Khảo sát sự biến đổi 4-allylpyrocatechol diacetate và Chavibetol acetate thành Chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper bete l.)

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa, rất thuận lợi cho thực vật phát triển, trong đó có cây trầu. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, trầu trồng nhiều ở Hóc Môn, nổi tiếng là 18 thôn vườn trầu. Cây trầu có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới Châu Á, việc trồng trầu gắn liền với tập tục ăn trầu và làm thuốc chữa bệnh trong dân gian. Riêng ở Việt Nam, cây trầu đã đi vào truyền thuyết dân tộc, không thể thiếu trong nền văn hóa dân gian Việt Nam. Theo đông phương và y học cổ truyền, lá trầu có vị cay, nồng, tính ấm, mùi thơm hắc. Trong nước, chủ yếu người ta chỉ dựa vào truyền khẩu dân gian để nói lên tác dụng của lá trầu và cũng chỉ mới có vài nghiên cứu về tách chiết tinh dầu từ lá trầu. Cho đến nay, vẫn chưa có công trình nghiên cứu sâu nào về thành phần hóa học và sự chuyển đổi giữa các hợp chất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu. Do đó, đề tài này mong muốn góp phần nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu đồng thời khảo sát sự biến đổi của các hợp chất phenolic tùy theo phương thức xử lý lá trước khi chưng cất lá trầu. Thử nghiệm tính kháng oxi hóa của các hợp chất phenolic chính này.



TRẦN NGUYỄN NGỌC CHÂU

KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI 4-ALLYLPYROCATECHOL DIACETATE VÀ CHAVIBETOL ACETATE THÀNH CHAVIBETOL TRONG TINH DẦU LÁ

TRẦU HÓC MÔN (PIPER BETE L.)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Để hoàn thành được luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, ủng hộ và sự giúp đỡ tận tình của người thân, thầy cô và bạn bè

GS Nguyễn Xích Liên, TS Nguyễn Thị Ánh và TS.Nguyễn Trung Nhân những người thầy cô đã tận tụy, nhiệt tình hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ

em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn chú Huỳnh Kỳ Trân, chị Hà Mỹ Thuận, anh Nguyễn Khoa Nam, các anh chị Viện công nghệ đào tạo và phát triển, công ty mỹ phẩm Thorakao và công ty sắc ký Hải Đăng đã tạo điều kiện tốt, truyền đạt kinh nghiệm quý báu trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn quý Thầy, Cô Khoa Hóa đặc biệt là Quý Thầy Cô bộ môn Hóa hữu cơ đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kiến thức khoa học

bổ ích cũng như phương pháp nghiên cứu khoa hoc

GS.Võ Văn Chi, đã giúp em xác định tên khoa học của cây Trầu Không

Cuối cùng, là sự biết ơn sâu sắt đối với gia đình là nguồn động viên to lớn, luôn sát cánh và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong từng chặng đường đi qua cho đến khi hoàn thành luận văn này

Ký hiệu, chữ viết tắt Ý nghĩa

APC (4-allylpyrocatechol) Là một thành phần phenolic có trong lá trầu

CHV (chavibetol) Là một thành phần phenolic có mặt trong tinh

TLC (thin layer chromatography) Phương pháp sắc ký bản mỏng

MeOH (methanol) Dung môi, sử dụng trong thử hoạt tính thu gom

(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

Transfer

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

: mũi đa (multiplet)

Bảng 1.1: Thành phần hoá học của lá trầu 5

Bảng 2.1: Quy trình test MDA 41

Bảng 3.1: Thành phần hoá học của lá trầu Hóc Môn 42

Bảng 3.2: Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu già và non vùng Hóc Môn 43

Bảng 3.3: Hiệu suất và phần trăm các hợp chất phenolic trong tinh dầu theo cách xử lý lá trầu trước khi chưng cất 44

Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất APC 49

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 53

Bảng 3.6: Dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR của C1 và chavibetol được ghi trong cùng dung môi chloroform 54

Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 3 57

Bảng 3.8: Số liệu đường chuẩn của chavibetol 58

Bảng 3.9: Số liệu đường chuẩn của chavibetol acetate 58

Bảng 3.10: Số liệu đường chuẩn của 4-allypyrocatechol diacetate 58

Bảng 3.11: Số liệu đường chuẩn của APC 59

Bảng 3.12: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá trầu tươi 60

Bảng 3.13: Kết quả so sánh sự chuyển đổi ở lá tươi 62

Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá trầu khô 63

Bảng 3.15: Kết quả so sánh của lá khô 64

Bảng 3.16: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá trầu chưng cất bằng vi sóng 65

Bảng 3.17: Kết quả so sánh của lá tươi chưng cất vi sóng 66

Bảng 3.18: Thành phần tinh dầu trước và sau chưng cất lại của muối bão hòa 68

Bảng 3.19: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá tươi có thêm MgCl2 69

Bảng 3.20: Kết quả so sánh của lá tươi chưng cất không muối có thêm MgCl2 69

Bảng 3.21: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá tươi chưng cất không muối tại pH=8 70

Hình 1.1: Hình thái bên ngoài của cây trầu 2

Hình 1.2: Lá trầu 2

Hình 1.3: Hoa trầu 2

Hình 1.4 Hình ảnh cây trầu và vườn trầu của nhà Ông Tư Kích, tại địa chỉ: 56/1A Nguyễn Thị Sóc, tổ 5, ấp Hưng Lân, xã Bà Điểm, Huyện Hóc Môn 4

Hình 1.5: Khối phổ của eugenol, isoeugenol và chavibetol trong thư viện NIST 11

Hình 1.6: Tâm hoạt động của enzyme 20

Hình 1.7: Sơ đồ biểu diễn trung tâm hoạt động enzyme và vách kỵ thủy 21

Hình 1.8: Metyl hóa tại vị trí meta đuôi R của L-DOPA tránh xa vách kỵ nước 23

Hình 1.9A: O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí para 24

Hình 1.9C: O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí meta 24

Hình 2.1: Hệ thống chưng cất tinh dầu dùng trong nghiên cứu 27

Hình 2.2: Thiết bị phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS một tứ cực và sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MSba tứ cực 28

Hình 2.3: Sơ đồ chưng cất tinh dầu lá trầu bằng phương pháp truyền thống lôi cuốn theo hơi nước 29

Hình 2.4: Sơ đồ cách xử lý mẫu lá tươi trước khi chưng cất để theo dõi sự biến đổi của các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu 36

Hình 2.5: Sơ đồ cách xử lý mẫu lá khô trước khi chưng cất để theo dõi sự biến đổi của các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu 37

