độc do tác nhân vi

khuẩn, Staphylococcus aureus, Salmonella, E.coli là những tác nhân chiếm đa số

Trong quá trình trao đổi chất, các vi khuẩn này tiết ra các độc tố gây ngộ độc cho

người, ví dụ nhự S.aureus chỉ cần một lượng nhỏ độc tố < 1 µg là có thể gây độc cho

người

Hiện nay, các phương pháp xác định vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm, thường mất nhiều thời gian Mặt khác, khi những thực phẩm đã được xử lý, bằng phương pháp nuôi cấy khó xác định được sự hiện diện của chúng Tuy nhiên, độc tố

do vi khuẩn tiết ra vẫn còn hiện diện trong thực phẩm, đặc biệt là các độc tố bền với nhiệt, chúng không bị nhiệt phân hủy nên khả năng gây bệnh cho người vẫn còn rất cao

Gần đây, Becker và cộng sự đã dùng multiplex PCR để phát hiện các nhóm gen mã hoá độc tố cuả Staphylococcus Mehrotra và cộng sự cũng dùng mutiplex

PCR để phát hiện các gen mã hoá độc tố cuả Staphylococcus aureus (11) Luca

Cocolin và cộng sự (2000), cũng cho rằng dùng kỹ thuật multiplex PCR để khuyếch đại các gen mã hoá các độc tố khác nhau cuả vi khuẩn bằng những mồi chuyên biệt là một định hướng tốt cho việc phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen gây bệnh trong thực phẩm

Tại Việt nam, việc phát hiện các chủng E.coli và S.aureus mang gen sinh

độc tố còn chưa được quan tâm nhiều Và tỷ lệ hiện diện cuả các chủng này trong thực phẩm là bao nhiêu vẫn còn là một câu hỏi Vì vậy, đề tài nghiên cứu ứng dụng

multiplex PCR phát hiện các gen mã hoá độc tố E.coli, S.aureus nhằm mục tiêu:

1 Xâây dựng qui trình phát hiện E.coli và S.aureus mang gen mã hóa độc tố

2 Aùp dụng qui trình này phát hiện trực tiếp E.coli và S.aureus trong thức ăn

nhanh tại Tp.HCM

Thông qua việc tìm hiểu này, chúng tôi có thể đưa ra những cảnh báo về độ

an toàn của thức ăn nhanh, nhằm góp phần hạn chế những tác hại do thực phẩm không an toàn gây ảnh hưởng đến cộng đồng

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM:

I.1 Trên thế giới:

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề liên quan đến sức khoẻ cộng đồng Trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm có xu hướng ngày càng gia tăng Ngay cả những nước đã phát triển như Mỹ, Nhật, Pháp, các bệnh do ngộ độc thực phẩm gây ra ảnh hưởng nhiều đến sức khoẻ cộng đồng Số ca ngộ độc thực phẩm và các tác nhân gây ngộ độc có sự khác biệt giữa vùng và khu vực

Theo ước tính cuả tổ chức Food and drug Administration, Center for Food Safety & Applied Nutrition, hằng năm ở Mỹ có 76 triệu người nhiễm bệnh, 325 người nhập viện, và số ca tử vong do ngộ độc thực phẩm khoảng 5200 ca

Ở Pháp, số người nhiễm bệnh do ngộ độc thực phẩm cũng chiếm khoảng 17.378 người, và theo số liệu thống kê từ các ca ngộ độc do Staphylococcus trong 2 năm 1999 – 2000, các sản phẩm từ sữa đặc biệt là pho mát chiếm 32%, các sản phẩm từ thịt chiếm 22%, trứng và các sản phẩm từ trứng chiếm 11% ( Haeghebaert và cộng sự 2002)

Một nghiên cứu tại Cameroun với 400 mẫu bánh mì thịt lấy từ 200 điểm bán hàng trên đường phố có kết quả là 79,5% mẫu không đạt tiêu chuẩn vi sinh Trong

đó nhiễm 76,5% Coliformes, 69,25% E.coli, 21,5% Staphylococcus aureus và 9,25% Shigella, 4,75% Salmonella, 3,5% Bacillus cereu[18]

Ở Đài Loan, năm 1994 xảy ra 102 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.276 người

mắc, 42 vụ do Vibrio parahaemolyticus, 15 vụ do Staphylococcus aureus, 11 vụ do Bacillus cereus, 6 vụ do Salmonella [18]

I.2 Tại Việt nam:

Tại Việt Nam, theo Cục vệ sinh an toàn thực phẩm : Năm 2001 có 231 vụ ngộ độc với 3.036 người mắc và 61 người tử vong Năm 2002 có 194 vụ ngộ độc với 4.694 người mắc và 69 người tử vong Phân tích xét nghiệm cho thấy 50% các vụ

ngộ độc do nguyên nhân là thức ăn nhiễm khuẩn Ước tính trung bình người dân và

nhà nước đã thiệt hại khoảng 500 tỷ đồng/năm để xử lý các vụ ngộ độc này.[3]