Hình 2.6 : Phương trình phản ứng của DPPH 38

Hình 2.7 : Phương trình phản ứng của MDA 40

Hình 3.1: Sắc đồ GC-MS của hợp chất APC do chúng tôi cô lập được 46

Hình 3.2: Sắc đồ và khối phổ MSMS của hợp chất 4-allylpyrocatechol 6 47

Hình 3.7: Các tương quan HMBC của hợp chất 3 56

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn khả năng bắt gốc tự do DPPH của 4 mẫu nghiên cứu 75

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế peroxy hóa lipid của 4 mẫu nghiên

cứu 77

Lời cám ơn i

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ii

Danh mục các bảng iii 3 3 Danh mục các hình vẽ, đồ thị iv

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.1 Mô tả thực vật 2

1.1.2 Phân bố sinh thái 3

1.2 Thành phần hóa học của cây trầu 5

1.2.1 Thành phần hoá học của cây trầu 5

1.2.2 Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu 8

1.2.2.1 Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu trên thế giới 8

1.2.2.2 Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu tại Việt Nam 9

1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng 12

1.3.1 Hoạt tính sinh học của lá trầu 12

1.3.2 Công dụng của lá trầu 16

1.3.2.1 Theo y học cổ truyền 16

1.3.2.2.Theo y học hiện đại 17

1.4 Tổng quan về Catechol O-methyltransferase 18

1.4.1 Cơ chế phản ứng 18

1.4.2 Cấu trúc tâm hoạt động 20

1.4.3 Độ chọn lọc của phản ứng 20

2.1.3 Dụng cụ và các thiết bị đo đạc 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Trích ly tinh dầu lá trầu bằng phương pháp truyền thống lôi cuốn theo hơi

nước 29 2.2.2 Các phương pháp xác định thông số nghiên cứu 30 2.2.2.1.Xác định hàm lượng tinh dầu có trong lá trầu 30 2.2.2.2.Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu bằng phương pháp

sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS 31 2.2.2.3.Cô lập 4-allylpyrocatechol (APC),chavibetol (CHV) bằng phương pháp

sắc ký cột và điều chế dẫn xuất 31 2.2.2.4.Định lượng APC trong phần nước còn lại sau khi đã chưng cất lấy tinh dầu lá trầu bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS 33 2.2.2.5 Định lượng chavibetol, chavibetol acetate, 4-allylpyrocatechol

diacetate trong tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 34 2.2.3 Theo dõi sự biến đổi của các thành phần phenolic chính trong tinh dầu lá

trầu theo các cách xử lý lá trước khi chưng cất 35 2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa 38 2.2.4.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm DPPH 38

2.2.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm malonyl

dialdehyd 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 3.1 Thành phần hóa học của lá trầu Hóc Môn 42 3.2 Khảo sát sự thay đổi của phần trăm chất 1,2 và 3 với cách xử lý lá trầu

trước khi chưng cất 44

3.2.1 Khảo sát sơ bộ sự thay đổi 44

3.2.3 Xây dựng các đường chuẩn 58

3.2.3.1 Đường chuẩn của chavibetol 58

3.2.3.2 Đường chuẩn của chavibetol acetate 58

3.2.3.3 Đường chuẩn của 4-allylpyrocatechol diacetate 58

3.2.3.4 Đường chuẩn 4-allylpyrocatechol (APC) 59

3.2.4 Định lượng sự chuyển đổi hợp chất 3 ra hợp chất 4 và 1 59

3.2.4.1 Định lượng ở lá tươi 59

3.2.4.2 Định lượng ở lá khô 62

3.2.4.3 Định lượng với mẫu chưng cất dưới vi sóng 64

3.2.5 Nhận định về sự chuyển đổi 66

3.2.5.1 Chưng cất tinh dầu trong nước khử ion 68

3.2.5.2 Chưng cất tinh dầu trong nước không có muối NaCl, nhưng có thêm muối MgCl2.6H2O 68

3.2.5.3 Ảnh hưởng của pH 70

3.2.6 Lý giải độ chọn lọc của phản ứng metyl hóa 72

3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học 73

3.3.1 Kết quả thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do DPPH 74

3.3.2 Khả năng ức chế peroxy hóa lipid của các mẫu nghiên cứu 75

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.1.1 Về mặt hóa học 78

4.1.2 Về hoạt tính sinh học 79

4.2 Kiến nghị 79

CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LUẬN ÁN 80

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa, rất thuận lợi cho thực vật phát triển, trong đó có cây trầu Ở Thành phố Hồ Chí Minh, trầu trồng nhiều ở Hóc Môn, nổi tiếng là 18 thôn vườn trầu

Cây trầu có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới Châu Á, việc trồng trầu gắn liền với tập tục ăn trầu và làm thuốc chữa bệnh trong dân gian Riêng ở Việt Nam, cây trầu đã đi vào truyền thuyết dân tộc, không thể thiếu trong nền văn hóa dân gian Việt Nam

Theo đông phương và y học cổ truyền, lá trầu có vị cay, nồng, tính ấm, mùi thơm hắc

Trong nước, chủ yếu người ta chỉ dựa vào truyền khẩu dân gian để nói lên tác dụng của lá trầu và cũng chỉ mới có vài nghiên cứu về tách chiết tinh dầu từ lá trầu Cho đến nay, vẫn chưa có công trình nghiên cứu sâu nào về thành phần hóa học và sự chuyển đổi giữa các hợp chất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu

Do đó, đề tài này mong muốn góp phần nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu đồng thời khảo sát sự biến đổi của các hợp chất phenolic tùy theo phương thức xử lý lá trước khi chưng cất lá trầu Thử nghiệm tính kháng oxi hóa của các hợp chất phenolic chính này

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

- Loài : Piper betle

Tên khoa học là: Piper betle L (piper betle Linn)

Cây trầu còn có những tên gọi khác nhau như betel pepper

hoặc betel vine (nước Anh), Pan (Ấn Độ), Phlu (Thái Lan),

sirih (Indonesia), trầu không hoặc trầu cay (Việt Nam)

Trầu không là một loài cây dây leo, thân là dây leo bám tạo thành từng đốt nối với nhau, cành hình trụ, nhẵn, có khía dọc, bén rễ ở những mấu nối Lá có hình trái tim, mọc so le, đầu lá nhọn dài, mặt trên

lá sẫm bóng, mặt dưới có gân lá nổi rất rõ, cuốn lá có bẹ kéo dài gần 1/3 đến đài của lá

Hoa mọc thành cụm hình đuôi sóc buông thòng ở kẻ lá trên thành cụm có hoa đực và hoa cái Hoa đực dài có cuống có lông, nhị 2, chỉ nhị ngắn, hoa cái dài hơn, cuống phủ lông dày, bầu có lông ở đỉnh

Hình 1.2: Lá trầu

Hình 1.1: Hình thái bên ngoài của cây trầu

Quả mọng tròn và cũng có lông ở đỉnh Tinh dầu của nó có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay.

1.1.2 Phân bố sinh thái:

Cây trầu có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới Châu Á, việc trồng trầu gắn liền với tập tục ăn trầu và làm thuốc chữa bệnh trong dân gian Riêng ở Việt Nam, cây trầu đã đi vào truyền thuyết dân tộc, không thể thiếu trong nền văn hóa dân gian Việt Nam Từ thời Vua Hùng, cách đây nhiều ngàn năm đã có truyện cổ về sự tích “Trầu cau”, và trong văn hoá Việt Nam từ

đó có tục lệ ăn trầu và dùng trầu cau làm lễ vật để xin cưới hỏi, nên hiện nay trầu được trồng khắp các địa phương ở Việt Nam

Trầu thuộc loại cây ưa ấm và ẩm, thích ánh sáng (nhưng cũng có thể mọc được trong bóng râm), dễ trồng, sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm Với nhiệt độ trung bình từ 22oC đến 26oC, lượng mưa từ 2000 – 3000 mm/năm hoặc hơn thì trầu phát triển tốt hơn Cây trầu thích hợp với các loại đất giàu hữu cơ, có thành phần sét cao, với độ pH từ 6 – 7 Vì trầu là một loại cây được trồng rất lâu đời nên quần thể giống trầu không đã được sưu tập để trồng nhiều loại giống khác nhau, tùy theo thổ nhưỡng

và sở thích của người tiêu dùng mà người ta chọn giống để trồng Hiện nay Ấn Độ là nước đã thu thập được nhiều giống trầu nhất, kế tiếp là Thái Lan (hằng năm Thái Lan xuất khẩu trên 4500 tấn lá trầu)

 Cách trồng, chăm sóc và thu hoạch trầu

 Cách trồng:

Trầu được trồng bằng dây (cắt đoạn thân cây trầu dài từ 40 cm – 50 cm đoạn thân phải có rễ mọc ra từ đốt nối) Đoạn thân trầu được cắt ra và phần đốt có rễ được vùi sâu xuống 20 cm – 30 cm nơi đất màu mỡ có đủ độ ẩm Nên đặt dây trầu dưới đất,

ở cạnh một cây đang sống hay cận tường, có thể làm giàn để dây trầu leo bám và phát triển

 Cách chăm sóc

Cây trầu trồng từ 3 – 4 năm thì ra hoa, quả Muốn cho cây trầu luôn tốt thì phải đủ độ

ẩm và thỉnh thoảng bón thêm phân, vôi bột và bồi thêm một lớp mỏng đất bùn vào gốc

 Thu hoạch

Nếu được trồng trên vùng đất tốt, có đủ ánh sáng và độ ẩm thì trong vòng 6 tháng người ta có thể thu hoạch được sản phẩm từ dây trầu Bộ phận dùng là lá và rễ

Lá được hái quanh năm, còn rễ được thu hoạch khi người ta dỡ cây trầu lên trồng lại

Riêng ở vùng đất Hóc Môn (18 thôn vườn trầu) để năng suất thu hoạch lá cao, người ta lên liếp và trầu được trồng dọc theo liếp, trên liếp thì cắm mọc ở chính giữa để dây trầu leo bám, hai bên liếp có đào mương để chống úng ngập khi trời mưa và dưới mương luôn có nước chảy ra vào theo triều cường lên xuống để tạo nên độ ẩm

Hình 1.4: Hình ảnh cây trầu và vườn trầu của nhà Ông Tư Kích, tại địa chỉ:

56/1A Nguyễn Thị Sóc, tổ 5, ấp Hưng Lân, xã Bà Điểm, Huyện Hóc Môn

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TRẦU:

1.2.1 Thành phần hóa học của trầu:

 Thành phần hóa học của lá trầu: [23]

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của lá trầu

Nước có hàm lượng thường từ 80% – 85% trong lá trầu Tanin gọi chung là hợp

chất polyphenol có mặt trong lá trầu từ 1,0% – 1,3% Các hợp chất phenol như

chavicol, chavibetol, -tocopherol, 4-allypyrocatechol[4] Alkaloid và glycoside theo tài

liệu thì không có trong lá trầu[23]

Các nguyên tố vô cơ trong lá trầu gồm Ca, P, sắt , Iod, Kali, Natri Các vitamin trong lá trầu gồm có caroten (tiền vitamin A), vitamin C,

nhiều vitamin nhóm B như thiamine, riboflavin và nicotinic acid

Chavibetol

Ngoài ra lá trầu còn có chứa 2-(3,4-Dihidroxyphenyl)ethanal;

3,4-Bis[4-hydroxy-5-oxo-6-peroxyclohexa-1,3-dienyl]hexa-1,5-diene[34]

Thân cây trầu có chứa các hợp chất như acid ursonic, acid 3- -acetylursonic,

piperlongguminine, triterpen[4]

Rễ cây trầu có chứa: Stigmast-4-en-3,6-dione ; 4-allyl resorcinol; aristololactam[27]

2-(3,4-Dihidroxyphenyl)ethanal 3,4- Bis[4-hydroxy-5-oxo-6-peroxyclohexa-1,3-dienyl] hexa-1,5-diene

Piperlonguminine Acid ursonic

α-Tocopherol

Aristololactam

4-Allyl resorcinol Stigmast-4-en-3,6-dione

Ngoài ra người ta cũng tìm thấy trong rễ cây trầu có β-sitosterol palmitate, diosgenin[4]

 Hoa: Thành phần của hoa rất đa dạng nhưng chủ yếu gồm 7 hợp chất phenol:

safrole, flavone, 2-hydroxychavicol tức 4-allylpyrocatechol, eugenol, methyleugenol, isoeugenol, quercetin Trong đó safrole là thành phần chủ yếu

Ngoài ra còn có một số hợp chất béo trong thân và lá cây[24]