Số vụ Số người mắc Số tử vong

Bảng I.1: Tình hình ngộ độc thực phẩm (1999 – 2006) tại Việt Nam

(Theo cục quản lý chất lượng VSATTP) Tại các khu vực của Việt Nam số ca ngộ độc thực phẩm xảy ra không đồng đều giữa các năm và các tỉnh thành

I.2.1 Khu vực miền Bắc, miền Trung, miền Nam:

Theo một nghiên cứu tại các chợ Hà Nội, nhìn chung 100% số mẫu thức ăn

bị nhiễm vi khuẩn hiếu khí, 80% số mẫu bị nhiễm coliform ở mức cao và không đạt tiêu chuẩn cho phép Có đến 28.6% số mẫu lòng lợn luộc và 16,1% số mẫu rau sống

đã nhiễm E.coli [5]

Số ca ngộ độc thực phẩm cũng xảy ra ở các khu vực miền Trung và miền Nam Theo báo cáo bệnh truyền nhiễm của Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên trong 3 năm từ 2001 đền 2003, cho thấy 39,9% số mẫu bị nhiễm vi sinh vật [8]

Tại Tiền Giang, số ca bệnh do ngộ độc thực phẩm là 3,43%, tỷ lệ chết là 1,2%, trong đó nguyên nhân chủ yếu do vi sinh vật chiếm 57,97%.[10]

I.2.2 Khu vực thành phố HCM:

I.2.2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm:

Tại TP Hồ Chí Minh, theo báo cáo của Trung Tâm Y Tế Dự Phòng TP Hồ

Chí Minh cho thấy tình hình ngộ độc thực phẩm của thành phố khá biến động Số ca ngộ độc thực phẩm trước năm 2000 ở mức thấp, từ năm 2000 trở đi, số ca ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng và các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh chiếm tỷ lệ cao Năm 1997 có 17/20 (85%) vụ ngộ độc do thức ăn, đồ uống bị nhiễm vi sinh vật vơí 578 ngươì mắc, tương tự 1998 có 10/14 vụ (71%) với 634 người mắc, 1999 11/16 vụ ngộ độc do ăn uống (68%) với 578 người mắc, hầu hết các vụ ngộ độc xảy ra tại các bếp ăn tập thể Năm 2000 có 3/7 vụ ngộ độc do thức nhiễm khuẩn với 295

trường hợp Từ năm 2002 đến 2004 đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ 66%[6] Năm 2005 có

1396 người mắc và 3 ca tử vong và tính đến tháng 10 năm 2006, có 1029 người mắc

050010001500

1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Số người mắc Số chếtBiểu đồ I.1: Tình hình ngộ độc thực phẩm tại tp.HCM trong 10 năm

I.2.2.2 Khu vực xảy ra ngộ độc:

Các khu vực xảy ra ngộ độc thường tập trung tại các quận ven trung tâm thành phố như quận Bình thạnh, quận Gò vấp, quận Củ Chi, và các quận vừa thành lập như quận 12, quận Tân Phú Các vụ ngộ độc thường xảy ra tại các bếp ăn tập

thể, khu công nghiệp và hộ gia đình , và số ca ngộ độc có người mắc trên 100 chiếm tỷ lệ cao

Hình I.1: Địa điểm xảy ra ngộ độc thực phẩm trong 3 năm gần đây (2004 - 2006)

II ĐỘC TỐ CỦA CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM :[7]

II.1 Độc tố E.coli :[7 ] E.coli là một trong số các tác nhân gây bệnh liên quan đến đường ruột.Tuy nhiên, không phải Escherichia coli nào cũng gây bệnh, các chủng E.coli gây bệnh, chúng thường tiết ra các độc tố ( Echeverria et al., 1989) Các nhóm độc tố E.coli

gây bệnh thường là EPEC, EHEC và ETEC (Levine, 1987) Dựa trên các nhân tố

độc lực người ta chia E.coli thành 5 nhóm khác nhau:

Mỗi loại E.coli tiết ra các độc tố khác nhau và có khả năng gây bệnh rất đa

dạng: tiêu chảy, viêm đường tiểu, viêm màng não…

II.1.1 Nhóm EaggEC : Một số chủng có khả năng tạo độc tố bền với nhiệt enterotoxin (ST) ( Savarino S.J 1993)

II.1.2 Nhóm EHEC:

Nhóm này có khả năng sinh ra độc tố Shiga (Shiga toxin) Độc tố này gồm hai loại: verotoxin (SLT1) và verocytotoxin (SLT2) Hiện nay, hai độc tố này còn được ký hiệu là Stx1 và Stx2 Stx1 khác Stx2 ở 3 nucleotit và một axit amin

Đây là nhóm gây bệnh tiêu chảy xuất huyết Chúng tiết ra các độc tố tế bào được biết là giống độc tố Shiga vì độc tố này giống với độc tố do Shigella dysenteriae tiết ra, độc tố còn được gọi là verotoxin 1 và 2 Khi bị nhiễm độc tố này người bệnh có thể tử vong Có hai loại độc tố thường gặp là stx1, stx2 Gen mã hoá cho độc tố này hiện diện trên nhiễm sắc thể