CH3(CH2)34OH

CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH-(CH2)16CH3

1.2.2 Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu

1.2.2.1.Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu trên thế giới

Theo các tài liệu nghiên cứu thì thành phần tinh dầu lá trầu có chứa khoảng

15[16][40] đến 40 [11][32] hợp chất Tùy từng loài, hoặc từng vùng địa lý trồng khác nhau

mà thành phần tinh dầu trong lá trầu bao gồm 9 nhóm chất sau:[39]

monoterpene (như

terpinene, pinene, limonene, thujene, camphene), sesquiterpene (như cadinene,

elemene, caryophyllene, cubebene), alcohol (linalol, terpineol, cadinol), aldehyde

(như decanal), acid (hexadecanoic acid), oxide (như 1,8 cineole), phenol (như

eugenol, chavibetol, chavicol), phenolic ether (như methyl eugenol) và ester (eugenol

acetate, chavibetol acetate, chavicol acetate) Trong tinh dầu trầu các hợp chất phenolic

(eugenol, chavibetol, isoeugenol, eugenol acetate, chavibetol acetate, 4-

allylpyrocatechol diacetate, 4-allylpyrocatechol) chiếm tỷ lệ cao khoảng từ 25% – 70%

và là thành phần chính của tinh dầu lá trầu

OH

OMe

CH2CH=CH2

OMe OH

CH2CH=CH2

OH OMe

CH=CHCH3

OAc OMe

CH2CH=CH2

OMe OAc

CH2CH=CH2

OAc OAc

CH2CH=CH2

 Rawat A.K.S và cộng sự,[39] nghiên cứu có 51 thành phần hóa học được nhận danh trong 5 loài trầu “Meetha”, “Bangla”, “Kapoori”, “Sanch”, “Khasi” Dựa vào đặc

điểm hình thái học để phân loại chúng Eugenol có mặt trong cả 5 loài trên và là thành

phần chính quan trọng nhất, thành phần này có mặt nhiều nhất ở loài “bangla” 63,31%

Cũng ở loài trầu “bangla”, tác giả Rathee J.S và cộng sự[35]

khô của cây trầu bằng dung môi ethanol, thu được cao chiết có chứa allylpyrocatechol (APC), chavibetol (CHV), cùng với các glucoside tương ứng của chúng Trong đó, APC là thành phần có hàm lượng nhiều nhất, và có tính kháng oxi hoá mạnh nhất, tương tự như -tocopherol

4- Theo Rimando A.M và cộng sự,[40] thành phần hoá học của lá trầu Philippine gồm 14 chất được nhận danh bởi GC/MS và sắc ký bản mỏng (TLC) Thành phần chính của tinh dầu lá trầu trích ly bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước là chavibetol (53,1%) và chavibetol acetate (15,5%) Trong khi đó, APC (2,38%) là thành phần chủ yếu được cô lập trong dịch chiết ethanol của phần bã còn lại trong bình cầu sau khi chưng cất tinh dầu bằng lôi cuốn hơi nước

 Theo Li-Chung M.R và Jiau-Ching H,[32] tinh dầu trầu Đài Loan có eugenol (36,2%), chavibetol acetate (16,9%), 4-allylphenyl acetate (9,6%), 4-allylphenol

(7,2%), 4-allylpyrocatechol diacetate (5,4%)

 Theo Bajpai V và cộng sự,[13]

tinh dầu trầu Ấn Độ khi được phân tích bằng kỹ thuật khối phổ đo ở thời gian thật cho thấy các hợp chất 4-allylphenol, 4-allylphenyl acetate, chavibetol, chavibetol acetate, 4-allylpyrocatechol diacetate

 Theo Bin Jantan E.I và cộng sự,[16]

tinh dầu trầu Malaysia Piper betle L có

4-allylphenol (6%), chavibetol (69%), eugenol acetate (8,3%), 4-allylpyrocatechol diacetate (0,2%)

1.2.2.2 Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu tại Việt Nam

 Các tác giả Bùi Ngọc Minh Phượng và các cộng sự đã trích ly tinh dầu từ lá trầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng để xem ảnh hưởng của vi sóng lên thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu.[11]

Từ lá trầu tươi, sử dụng dung môi là nước trích ly tinh dầu theo 2 phương pháp:

- Phương pháp vi sóng: lá trầu tươi, cắt nhỏ, cho vào nước với tỉ lệ khối lượng

(1 nguyên liệu : 4 nước), cho hỗn hợp nguyên liệu và nước vào lò vi sóng ở chế độ công suất 600 W, thời gian chưng cất là 10 phút, hiệu suất tinh dầu thu được là 0,45%

(tính theo khối lượng lá tươi), thành phần hóa học chính của tinh dầu (phân tích bởi GC/MS) là 4-allylpyrocatechol diacetate (68,71%), eugenol acetate (19,83%) và isoeugenol (7,48%)

- Phương pháp lôi cuốn theo hơi nước: lá trầu tươi được cắt nhỏ cho vào nước với

tỉ lệ khối lượng (1 nguyên liệu : 4 nước), sau đó chưng cất lôi cuốn hơi nước hỗn hợp này trong 7 giờ, hiệu suất tinh dầu thu được là 0,168% (tính theo khối lượng lá tươi),

và thành phần hóa học chính của tinh dầu là 4-allylpyrocatechol diacetate (10,91%) và isoeugenol (41,52%)

Từ thí nghiệm theo hai phương pháp nêu trên, tác giả đã chỉ ra có sự khác biệt

về mặt thành phần hóa học của tinh dầu khi có sự hỗ trợ của vi sóng trong quá trình chưng cất tinh dầu Hàm lượng 4-allylpyrocatechol diacetate tăng lên nhiều khi chưng cất có vi sóng Ngoài ra, hiệu suất tinh dầu khi chưng cất có vi sóng cũng cao hơn, mà thời gian chưng cất lại ngắn hơn nhiều so với phương pháp chưng cất không có vi sóng

 Tác giả Nguyễn Thị Lý và Trần Thị Hồng Vân[9] đã trích ly tinh dầu lá trầu tươi bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước có thêm muối vào quá trình chưng cất, với tỉ

lệ khối lượng (1 nguyên liệu : 2 dung dịch muối 10%) , mẫu được ngâm 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó chưng cất 3 giờ, kết quả cho hiệu suất thu tinh dầu là 0,8% (tính theo khối lượng lá tươi), thành phần chính của tinh dầu là 4-allylpyrocatechol diacetate (42,2%), eugenol acetate (19,94%) và isoeugenol (19,82%)

 Theo Lê Thanh,[31] thành phần hóa học của tinh dầu (chưng cất từ thân rễ cây trầu lẹt trồng ở Huế) bao gồm khoảng 20 thành phần phân tích bằng GC/MS, trong đó thành phần chính là T-cadinol và T-muurolol, α-cadinol và α–cadinene