Hình I.2 Các gen mã hoá độc tố EHEC

II.1.3 Nhóm EIEC:

Nhóm này không có khả năng tạo ra enterotoxin như ở ETEC, nhưng chúng lại có khả năng phát triển rất nhanh và tạo ra enteroinvasive plasmid Chúng thường gây đau đầu, nôn mửa, ỉa chảy có đàm máu

II.1.4 Nhóm EPEC:

Nhóm này cũng không có khả năng tạo ra enterotoxin, mặc dù chúng cũng có khả năng gây bệnh cho người Đặc biệt chúng cò khả năng gây bệnh cho trẻ em dưới một tuổi

Hình I.3.: Các gen mã hoá độc tố EPEC II.1.5 Nhóm ETEC:

Chúng có khả năng tạo ra enterotoxin và có khả năng gây bệnh rất nặng ở người Độc tố của nhóm này rất nhạy cảm với nhiệt Ngoài loại độc tố nhạy cảm với nhiệt, chúng còn có khả năng tạo ra loại độc tố bền nhiệt

ETEC là một nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy mất nước thường gặp ở trẻ em

Chúng tiết ra hai loại độc tố ST ( độc tố bền với nhiệt) và LT ( độc tố không bền

với nhiệt) Những chủng E.coli gây bệnh này chúng có thể chỉ tạo ra một loại độc

tố LT, ST hoặc cả hai

™ Độc tố không bền với nhiệt:

LT là một loại độc tố oligomeric có cấu trúc và chức năng gần với độc tố của

Vibrio cholerae Có hai nhóm độc tố LT chính, LT-1 và LT-2 LT-1 được tiết ra bởi những chủng E.coli gây bệnh cho người và cả động vật Còn LT-2 chỉ được phát

hiện trên những chủng gây bệnh cho động vật, hiếm khi phát hiện được trên người Gen mã hoá cho độc tố LT là elt hay etx, những gen này hiện diện trên plasmid

™ Độc tố bền với nhiệt : Ngược với LT, ST là một loại độc tố nhỏ monomeric chứa nhiều cysteine, thông qua những custeine này hình thành những cầu nối disulfide giúp cho các độc tố này bền với nhiệt Gen mã hoá cho độc tố này đa phần hiện diện trên plasmid, nhưng một vài gen mã hoá cho độc tố này hiện diện trên transposons Có hai loại độc tố STa và STb Nhóm STa chỉ gây bệnh cho người, còn STb thường gặp chủ yếu trên động vật như heo

Hình I.4 Cơ chế gây bệnh cuả nhóm ETEC

Sau khi bám vào màng tế bào chủ, các độc tố được hoạt hoá, và di chuyển qua các tế bào thông qua hệ thống lưới golghi Đích tác động cuả LT là adenylate

cyclase nằm bên trong tế bào thành ruột Tiểu đơn vị A phân giải tạo thành hai tiểu đơn vị A1 và A2 Tiểu phần A1 hoạt hoá ADP cuả protein G Tiếp theo đó, protein

G hoạt hoá adenyl cyclase, làm gia tăng hoạt động cuả cAMP nội bào cAMP là một tín hiệu nội bào điều hoà những chất vẫn chuyển màng nội mô và những enzyme khác cuả tế bào chủ Gia tăng hoạt động cuả cAMp dẫn đến sự tiết các anion Cl- và HCO3-, giảm sự hấp thu Na+ và Cl-

Còn cơ chế hoạt động cuả ST thì ít được mô tả Tuy nhiên, ST cũng bám vào thụ thể GC-C trên màng và làm gia tăng hoạt động của cGMP,ø kết quả làm gia tăng sự tiết dịch và giảm hấp thu NaCl

II.2.Độc tố Staphylococcus aureus: [15,19]

Staphylococcus là loại cầu khuẩn gram dương Các tế bào của chúng thường liên kết với nhau thành hình chùm nho Chúng tạo ra độc tố enterotoxin Hiện nay,

9 loại enterotoxin của Staphylococcus đã được nghiên cứu đầy đủ Enterotoxin của tụ cầu là loại chịu nhiệt

S.aureus là một trong số các tác nhân thường gặp trong các vụ ngộ độc thực

phẩm Trong quá trình trao đổi chất, chúng tiết ra độc tố và gây ngộ độc cho người

Độc tố enterotoxin cuả S.aureus được chia thành 7 loại : SEA, SEB, SEC, SED, SEE ( Su YC et al., 1997) Phần lớn, các độc tố của S.aureus là độc tố bền nhiệt,

không bị phá hủy trong quá trình chế biến thực phẩm ( Tortora GJ, 1995) Trong số các loại độc tố trên thì SEA, SEB, SECs là những loại độc tố thường gặp

II.2.1 Độc tố :

II.2.1.1 Độc tố bề mặt:

Gồm các loại độc tố staphylosin (gồm α-hemolysin và β-hemolysin) , leukocidin, protein A, polysacharide vỏ