 Tác giả Đậu Xuân Đức và Hoàng Văn Lựu,[5] trích ly lá khô và rễ khô của cây trầu với dung môi là methanol (với tỉ lệ khối lượng 3 dung môi :1 nguyên liệu), cao chiết thu được đem chiết lần lượt với dung môi: n-hexane, chloroform, ethyl acetate,

n-butanol Ở phân đoạn ethyl acetate tác giả cô lập được 2 hợp chất 3-β-ol và furo[2,3-C]acridin-5-hydroxy-6-one

stigmast-5-en- Qua các tài liệu trên, có thể rút ra một số nhận xét nhƣ sau:

- Các cấu tử chính của tinh dầu trầu được báo cáo nhìn chung có nhiều điểm tương đồng trên khắp các nước có trồng trầu, điểm thống nhất là sự hiện diện của 4-allylpyrocatechol diacetate, điểm khác biệt là cho rằng hai thành phần phenolic

chính còn lại là eugenol và eugenol acetate, hoặc chavibetol và chavibetol acetate, hoặc eugenol và chavibetol acetate hoặc chavibetol và eugenol acetate hoặc isoeugenol và eugenol acetate trong tinh dầu trầu Sự khác biệt về thành phần có thể

do điều kiện địa lí khác nhau, cũng có thể do sự phân tích bằng GC/MS chỉ dựa chủ yếu trên sự nhận danh bằng khối phổ mà không dùng chất chuẩn thích hợp Thực chất,

thư viện NIST 2008 cho thấy eugenol, chavibetol, isoeugenol có khối phổ khá giống

nhau cũng như các ester của chúng (xem hình 1.5)

Hình 1.5: Khối phổ của isoeugenol và chavibetol trong thư viện NIST 2008

Nghiên cứu gần đây của nhóm nghiên cứu trong đó có chúng tôi tại Viện Phát triển Công nghệ và Đào tạo đã xác định rõ ràng bằng cách so sánh với chuẩn là các

phenolic chính trong tinh dầu của lá trầu (Piper betle L.) của huyện Hóc Môn, TP Hồ

Chí Minh, Việt Nam[28] gồm chavibetol 1, chavibetol acetate 2 và 4-allylpyrocatechol diacetate 3; 4-allylphenyl acetate và eugenol chỉ có ở hàm lượng rất nhỏ (dưới 1%)

Tùy thuộc vào thời điểm thu và phương thức xử lý lá trước khi chưng cất lôi cuốn hơi nước mà tỷ lệ của chúng trong tinh dầu trầu có thể thay đổi đáng kể và ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của tinh dầu

Điểm rõ nét thứ hai ghi nhận trong các báo cáo trong và ngoài nước là tùy theo cách chưng cất lá trầu, trong tinh dầu khi chavibetol hay eugenol hay isoeugenol nhiều thì 4-allylpyrocatechol diacetate ít và ngươc lại khi 4-allylpyrocatechol diacetate nhiều thì chavibetol hay eugenol hay isoeugenol lại ít Như vậy, dường như có mối quan hệ

giữa chavibetol hay eugenol hay isoeugenol và 4-allylpyrocatechol diacetate

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG

1.3.1 Hoạt tính sinh học của lá trầu:

 Tính kháng oxi hoá của lá trầu

Các nghiên cứu đã xác định rõ ràng rằng hợp chất phenolic trong thực vật nói chung có hiệu quả cao trong hoạt động kháng oxi hoá Hoạt động này mạnh hay yếu không những phụ thuộc vào tổng hàm lượng phenolic có trong nó, mà còn phụ thuộc vào bản chất của phenol mà nó chứa đựng

Tính kháng oxi hoá của lá trầu có được là do sự có mặt của các hợp chất phenolic với hàm lượng nhất định của chúng trong lá trầu, chủ yếu là eugenol, chavibetol,[38] chavicol, 4-allylpyrocatechol [41] v.v

 Theo tác giả Rathee J.S và cộng sự,[38] dịch chiết ethanol của lá trầu khô (bao gồm thành phần chính là chavibetol và APC) có khả năng kháng oxi hoá mạnh, thể

hiện ở khả năng bắt gốc DPPH với hàm lượng chất chiết 6 μg/ml đạt chỉ số HTCO% là

56,53% đối với lá trầu Bangla Với hoạt động kháng peroxyt hoá lipid (LPO) giá trị đạt

IC50 khi hàm lượng chavibetol là 25 ± 2 μM, APC là 2,0 ± 0,3 μM, trong khi đó đối với α-tocopherol hàm lượng là 10 ± 2 μM, và điều này cho thấy APC có hoạt tính kháng

oxi hóa tốt hơn so với chavibetol, α-tocopherol

 Theo Suppakal P., Sanla-Ead N., Phoopuritham P.[43] tinh dầu lá trầu tươi (chưng cất bằng phương pháp truyền thống) có tính kháng oxi hoá tốt, phương pháp kiểm tra dựa vào sự phân giải caroten tạo vòng không màu trên nền thạch, với nồng độ

tinh dầu là 100 μl/ml, đường kính vòng không màu là 8,4 mm, cho thấy tinh dầu trầu

có tiềm năng trong việc bảo quản thực phẩm đóng gói

 Theo tác giả Dasgupta N và De B.[22]

nước chiết xuất của 3 loại trầu “Kauri”,

“Ghanagete”, “Bagerhati” của Ấn độ đều có hoạt tính kháng oxi hoá với mức kháng oxi hóa theo thứ tự giảm dần của trầu “Kauri” > “Ghanagete” > “Bagerhati” và cả 3 loài trầu này đều cho thấy có tiềm năng ngăn cản sự peroxyt hóa lipid cao hơn nước chiết xuất của lá chè Nồng độ chất chiết để đạt giá trị IC50 về khả năng bắt gốc DPPH

của trầu „Kauri‟ là 62,6 μg/ml, của trầu “Ghanagete” là 126 μg/ml và của trầu

“Bagerhati” là 271,5 μg/ml Nồng độ chất chiết để đạt giá trị IC50 về khả năng kháng

peroxyt hoá lipid của trầu “Kauri” là 14,8 μg/ml, của trầu “Ghanagete” là 77,2 μg/ml

và của trầu “Bagerhati” là 81,5 μg/ml, trong khi đó trị số tương ứng của trà là 127 μg/ml

hóa có thể tốt hơn cả chất chống oxi hóa tổng hợp như BHT và BHA

 Tính kháng khuẩn của lá trầu

Là khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn (thường là vi khuẩn gây bệnh có hại)

Tính kháng khuẩn của trầu được quyết định bởi hàm lượng các dẫn xuất phenolic, cũng như các hợp chất terpen có trong trầu

Các nghiên cứu cho thấy tinh dầu và cao chiết lá trầu (được cô đặc từ dịch chiết lá) có hoạt tính ức chế hoặc tiêu diệt vi rút, vi khuẩn, nấm và động vật nguyên sinh

 Theo Nguyên Ngọc Phước và cộng sự,[10]

dịch chiết lá trầu với dung môi là

nước và ethanol đều có khả năng ức chế sự phát triển của họ nấm Saprolegniaceae

(loài nấm gây bệnh phổ biến ở cá nước ngọt) Ở nồng độ 10.000 ppm chúng có khả

năng tiêu diệt 5 chủng nấm họ Saprolegniaceae là Saprolegnia diclina NJM 0208, Saprolegnia diclina H3 ATCC 90215, Saprolegnia parasitica H2 ATCC 90213, Achlya sp NJM 0323 và Aphanomyces piscicida MJN 0002

 Theo Nguyễn Văn Toại, Lê Thị Oanh, Nguyễn Xuân Huyên,[12]

hoạt chất toàn

phần của lá trầu ức chế mạnh sự phát triển của tất cả các chủng HP (Helicobacter pylori – loài vi khuẩn gây bệnh lý dạ dày tá tràng) phân lập được từ các mảng sinh thiết

dạ dày qua nội soi trên in vitro

 Theo Caburian A.B và Osi M.O,[18] tinh dầu có tính kháng khuẩn và kháng nấm

đáng kể với vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, với nấm Candida albicans và Trichophyton mentagrophytes, với các MIC tương ứng là 125 μg/ml, 15,60 μg/ml, 250 μg/ml, 195 μg/ml

Hoạt động kháng khuẩn được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán thạch (agar diffusion method) cũng cho thấy tinh dầu ức chế sự phát triển của các

nhóm vi sinh vật trên Đường kính vòng ức chế của Staphylococcus aureus bằng 67,5

mm, Candida albicans, Streptococcus pyrogenes và Trichophyton mentagrophytes cùng bằng 90 mm với nồng độ tinh dầu khảo sát là 100 μg/ml

 Theo Li-Ching M.R và Jiau-Ching H.,[32] chiết xuất methanol của lá trầu có tính

kháng khuẩn mạnh với Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Staphylococcus aureus Tinh dầu lá trầu cũng ức chế sự phát triển của ấu trùng muỗi ở 2 giờ với nồng

độ tinh dầu là 86 ppm và ở 24 giờ với nồng độ là 48 ppm và ức chế hoạt động enzym

tyrosinase của nấm mốc với nồng độ tinh dầu là 115 ppm

 Theo Nalina T và Rahim Z.H.A.,[35]

dịch chiết từ lá trầu có liên quan đến việc

giảm sự sản sinh acid và làm thay đổi siêu cấu trúc của Streptococcus mutans (loài vi khuẩn liên quan gần nhất đến bệnh sún răng) Dịch chiết lá trầu gián tiếp ngăn cản sự bám dính của Streptococcus mutans bằng cách không tạo môi trường thuận lợi cho sự

bám dính của vi khuẩn, ngăn cản sự phát triển và hoạt động enzym chuyển hoá glucose Sự ngăn cản enzym chuyển hoá glucose sẽ ảnh hưởng đến sự tạo thành glucan

làm giảm môi trường có lợi cho sự phát triển của Streptococcus mutans

 Theo Prakash B và cộng sự,[37] tinh dầu trầu cũng ức chế sự phát triển của chủng nấm mốc sinh độc tố aflatoxin, nồng độ MIC (minimum inhibitory

concentration) của tinh dầu có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc Aspergillus flavus là 0,7 μg/ml, và nồng độ tinh dầu ức chế sự tạo thành AFB1(aflatoxin B1) của nấm mốc là 0,6 μg/ml

 Theo Suppakal P., Sanla-Ead N., Phoopuritham P (2006),[43] mẫu tinh dầu trầu chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước được ghi nhận là ức chế sự phát triển

của một số loài vi khuẩn như Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, nấm men Candida albicans, Sacchromyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii trong khoảng nồng độ tinh dầu từ 12,5 μg/ml –

100 μg/ml, tuy nhiên lại không có khả năng diệt Pseudomonas aeruginosa ngay cả khi

nồng độ tinh dầu lên cao đến 200 μg/ml

Hoạt tính của một số chất trong tinh dầu trầu

- Chavibetol là một phenolic đồng phân với eugenol, có hoạt tính sinh học mạnh tương tự như eugenol

Công thức phân tử: C10H12O2

Eugenol và chavibetol có tính kháng oxi hóa và kháng khuẩn mạnh, được xem là một kháng sinh thiên nhiên (tự nhiên) tốt, được sử dụng nhiều trong nha khoa

- 4-Allylpyrocatechol (APC) cũng là một hợp chất phenolic thuộc nhóm catechol APC có khả năng tạo vòng càng (chelation) với Fe2+, có tiềm năng bắt gốc tự

do tốt hơn do đó hoạt động kháng oxi hoá như chống peroxyt hoá lipid, hoạt động bắt gốc tự do của APC dự kiến cao hơn so với chavibetol và eugenol Rathee J.S và cộng

sự[35] đã chứng minh APC có hoạt động kháng oxi hoá tốt hơn so với chavibetol và tương tự như acid ascorbic, α-tocopherol Theo Bhattacharya S và các cộng sự,[14]APC trong tinh dầu trầu có khả năng chống lại bệnh viêm dạ dày (bệnh gây ra do uống thuốc giảm đau) bởi khả năng chống oxi hoá và thuộc tính bảo vệ chất nhày (làm tăng cường thành phần chất nhày của mô dạ dày) trên mô hình chuột Với mức cho ăn thử nghiệm 2 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột/ngày cho 7 ngày điều trị, chỉ số viêm dạ dày giảm 93,4% so với chỉ số viêm của ngày đầu tiên Cũng theo tài liệu tham khảo này, APC chỉ xuất hiện trong pha chiết với ethanol của lá trầu, điều này có thể được giải thích vì do APC là một chất phân cực mạnh, không dễ dàng lôi cuốn theo hơi nước

- 4-Allylpyrocatechol diacetate có nhiều trong tinh dầu trầu khi được

chưng cất bằng các phương pháp khác nhau như chưng cất bằng vi sóng, chưng cất có muối, thành phần này có thể lên cao đến 40% – 60% trong tinh dầu trầu