• α-hemolysin

Đây là một loại độc tố phá màng Độc tố là một monomer kết hợp với màng của những tế bào dễ bị độc Ở người, tiểu cầu và bạch cầu đơn bào nhạy với α-

toxin Những tế bào dễ bị độc có một thụ thể chuyên biệt cho α toxin và cho phép độc tố kết hợp tạo ra những lỗ nhỏ cho những ion đơn hoá trị đi qua Do đó, cách thức hoạt động của α toxin là phá hủy tính thấm chọn lọc của tế bào

Ngoài ra, leukocidin là một độc tố có chức năng diệt bạch cầu đa nhân và

chống lại sự thực bào của vật chủ và giúp cho sự xâm nhiễm của S.aureus dễ dàng

hơn

• Protein A :

Protein A là một protein bề mặt của S.aureus có khả năng liên kết với phân tử

IgG gần vùng Fc IgG là kháng thể của vật chủ, có nhiều nhất trong huyết tương gắn được với bổ thể và có thể trung hoà độc tố Trong huyết tương, vi khuẩn sẽ kết hợp những phân tử IgG với sự định hướng sai trên bề mặt của kháng thể này và điều này phá vỡ sự thực bào của vật chủ Những đột biến mất protein A làm thực bào hiệu quả hơn và giảm sự nhiễm độc tố

• Polysaccharide vỏ

Polysaccharide vỏ đặc trưng của S.aureus là polysaccharide A Polysaccharide

A có tính kháng nguyên và được phân biệt với polysaccharide B của S albus ( loài

không gây bệnh) bằng phản ứng miễn dịch Chức năng của vỏ trong việc gây độc không hoàn toàn rõ nhưng nó có chức năng ngăn cản sự thực bào

II.2.1.2 Độc tố gây triệu chứng:

• Độc tố Exfoliatin (ET):

Exfoliatin là độc tố kết hợp với hội chứng làm bỏng da, gây ra sự phân tách bên trong biểu bì giữa những lớp tế bào đang sống và những tế bào chết ở bề mặt tạo ra các vết bỏng

• Độc tố đường ruột enterotoxin và đặc điểm của nó:

Độc tố enterotoxin là những protein ngắn do S.aureus tiết vào trong môi trường

và là nguyên nhân chủ yếu trong các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bởi vi khuẩn này

Hiện nay, ngươi ta đã ghi nhận được 14 loại ngoại độc tố khác nhau gồm SEA, SEB, SEC, SED, SEG, SEH… SEO Trong đó, các độc tố gây ngộ độc thường gặp là SEA, SEB, SEC… Các độc tố có chung những đặc điểm về cấu trúc và trình tự acid amin Mỗi loại độc tố được mã hoá bởi một gen khác nhau và mức độ gây độc của các loại độc tố là khác nhau

Ngoại độc tố có tính chịu nhiệt cao và khả năng chịu nhiệt của chúng trong thực phẩm cao hơn trong môi trường nuôi cấy phòng thí nghiệm, các xử lý nhiệt qua chế biến thực phẩm thông thường không thể phá hủy được các độc tố

Ngoại độc tố hoà tan được trong nước và trong dung dịch muối, đặc điểm này giúp độc tố có thể nhiễm đựơc vào nhiều loại thực phẩm khác nhau Ngoại độc tố có tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme tiêu hoá như pepsin hay trypsin và vì vậy nó có thể duy trì đựơc hoạt động của nó trong hệ thống tiêu hoá của vật chủ

• Độc tố gây hội chứng shock TSST - 1:

S.aureus sản xuất độc tố TSST-1 gây ra hội chứng sốc do độc tố Biểu hiện

của hội chứng diễn ra một cách có hệ thống Đầu tiên, độc tố gây sốt nhanh, nôn mửa và tiêu chảy Sau đó là đau họng, đau cơ và phát ban rồi tróc da nhất là trong lòng bàn tay và bàn chân Huyết áp tăng đột ngột dẫn đến truỵ tim Hội chứng sốc

do độc tố có thể xảy ra ngay sau sự xâm nhiễm S.aureus nếu độc tố được phóng

thích với số lượng lớn và cơ thể thiếu kháng thể

Hình I.5 Cơ chế hoạt động của enterotoxin:

Độc tố có thể hoạt động theo hai dạng khác nhau là hoạt động sinh học và hoạt động miễn dịch Hai phương thức hoạt động này là hai chức năng riêng bịêt được định vị trên những chuỗi khác nhau của protein độc tố Hầu hết các trường hợp đột biến gen dẫn đến mất hoạt động miễn dịch thì cũng dẫn đến mất hoạt động sinh học và ngược lại

™ Hoạt động miễn dịch :

Sau khi độc tố vào máu thi hoạt động như một siêu kháng nguyên, siêu kháng nguyên không phải là một kháng nguyên thực sự vì nó không gây đáp ứng miễn dịch một cách bình thường

Kháng nguyên bình thường có khả năng liên kết một cách đặc hiệu với thụ thể kháng nguyên của tế bào T (TCR) và phân tử nhóm phù hợp mô (MHC II) của tế bào trình diện kháng nguyên APC

Siêu kháng nguyên độc tố không được xử lý và trình diện như kháng nguyên thông thường Chúng có khả năng trực tiếp liên kết với phần ít biến đổi trên chuỗi

vβ ( không thuộc vị trí nhân diện kháng nguyên) của hai phân tử TCR và MHC II

Do tính chất không đặc hiệu chặt chẽ này nên chúng hoạt hoá số lượng tế bào T và tế bào trình diện kháng nguyên Kết quả của việc hoạt hoá này là sản xuất hàng loạt cytokin như IL-1, TNF, IL -2… gây ra hôi chứng nhiễm độc thức ăn như sốt, nôn mữa…

Hình I.6 Hoạt động miễn dịch

™ Hoạt động sinh học:

Hoạt động sinh học gây ra các triệu chứng bìnht hướng của ngộ độc thực phẩm là nôn, mửa, tiêu chảy Cơ chế của hoạt động này là có thể do hậu quả của hoạt động miễn dịch nói trên đồng thời có thể do ngoại độc tố tác động trực tiếp lên màng ruột và dây thần kinh phế vị dẫn đến kích thích thành ruột gây tiêu chảy và kích thích trung tâm gây nôn mửa

III CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ E.COLI VÀ S.AUREUS:

III.1 Xác định độc tố ruột (ETEC) của E.coli [16]

III.1.1 Phương pháp truyền thống:

Việc xác định chủng E.coli thường được dựa trên cơ sở phát hiện độc tố LT,

ST Ban đầu ST được phát hiện bằng thử nghiệm thắt đoạn ruột thỏ Nhưng đây là phương pháp tốn kém và đã đựơc thay thế bằng phương pháp thử nghiệm tiêm độc tố vào dạ dày chuột ổ Phương pháp này đựơc xem là phương pháp chuẩn để phát

hiện Staphyloccocus trong nhiều năm

Phương pháp truyền thống để phát hiện độc tố LT dựa trên việc nuôi tế bào chuột tàu (CHO) hoặc tế bào thượng thận chuột Ý Độc tố LT làm tế bào chuột Ý co tròn và tế bào CHO bị kéo dài ra Phát hiện độc tố nhờ sự quan sát hình dạng tế bào nuôi

Về sau, một vài phương pháp miễn dịch đã sử dụng để phát hiện độc tố ST,

LT bao gồm phương pháp phân tích miễn dịch phóng xạ và phương pháp hấp phụ dùng men liên kết (ELISAs) hay còn gọi là phương pháp miễn dịch dùng men (EIA) Đây là phương pháp đựơc dùng khá phổ biến trong các phòng thí nghiệm Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu với một kháng nguyên và được gắn với một loại men nhất định Men liên kết trong thể tiếp hợp có tác dụng xúc tác cho một phản ứng hoá học, phản ứng này sinh ra một sản phẩm có màu từ cơ chất không màu Sản phẩm có màu này có thể phát hiện bằng mát thường khi cần kết quả định tính hoặc có thể đo bằng quang phổ kế hay khúc xạ kế khi cần kết quả định lượng

III.1.2 Phương pháp chuẩn đoán phân tử:

ETEC là một trong những vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được phát hiện bởi việc sử dụng các phương pháp chẩn đoán phân tử Năm 1982, người ta đã sử dụng có hiệu quả các mẫu dò DNA để phát hiện gen mã hoá ST và LT trong mẫu phân và mẫu môi trường bằng phương pháp lai phân tử Kể từ đó, mặc dù có nhiều phương pháp khác được đề nghị nhưng kỹ thuật phân tử vẫn thu hút sự quan tâm và được sử dụng nhiều hơn Cơ sở của hiện tượng lai phân tử là sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử và sự tái bắt cặp giữa các trình tự tương đồng sau đó Một trong hai trình tự bổ sung ( thường là trình tự đích, tức là trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên mô hoặc tế bào Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự bổ sung gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA Quá

trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ, thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường Tuy nhiên, việc sử dụng các mẫu dò để phát hiện các gen ST và LT gặp khó khăn khi phát hiện ETEC hiện diện ở mức độ thấp và thời gian phát hiện vẫn dài

Một phương pháp sử dụng phổ biến và có nhiều ưu điểm hơn là sử dụng phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase ( polymerase chain reaction – PCR) Phương pháp này đã khắc phục các hạn chế của việc sử dụng mẫu dò và nâng cao hiệu quả của việc phát hiện ETEC Đặc biệt phản ứng multiplex PCR có khả năng

phát hiện cùng lúc nhiều E.coli gây bệnh khác nhau

III.2 Xác định độc tố S.aureus:[11]

III.2.1 Các phương pháp miễn dịch:

Những phương pháp hiện nay dùng để phát hiện ngoại độc tố enterotoxin

của S.aureus hầu hết là các phương pháp miễn dịch dựa trên nguyên tắc sử dụng

kháng thể đơn dòng và đa dòng như kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA), kỹ thuật

miễn dịch men (ELISA), và kỹ thuật ngưng kết…[20]

III.2.2 Kỹ thuật miễn dịch men (ELISA):