Ester allylpyrocatechol diacetate có khả năng biến tính protein của tế bào, dó đó allylpyrocatechol diacetate được dự kiến có tính kháng khuẩn tốt

4-1.3.2 Công dụng của lá trầu

1.3.2.1 Theo y học cổ truyền[1][2][6][7]

Theo triết học đông phương và y học cổ truyền, lá trầu có vị cay, nồng, tính ấm, mùi thơm hắc Bộ phận sử dụng là lá và rễ, nhưng thường sử dụng là lá nhiều hơn, dùng cả trong lẫn ngoài cơ thể (trong uống ngoài thoa)

Lá trầu thường dùng để trị hàn thấp, nhức mỏi, đau dạ dày, ăn uống không tiêu, bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ, sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay

đổi, nhức đầu, khó thở, nấu thành cao chữa viêm chân răng Nhiều nơi còn sử dụng lá trầu đâm nhỏ rồi cho thêm nước vôi vào để rửa vết loét, mẩm ngứa, viêm hạch bạch huyết Nước pha lá trầu còn được dùng để làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, chữa chàm mặt ở trẻ em

Giã nát lá trầu rồi cho thêm một ít rượu có thể chữa phỏng, đánh gió chữa cảm mạo, trị phong thấp nhức mỏi Nước ép có thể nhỏ vào tai để trị bệnh đau tai

Đặc biệt là thói quen ăn trầu kết hợp với vôi, cau của người dân để tránh được hôi miệng, làm cho chắc răng, giúp nhuận tràng, dễ tiêu Ăn trầu có thể làm cơ thể ấm lên, súc miệng bằng nước ép lá trầu sẽ phòng được bệnh viêm họng

1.3.2.2.Theo y học hiện đại

 Theo Singh M và cộng sự,[42]

chiết xuất n-hexane và chloroform của lá trầu tươi đáp ứng như chất kích thích miễn dịch (điều chế đáp ứng miễn dịch) Thí nghiệm trên dòng chuột cái BALB ở liều lượng 100 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột, chiết xuất làm tăng sinh tế bào T và B của hệ miễn dịch và làm tăng cường sản xuất kháng thể IgG

chống lại kháng nguyên là giun chỉ Brugia malayi kí sinh trên hạch bạch huyết của con

người

 Bhattacharya S., Pal B., Bandyopadhyay S.K., Ray M., Roy K.C.,[15]

sử dụng chiết xuất của lá trầu như là tác nhân điều biến miễn dịch gây ra sự sản xuất từ tế bào T máu ngoại vi của con người

Sáng chế bao gồm việc sử dụng chiết xuất lá trầu tươi, được ủ với IFN (interferon gamma) từ tế bào máu đơn nhân ngoại vi của con người, sau đó thực hiện tăng sinh IFN nhờ với cặp mồi đã biết bằng kỹ thuận PCR

 Về khả năng tiêu diệt tế bào ung thư của trầu, theo Fathilah A.R., Sujata R., Norhanom A.W., Adenan M.I.,[25] dịch nước chiết xuất của lá trầu ngăn cản sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vòm họng KB Sử dụng các xét nghiệm gây độc tế bào trung tính màu đỏ cho thấy dịch chiết khá hữu hiệu trong điều trị tổn thương ung thư biểu bì răng miệng

1.4 Tổng quan về Catechol O-methyltransferase

Phản ứng O-metyl hóa dưới tác dụng enzym O-methyltransferase (OMT)

thường găp trong vi khuẩn, thực vật và động vật nhằm thay đổi những phân tử nhỏ hay polyme cho một chức năng nhất định.[30] OMT là protein có phân tử khối trong khoảng

23000 đến 27000, hoạt động có sự hiện diện của Mg2+[29]

Các hợp chất phenolic như phenylpropanoid, flavonoid có vai trò quan trọng trong tăng trưởng, điều hòa tương tác của thực vật với môi trường Phản ứng liên quan đến sự chuyển nhóm methyl của S-adenosyl –L-methionine (gọi tắt là SAM hay AdoMet) vào OH của phân tử nhận đề cho ra methyl ether tương ứng và hợp chất S-adenosyl-L-homocysteine Trong các O-methyltransferase, có enzym Catechol-O-methyltransferase (gọi tắt là COMT hay COMTase), khi kết hợp với ion Mg2+

tạo phản ứng metyl hóa một nhóm -OH của các catechol thế trong thực vật và động vật

1.4.1 Cơ chế phản ứng

Các tính toán lý thuyết cho thấy phản ứng metyl hóa một nhóm hydroxy của

catechol thuộc loại phản ứng ái nhân SN2 của nhóm -OH tác kích trực tiếp lên methyl của nhóm methylsulfonium của SAM[19] để cho sản phẩm metyl hóa và S-adenosyl-L-homocysteine SAH Như vậy, có sự chuyển nhóm methyl từ S của AdoMet qua O của

catechol, phản ứng được gọi là trans metyl hóa

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng một enzym duy nhất[21] xúc tác cho sự hình thành của

cả hai sản phẩm O-metyl hóa ở vị trí meta và para đối với nhóm thế

Có thể tóm tắt động học phản ứng như sau:

E: Enzym, S: Catechol thế, P: Sản phẩm, AdoHcy: S-Adenosyl-L-homocysteine

AdoMet hay SAM

Catechol S-adenosyl-L-methionine Guaiacol S-adenosyl-L-homocysteine

1.4.2 Cấu trúc của tâm hoạt động[44][45]

Tâm hoạt động nằm trong khoang tương đối không sâu lắm của enzym, SAM bám trước vào enzym thông qua tương tác kỵ thủy và liên kết hydrogen với nhiều amino acid của enzym, sau đó đến ion Mg2+ cần cho phản ứng trans methyl hóa phối

trí với một phân tử nước, 2 gốc aspartic acid của enzyme (Asp 141, Asp 169), một gốc asparagin (Asn 170) và 2 nhóm -OH của catechol, một nhóm -OH cũng liên kết

hydrogen với một gốc glutamic acid của enzym (Glu 199), nhóm -OH còn lại liên kết với NH2 của Lysine (Lys 144) mà tác dụng là lấy proton của -OH, hỗ trợ thực hiện phản ứng metyl hóa Như vậy trong khoang enzym, SAM vào trước rồi đến ion Mg2+

và sau cùng là catechol nằm gần bề mặt ngoài của enzym [45 ]