ELISA là phương pháp được quan tâm nhiều trong số các phương pháp miễn dịch do tính đơn giản và có thể sử dụng hầu hết cho các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Nguyên tắc kỹ thuật ELISA trong phát hiện độc tố là sử dụng kháng thể đặc

hiệu cho một loại độc tố của S.aureus hấp phụ lên giá thể rắn, sau đó bổ sung mẫu

thử nghiệm độc tố và một kháng thể thứ hai đặc hiệu với độc tố có gắn enzyme, cuối cùng bổ sung cơ chất đặc hiệu cho enzyme, nếu có sự hiện diện của loại độc tố cần phát hiện thì enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất tạo ra sản phẩm có màu hay phát sáng [11]

Hình I.7.: Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA [11]

Một sản phẩm ELISA đã được thương mại hóa là bột Kit TECRA TM có khả năng phát hiện và định danh được các loại độc tố enterotoxin A, B, C, D, E của vi

khuẩn Staphylococcus aureus [11]

III.2.3.Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ(RIA): [4]

Nguyên tắc kỹ thuật RIA gần giống như kỹ thuật ELISA nhưng kháng thể phát hiện được đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của kháng nguyên độc tố được phát hiện bằng tín hiệu phóng xạ

III.2.4.Kỹ thuật ngưng kết: [9]

* Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động ngược (RPHA):

Nguyên tắc của RPHA là kháng thể đặc hiệu được gắn với tế bào hồng cầu, khi gặp kháng nguyên là độc tố cho phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên, kháng thể xảy ra và có thể quan sát hiện tượng ngưng kết các hạt hồng cầu bằng mắt thường

Phương pháp này dễ thực hiện nhưng có nhiều trường hợp không cho phản ứng đặc hiệu Do đó, phương pháp được cải tiến bằng kỹ thuật RPLA

* Kỹ thuật ngưng kết latex thụ động ngược (RPLA):

Nguyên tắc: kháng thể được gắn với giá thể rắn là các hạt latex bằng nhựa polystyrene Khi mẫu thử có kháng nguyên là độc tố cần phát hiện thì phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể gắn trên hạt latex xảy ra tạo nên đám ngưng kết lớn

Kỹ thuật này được thương mại hóa thành bộ Kit SET-RPLA Đây là bộ Kit

được sử dụng để phát hiện các loại độc tố enterotoxin A, B, C, D của

Staphylococcus aureus trong nhiều loại thực phẩm

* Ưu điểm và hạn chế của phương pháp miễn dịch:

- Ưu điểm:

- Các kỹ thuật miễn dịch được thương mại hóa thành các bộ Kit như RPLA, TECRA TM có khả năng phát hiện nhiều loại độc tố enterotoxin của

SET-S.aureus với hiệu quả cao và ổn định

- Phương pháp miễn dịch chỉ cần lượng ít mẫu thử thực phẩm nên có thể tiết kiệm được thời gian và cho độ nhạy cao

- Hạn chế:

Mặc dù các bộ Kit thương mại rất tiện lợi nhưng giá thành quá cao nên khó thể áp dụng trên diện rộng

IV ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SHPT PHÁT HIỆN E.COLI VÀ S.AUREUS:

IV.1 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

Phương pháp miễn dịch với các bộ Kit thương mại cho hiệu quả ổn định nhưng giá thành cao nên khó thể áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vi sinh Trong khi đó, PCR không phải là phương pháp xác định trực tiếp độc tố

enterotoxin của S.aureus nhưng có khả năng phát hiện gen sinh độc tố mã hóa cho

các loại độc tố tương ứng Mặt khác, hiện nay PCR là kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng phổ biến và đem lại hiệu quả cao

* Nguyên tắc: [4],[13]

Phương pháp tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của DNA polymerase và một cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với một trình tự DNA đích Độ dài đoạn DNA tổng hợp được giới hạn bởi hai đoạn mồi

* Quy trình:

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1 (biến tính): phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94-95°C Mạch đôi DNA đươc tách ra thành dạng mạch đơn Thời gian kéo dài từ 30-60 giây

Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn, thường nhiệt độ dao động trong 40 - 70°C tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polymerase- một enzyme chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút

Hình I.8.: Sơ đồ phản ứng PCR[13]

Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp

số nhân Khoảng 30 - 40 chu kỳ sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao

*Ưu điểm và nhược điểm: [13]

-Ưu điểm:

¾ Phát hiện gen sinh độc tố với một lượng mẫu nhỏ Độ nhạy cao

¾ Thời gian cho kết quả nhanh

IV.2 PCR đa mồi (Multiplex PCR): [13]

-Nguyên tắc:

PCR đa mồi là kỹ thuật sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để nhân bản nhiều đoạn DNA mục tiêu ở các vị trí khác nhau của bộ gen trong cùng một phản ứng PCR

-Ý nghĩa của PCR đa mồi trong việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm:

Việc phát hiện các mầm bệnh vi sinh đơn lẻ trong thực phẩm bằng phương pháp PCR thường gây tốn kém Do đó, các nhà nghiên cứu đang tìm cách giảm chi phí và thời gian bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR gọi là multiplex PCR để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau hoặc phát hiện đồng thời nhiều loại gen sinh độc tố của vi sinh vật gây bệnh