1.4.3 Độ chọn lọc của phản ứng

 Tính ái nhân của nhóm OH

Trên nguyên tắc, tính ái nhân của -OH càng mạnh thì phản ứng thế trực tiếp SN2 càng dễ xảy ra Như vậy, có thể dự đoán là những nhóm thế trên nhân thơm và pH có thể ảnh hưởng đến vị trí metyl hóa[26]

 Độ phận cực của nhóm thế ở vị trí 4

Theo sơ đồ trên, phản ứng metyl hóa có thể thực hiện ở nhóm -OH ở vị trí meta hay para đối với nhóm thế Trong rất nhiều trường hợp, thực nghiệm cho thấy phản ứng metyl hóa ở OH meta được ưu đãi, đặc biệt là khi nhóm thế phân cực, có mang điện tích (thí dụ L-3,4-dihydroxyphenylalanine gọi tắt L-Dopa), tỷ lệ thế meta/para thường

Hình 1.6: Tâm hoạt động của enzym

Hình 1.7: Sơ đồ biểu diễn trung tâm hoạt động enzyme và vách kỵ thủy

khá lớn Trái lại với nhóm thế không bị ion hóa, ít phân cực thì tỷ lệ meta/para giảm

nhiều, trong một số trường hợp, tỷ lệ này khá nhỏ, thí dụ với R lần lượt là F, CF3, CH=CH-C6H5, CN, tỷ lệ meta/para là 0,35; 0,36; 0,40; 0,46 [21][20]

Theo các nghiên cứu, tâm hoạt động của enzyme không sâu có phần vách kỵ thủy được cấu tạo bởi Trp38, Leu198, Pro174, Trp143 Catechol đi vào khoang sẽ có nhóm thế R tương tác với vách của enzym [21]

và tùy tương tác thuận lợi hay không thuận lợi,

catechol định hướng thích hợp cho phản ứng metyl hóa ở OH meta hay para Sơ đồ

dưới đây trình bày tâm hoạt động của enzym với catechol là 3,5-dinitrocatechol và vách kỵ thủy[44]

Trường hợp nhóm thế R phân cực:

Trong khoang tương đối không sâu của enzym, nhóm thế R phân cực tương tác không thuận lợi với vách kỵ thủy của enzym cấu tạo bởi Trp38, Trp143, Pro174, Leu198, catechol thế sẽ định hướng trong khoang enzym theo hướng tách xa nhóm R khỏi vách kỵ nước của enzym, phản ứng metyl hóa sẽ thực hiện

ở nhóm meta -OH của catechol (trường hợp amino acid L-DOPA, dopamine

trong môi trường acid nhẹ)

R: nhóm thế phân cực bị ion hóa Methyl hóa meta Trường hợp nhóm thế R không phân cực:

Trái lại với R không phân cực, tương tác không phân cực Van derWaals giữa

nhóm thế và vách kỵ thủy thuận lợi, catechol sẽ định hướng sao cho nhóm thế R tiến

đến gần vách enzym hơn, dẫn đến phản ứng metyl hóa ở OH para

Ngoài ra sự hiện diện của nhiều NaCl trong môi trường cũng cản trở phản ứng, có thể

do sự thay đổi cấu trạng của enzym[26]

Vách kỵ nước của enzyme

R: nhóm thế không phân cực Metyl hóa para

Các ví dụ về phản ứng O-metyl hóa của catechol với các nhóm thế khác nhau

O-methyl hóa của L-DOPA có đuôi R = CH2CH(NH2)COOH[33]

O-methyl hóa của 3-nitro-5- benzoylcatechol có đuôi R là -COCH2C6H5[36]

Hình 1.8: Metyl hóa tại vị trí meta đuôi R của L-DOPA tránh xa vách kỵ nước

L-DOPA

ứng O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí para

Hình 1.9 A: O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí para

Hình 1.9 C: O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí meta

Hình 1.9 C tương ứng với định hướng metyl hóa vào vị trí meta đối với nhóm

thế benzoyl Trong trường hợp này nhóm nitro tương tác không thuận lợi với phần vách kỵ nước gồm Leu 198, Pro l74 và Trp 38, tuy nhiên được bù trừ bằng tương tác thuận lợi giữa phenyl của nhóm thế benzoyl và Trp 143 cộng thêm sự solvat hóa của nhóm carbonyl Vì thế mà hợp chất 3-nitro-5- benzoylcatechol có thể bị metyl hóa ở cả

vị trí meta và para đối với nhóm thế benzoyl

Sau đây là một số trị số về tỷ lệ meta/para đã được Creveling và đồng nghiệp thông

báo:[20]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU



2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, VÀ CÁC THIẾT BỊ ĐO ĐẠC

2.1.1 Nguyên liệu

Lá trầu tươi, già, hái trong thời gian khoảng từ 6 giờ đến 8 giờ sáng tại vườn

trầu ở Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh Trầu được Giáo Sư Võ Văn Chi, tác giả của

quyển “Từ điển cây thuốc Việt Nam (1991)” định danh là Piper betle L

Mẫu lá tươi được lấy vào khoảng 6-7 giờ sáng, bảo quản và chưng cất ngay sau khi mang về phòng thí nghiệm (khoảng 1 giờ sau khi hái)

Lá trầu tươi được đem về sấy khô ở những điều kiện nhiệt độ khác nhau đến trọng lượng không đổi, sau đó xay nhuyễn làm bột nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất

- Nước cất 2 lần

- NaCl tinh khiết AR, Trung Quốc

- Diethyl ether Trung quốc

- Methanol dùng cho sắc ký lỏng, Baker

- Hexane ACS Reagent, Baker

- Ethyl acetate, ACS Reagent, Baker

- Bản mỏng silica gel Merck

- Dung dịch H2SO4 5%

- Na2S04 khan tinh khiết AR, Trung Quốc

- Acetic anhydride Merck

- Pyridine Merck

- Benzene Merck

- Dichloromethane Merck

2.1.3 Dụng cụ và các thiết bị đo đạc

- Bộ chưng cất tinh dầu (bình cầu 2 lít, chưng cất có hoàn lưu)

- Cân phân tích (3 số lẻ) Shimadzu

- Máy cô quay EYELA

 Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân: máy Bruker Avance III 500 [500 MHz (1H)

và 125 MHz (13C)] của trường Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Trích ly tinh dầu lá trầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước theo sơ đồ qui trình sau:

Hình 2.3: Sơ đồ chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Bã

Hơi nước ngưng Phần còn lại sau chưng cất

Bão hòa muối,

Lá nguyên liệu Nước hoặc