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

I VẬT LIỆU – THIẾT BỊ:

1.1.Vật liệu:

Bảng II.1: Các chủng chuẩn Staphylococcus aureus, E.coli :

- Bộ kit Roche dùng tách chiết DNA vi khuẩn

- Bộ hóa chất dùng thử nghiệm coagulase (STAPH-PLUS)

- Các mồi A, B, U được tham khảo từ công trình nghiên cứu của Tsen và

Johnson, Yamasaki, Hornes và cộng sự

Bảng II.2 : Mồi và kích thước khuyếch đại

khuếch đại

Kích thước đoạn gen khuếch đại

- Tủ lạnh -20°C - Kfroilabo

- Tủ lạnh 4°C - Sanyo Medicool

- Máy luân nhiệt PCR - Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9600

- Thiết bị điện di

- Máy chụp hình điện di - Biorad

- Máy vortex – Heidolph Top_mix 94323

- Eppendorf 200l và 1,5µl

- Pipetman 200µl, 100µl, 20µl…

- Que cấy, đèn cồn

II PHƯƠNG PHÁP:

II.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Các chủng phân lập từ mẫu thực phẩm và các thực phẩm thu thập tại tp HCM

II.2 Thời gian nghiên cứu :

- Từ tháng 12/2005 – 09/2006

II.3 Phương pháp nuơi cấy :

II.3.1 Thu thập và bảo quản chủng, mẫu :

Các chủng E.coli và S.aureus được thu thập trên các mẫu thức ăn và được lưu

giữ ở nhiệt độ -200C

Các mẫu thức ăn nhanh trên đường phố được thu thập một cách ngẫu nhiên tại các quận: 8,10,11,6,1,3, 5 Tổng số mẫu thu thập được là 94

II.3.2 Xác định E.coli :

a Nguyên tắc phân lập E.coli :

Dựa trên một số đặc tính sinh hoá của E.coli như : lên men đường, tạo khí, phát triển đựơc trong môi trường có muối mật Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường chuyên biệt Trên môi trường thạch EMB, sau 18 -24 giờ, chọn khuẩn lạc tròn, bờ đều, tím ánh kim và tiến hành sinh hoá sau: indol (+), đỏ methyl (+), Vosges Proskauer (-),citratsimmons (-) [13]

b Các bước tiến hành :

- Trên môi trường Endo, khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim, tròn, bờ đều có đường kính khoảng 0.5mm; trên môi trường EMB khuẩn lạc có mảu đỏ tía, có ánh kim… Trên môi trường MC, khuẩn lạc có màu phớt hồng, bờ đều chọn khuẩn lạc điển hình để thử các tính chất sinh hoá

• Thử các phản ứng sinh hóa:[1]

- E.coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit Để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác, phản ứng IMViC thường được sử dụng

• Indole : trong môi trường có tryptophane, E.coli nhờ có tryptophanase

sẽ ly giải tryptophane thành indole Để nhận diện indole, người ta nhỏ vào vài giọt thuốc thử Kowacs, hợp chất indole với thuốc thử có màu đỏ : indole : +

• Đỏ methyl (MR) : trong môi trường có glucose, E.coli tạo nồng độ H+

cao (pH <4,5) Cho thuốc thử đỏ methyl vào, môi trường có màu đỏ : MR :+

• Vosges – Proskauer (VP): tuỳ loại enzyme vi khuẩn có được mà quá

trình lên men glucose sẽ cho ra sản phẩm cuối cùng khác nhau Một trong số đó là acetoin, sẽ tạo phức hợp màu đỏ với thuốc thử α – napthol và KOH E.coli có

VP âm tính ( không có màu đỏ)

• Citrate : trong môi trường Simmons, nguồn carbon duy nhất là

citrate Vi khuẩn dùng citrate sẽ kiềm hoá môi trường làm đổi màu môi trường từ xanh lục sang xanh lơ E.coli có phản ứng citrate âm tính

II.3.3 Xác định S.aureus :[1]

a Nguyên tắc phân lập S.aureus: (theo tiêu chuẩn NF V08-057-1: 1994)

Quá trình phân lập S.aureus, dựa trên các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn này S.aureus sản xuất enzyme lécithinase tiêu hủy protein, enzyme này phát hiện được nhờ lòng đỏ trứng gà có trong môi trường nuôi cấy S.aureus sản xuất enzyme coagulase, có khả năng làm đông huyết tương thỏ Staphylococcus aureus là loại

cầu khuẩn gram dương xếp thành từng đám giống hình chùm nho, hiếu khí hay kỵ

khí tuỳ ý, không di động Tế bào có thể xếp cặp đôi hoặc chuỗi ngắn tuỳ môi trường nuôi cấy rắn hay lỏng

b Các bước tiến hành :

• Nhuộm gram : quan sát hình thể điển hình của staphylococci

• Nuôi cấy : thường dùng thạch máu hoặc Baid-baker Sau khi ủ

370C trong 18 giờ, quan sát hiện tượng tiêu huyết, sắc tố khúm Nếu bệnh phẩm có lẫn tạp khuẩn thì thường được nuôi cấy trên môi trường MSA ( manitol salt agar), môi trường này nồng độ NaCl 7,5% có thể ức chế phấn lớn những vi khuẩn khác ngoại trừ staphylococci

• Thử nghiệm catalase : dùng phân biệt giữa staphylococci và

streptococci Nhỏ một giọt hydrogen peroxide lên lam kính, sau đó đặt lên 1 khúm

vi khuẩn, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính

• Thử nghiệm coagulase : huyết tương có citrate của thỏ hay người

được pha loãng 1/5 rồi trộn với canh cấy vi khuẩn cùng thể tích, ủ ở 370C Một ống nghiệm khác đựng huyết tương trộn với 1 chất lỏng vô khuẩn ử ở 370C để làm chứng Nếu cục đông được thành lập sau 1- 4 giờ là thử nghiệm dương tính

• Các thử nghiệm kháng novobiocin, phosphatase, lên men mannitol… dùng phân biệt các staphylococci coagulase âm

II.4 Phương pháp sinh học phân tử :

II.4.1 Xây dựng kỹ thuật PCR trên chủng chuẩn:

A Lựa chọn mồi cho phản ứng PCR:

- Mồi khuyếch đại đoạn gen mã hoá độc tố S.areus :

Chúng tôi sử dụng trình tự mồi của nhóm tác giả Naresh K Sharma và cộng sự (2000) để khuếch đại các gen mã hoá độc tố Bộ mồi này gồm một mồi xuôi cho tất cả các gen mã hoá độc tố và mồi ngược có trình tự chuyên biệt cho từng loại gen mã hoá độc tố tương ứng Các mồi này được đặt tên là SEA, SEB tương ứng với loại

độc tố ruột A, và độc tố ruột B Kích thước sản phẩm PCR SEA là 270bp, SEB là 165bp

- Mồi khuyếch đại cho đoạn gen mã hoá độc tố E.coli

Mồi khuyếch đại gen mã hoá độc tố của E.coli được ứng dụng từ trình tự được thiết kế bởi Hornes E và cộng sự (1991), Yamasaki, S và cộng sự (1996) Các mồi sẽ khuyếch đại đặc hiệu cho từng loại gen mã hoá độc tố chuyên biệt, kích thước sản phẩm lần lượt là 147bp ( est), 708bp (LT) thuộc nhóm ETEC và 518bp

Đối với S.areus, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA theo qui trình Boom cải

tiến, quy trình tự thiết lập của phòng thí nghiệm và sử dụng bộ kit tách chiết của Roche

Đối với E.coli, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA theo hai quy trình : xử lý

nhiệt, và theo quy trình sử dụng bộ kit tách chiết của Roche

** Khuyếch đại đoạn gen cần tìm:

a Monoplex PCR cho S.aureus (PCR đơn mồi):

Để khảo sát khả năng bắt cặp đặc hiệu của các cặp mồi A/U để phát hiện

SEA và B/U để phát hiện SEB [do tác giả Tsen và Johnson công bố] với các trình

tự đích trên gen sinh độc tố sea, seb, chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR trên

những chủng S.aureus chuẩn cip 67.7 [có mang gen sea ], S.aureus cip 67.8 [có mang gen sea, seb], S.aureus T25 [có mang gen seb]

Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 50µl với các thành phần như sau:

Taq polymerase [5U/ml] 0,2µl

ƒ Đặt hỗn hợp vào máy luân nhiệt chu kỳ và chạy theo chương trình sau:

92°C 92°C

Hình II.1: Sơ đồ chu kỳ luân nhiệt phản ứng PCR

ƒ Sản phẩm PCR được phân tích bằng chạy điện di trên gel agarose 1.5% cùng thang DNA 100bp

b Multiplex PCR ( PCR đa mồi):

Ngoài việc phát hiện gen sinh độc tố sea, seb bằng những phản ứng monoplex

PCR (PCR đơn mồi) riêng rẽ Chúng tôi cũng tiến hành thử nghiệm quy trình multiplex PCR (PCR đa mồi) nhằm phát hiện đồng thời hai gen này trong một phản

ứng Quy trình multiplex PCR đã chọn được áp dụng cho các thử nghiệm tiếp theo Thành phần phản ứng multiplex PCR như sau:

Taq polymerase [5U/ml] 0,2µl

Chương trình khuếch đại giống như ở phần monoplex PCR

c PCR cho E.coli :

Tương tự như S.aureus, chúng tiến hành phản ứng monoplex PCR cho

từng mồi riêng lẻ, sau đó tiến hành multiplex PCR 3 mồi cho một phản ứng có các thành phần như sau:

Primer LT1/LT2 0,5 µl/ mỗi mồi

Primer AL 0,5 µl/ mỗi mồi Primer VT 0,5 µl/ mỗi mồi

d Kỹ thuật điện di trên gel agarose:

Sản phẩm sau phản ứng PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,5% ( trong thành phần gel có ethidium bromide) trong dung dịch đệm TBE 1X Thành phần chạy điện di gồm: