NOROVIRUS và PHÁT HIỆN NOROVIRUS BẰNG kỹ THUẬT REALTIME PCR

Trung Tâm Kiểm nghiệm VSATTP khu vực phía Nam Labo Vi sinh thực phẩm NOROVIRUS VÀ PHÁT HIỆN NOROVIRUS BẰNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR TS.NGUYỄN ĐỖ PHÚC Phó giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm ATVSTP KV phía nam- Viện Vệ sinh-Y tế công cộng Tp.HCM TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN Trưởng đơn vị Gene -TT Phòng chống chấn thương và các bệnh không lây-Viện VS-YTCC Tp.HCM Giảng viên trường đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011 Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus Phân loại, hình thái học và tổ chức bộ gen Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và phát sinh bệnh Chẩn đoán Các kỹ thuật sinh học phân tử Phương pháp RT- PCR Phương pháp Real- time PCR Tạo dòng QUI TRÌNH REALTIME PCR PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2 TỔNG QUAN 1 1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV) 1 2. Ph}n loại, hình th{i học v| tổ chức bộ gen 1 3. Sự l}y truyền, đặc điểm l}m s|ng v| ph{t sinh bệnh 3 4. Chẩn đo{n 5 5. C{c kỹ thuật sinh học ph}n tử 7 5.1 Phương pháp RT-PCR 7 5.2 Real – time PCR 7 5.3 Tạo dòng 8 QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ 8 1. PHẠM VI ÁP DỤNG 9 2. TÀI LIỆU ÁP DỤNG 9 3. NGUYÊN TẮC 9 4. DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 9 4.1 Dụng cụ 9 4.2 Thiết bị 9 5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT 10 5.1 Bộ hóa chất t{ch chiết RNA to|n phần NK RNAPREP 10 5.2 Bộ hóa chất dùng tổng hợp cDNA NK 10 5.3 Bộ hóa chất dùng điện di 11 5.4 C{c th|nh phần bộ kít Real Time PCR 11 5.5 Bộ kít Real Time PCR 12 6. QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM 12 6.1 Chuẩn bị cDNA từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 12 6.2 Chu trình nhiệt Real Time PCR ph{t hiện Norovirus GI v| GII 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool EIA Enzym Immunoassay EM Electron microscopy HBGA Histo-blood group antigens IAHA Immune adherence hemagglutination assay IC Immunochromatography IEM Immune electron microscopy MCR Multiple Cloning Region. NoV Norovirus ORF Open reading frame PCR Polymerase chain reaction RdRp RNA-dependent RNA polymerase RIA Radioimmunoassay RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction RT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification ssRNA single stranded RNA VLPs Virus-like particles VP Viral coat and capsid Proteins 1 TỔNG QUAN 1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV) C{c bệnh về tiêu chảy l| nguyên nh}n chính của dịch bệnh v| tử vong ở trẻ em tại c{c nước đã v| đang ph{t triển [44,27] . Điều đó được chứng minh ở Ch}u Phi, Ch}u Á v| Mỹ Latinh đã có 744 triệu đến 1 tỷ trường hợp viêm dạ d|y cấp v| 2,4 đến 3,3 triệu trường hợp tử vong h|ng năm ở trẻ em dưới 5 tuổi [27,36] . Mặc dù, c{c b{o c{o cho thấy có ít nhất 25 loại vi sinh vật v| động vật nguyên sinh có thể g}y ra bệnh tiêu chảy ở trẻ em, trong đó hơn 75% của c{c trường hợp nguyên nh}n l| do c{c virus, v| 7 nhóm virus thường g}y tiêu chảy l| Rotavirus, Norovirus, Sapovirus, Adenovirus, Astrovirus, Parechovirus, v| Aichivirus được coi l| c{c t{c nh}n chính v| phổ biến của bệnh viêm dạ d|y ruột cấp ở người [44,28,29] . Noroviruses (NoVs) được ph{t hiện lần đầu tiên bởi Kapikian v| cộng sự v|o năm 1972 [11] dưới kính hiển vi điện tử (EM). Trước đ}y, c{c virus được kí hiệu l| “Norwalk-like viruses”. Chủng nguyên thủy của NoV l| virus Norwalk, chúng được ph{t hiện từ một đợt bùng ph{t viêm dạ d|y ruột cấp tính tại một trường tiểu học ở Norwalk, Ohio năm 1968 [11] . NoVs l| th|nh viên của chi Norovirus, cùng với chi Sapovirus trong họ Caliciviridae [6] . C{c virus n|y thường nhỏ v| không có m|ng bao quanh, sRNA (+), với đường kính khoảng 27-35 nm. NoV được coi l| nguyên nh}n chính g}y viêm dạ d|y ruột cấp tính ở trẻ em v| người lớn. Bệnh do NoV thường xảy ra v| tìm thấy ở c{c nơi kh{c nhau: nh| h|ng, trường học, c{c trung t}m chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, nh| điều dưỡng, v| t|u du lịch. Hằng năm có hơn 267 triệu nhiễm do NoV trên to|n thế giới [20, 21,34] . Con đường truyền chính của virus n|y thường lan truyền qua đường thực phẩm, đường nước, không khí, v| lan truyền từ người sang người [7,17,22] . 2. Phân loại, hình thái học và tổ chức bộ gen Trước đ}y, việc ph{t hiện l}y nhiễm NoV ở người bị hạn chế bởi vì NoV g}y bệnh ở người nhưng không sinh sản v| ph{t triển được trong c{c nuôi cấy tế b|o, v| cũng không có động vật thí nghiệm n|o thích hợp cho sự g}y nhiễm NoV. Tạo dòng của bộ gen virus Norwalk được thực hiện năm 1990 đã dẫn Hình 1.1: Norovirus dưới kính hiển vi điện tử 2 đến sự tiến bộ đ{ng kể trong sự hiểu biết về virus học ph}n tử v| dịch tễ học của NoVs [41] . Gần đ}y, c{c phương ph{p chẩn đo{n ph}n tử nhạy cảm dựa trên phản ứng RT-PCR v| c{c kỹ thuật giải trình tự bộ gen để ph{t hiện v| mô tả đặc điểm NoV đã n}ng cao thêm sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học của sự l}y nhiễm NoV [42] . Những kỹ thuật n|y đã chứng minh rằng c{c virus NoV có tính di truyền v| đa dạng về kh{ng nguyên [43] . Dựa v|o trình tự giống nhau v| ph}n tích ph{t sinh chủng lo|i, NoVs có thể được ph}n loại theo nhóm gen (genogroup), kiểu gen (genotype) v| cụm gen (genocluster). Hiện nay, NoVs được ph}n loại th|nh năm nhóm gen kh{c nhau: GI đến GV [6,30] . NoVs ở người thuộc GI, GII v| GIV, nhưng hầu hết c{c chủng g}y bệnh ở người thuộc đều thuộc nhóm gen GI và GII. NoVs GIII v| GV cho đến nay đã được tìm thấy ở lo|i bò v| c{c lo|i chuột. Trong c{c nhóm gen (genogroups), NoVs được chia tiếp th|nh c{c kiểu gen (genotypes), trong số đó có ít nhất 29 kiểu gen đã được b{o c{o. Hiện nay nhóm gen GI được chia th|nh t{m kiểu gen (GI/1 đến GI/8), GII bao gồm ít nhất 17 kiểu gen (GII/1 đến GII/17), GIII có hai kiểu gen (GIII/1-GIII/2) v| mỗi GIV v| GV bao gồm một kiểu gen [43] . C{c ph}n tích về trình tự to|n bộ chiều d|i bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng c{c chủng virus trong một nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng về nucleotide, trong khi c{c chủng trong c{c nhóm gen kh{c chỉ chiếm 51-56% sự tương đồng. Ngo|i ra, sự ph}n loại dựa trên trình tự nucleotide của gen cho protein vỏ capsid cho thấy rằng c{c trình tự chệch nhau bởi 60% giữa c{c genogroups v| 20- 30% giữa c{c genotypes. Trong cùng genocluster, trình tự vỏ capsid của virus thường rất giống nhau [5] . Thông qua việc gi{m s{t dịch tễ của NoV trên thế giới đã cho thấy vai trò chủ yếu của những chủng có nhóm gen GII, đặc biệt l| những chủng có kiểu gen GII/4 chiếm ưu thế l| nguyên nh}n của c{c vụ dịch (hiện tại ước tính khoảng ~ 80% của tất cả c{c trường hợp l}y nhiễm), v| có c{c biến thể GII/4 mới xuất hiện mỗi 1-2 năm. Dường như sự tăng lên thường xuyên của biến thể GII/4 mới đã tiếp diễn trong năm qua, v| trở th|nh một hiện tượng to|n cầu [31,32] . Mặc dù dịch bệnh NoV được b{o c{o quanh năm, nhưng đỉnh điểm của việc bùng ph{t dịch l| trong mùa đông [1] . NoVs l| th|nh viên của chi Norovirus, trong họ Caliciviridae. Hạt Virion NoV được tạo th|nh bởi 3 cấu trúc đơn của vỏ capsid, với khối 20 mặt đối xứng. Bề mặt điển hình của hạt virus mang hình d{ng lõm của c{i t{ch. Vỏ capsid gồm có 90 dimer của một protein vỏ đơn, có trọng lượng ph}n tử l| 58 kD. Bộ gen của NoV bao gồm mạch dương (positive-sense), 7.400-7.700 nucleotide của sRNA. Bộ gen được chia th|nh 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2, v| ORF3). ORF1 mã hóa cho một polyprotein được t{ch ra từ enzym thủy ph}n protein, tạo th|nh NTPase, protease, v| RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp). ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1, v| ORF3 mã hóa một protein VP2 cơ bản nhỏ chưa biết chức năng [6] . 3. Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và phát sinh bệnh C{c NoV thường l| nguyên nh}n phổ biến của c{c bệnh viêm dạ d|y ruột cấp ở hầu hết c{c nhóm tuổi. Nhìn chung, c{c NoV GII l| chủng phổ biến nhất được b{o c{o trong c{c vụ dịch trên to|n thế giới [17] . Sự lan truyền phổ biến l| thông qua thức ăn, nước v| môi trường bị ô nhiễm, sự tiếp xúc giữa người với người, trong không khí, v| có thể do một số phương thức kh{c chưa biết. C{c NoV được tìm thấy trong mẫu ph}n v| mẫu nôn của một người bị nhiễm bệnh. Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen NoV Hình 1.2: Cấu trúc của NoV 4 Có ít nhất 2 nh}n tố góp phần v|o khả năng bùng ph{t dịch bệnh của virus. Thứ nhất, virus l}y nhiễm rất cao v| chỉ một lượng nhỏ, khoảng 10-100 hạt virion, l| đủ để g}y bệnh. Thứ hai, virus tương đối bền trong môi trường, ví dụ khả năng chống chịu đóng băng, nhiệt độ đến 60 0 C, khử khuẩn với chlore, điều kiện acid, giấm, rượu, c{c dung dịch khử trùng tay, v| nồng độ đường cao [4,38] . Giai đoạn ủ bệnh trung bình của vius ngắn (12-48h), nhưng sự ph{t t{n của virus được ph{t hiện ba tuần sau khi xuất hiện c{c triệu chứng, tạo cơ hội để mở rộng phạm vi ph{t t{n của virus sang c{c vật chủ kh{c [35] . Hiện nay việc phòng ngừa v| khống chế c{c vụ dịch của NoV l| dựa v|o việc x{c định c{c phương thức truyền nhiễm; sự lan truyền bệnh được cắt đứt bằng việc kiểm so{t sự ô nhiễm của thực phẩm v| nguồn nước, duy trì vệ sinh c{ nh}n, v| l|m giảm sự truyền bệnh từ người sang người. Triệu chứng nhiễm NoV có thể có nôn mửa hoặc tiêu chảy, phổ biến l| đau quặn, v| đôi khi có sốt. Ph}n tiêu chảy thường không có m{u, thiếu chất nhờn, thể lỏng v| có nước. C{c triệu chứng thường kéo d|i khoảng 24-60h [13] . C{c cuộc nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy rằng có đến 30% c{c trường hợp nhiễm trùng m| không có triệu chứng n|o. Không có c{c điều trị kh{ng virus đặc hiệu, cũng như không có vaccine để ngăn ngừa bệnh [6] . Điều trị chỉ tập trung v|o chăm sóc hỗ trợ, đặc biệt l| ngăn ngừa v| điều trị mất nước. Những người không thể duy trì sự chống mất nước, đặc biệt l| trẻ em v| người cao tuổi, có nguy cơ mất nước rất cao, dẫn đến rối loạn sự điện giải v| có thể phải nhập viện. C{c biến chứng từ nhiễm NoV có thể thường thấy ở trẻ sơ sinh v| người cao tuổi. Tuy nhiên, dữ liệu mới cho thấy rằng c{c dấu hiệu v| c{c biến chứng l}m s|ng bất thường từ sự l}y nhiễm NoV có thể xảy ra ở những người suy giảm miễn dịch v| căng thẳng tinh thần [14] . Do không có khả năng nuôi NoV ở người, nên hầu hết c{c dữ liệu về bệnh học v| miễn dịch học đều thu được từ c{c cuộc nghiên cứu trên những người tình nguyện. C{c nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh bị nhiễm virus cho thấy sự nhiễm trùng chính thường xảy ra ở phần dưới của ruột non với sự dãn nỡ của lông nhung v| sự co ngắn của vi lông nhung [44] . Những vết viêm loét của niêm mạc ph{t triển sau đó, kết quả cuối cùng l| dẫn đến tiêu chảy. Nhiễm trùng do NoV kích thích cơ thể sinh ra kh{ng thể IgG, IgA đặc hiệu v| kh{ng thể IgM trong huyết thanh, ngay cả khi đã có sự phơi nhiễm trước đó. Hầu hết c{c bệnh nh}n đều có sự đề kh{ng với sự t{i l}y nhiễm trong khoảng 4 - 6 th{ng. Tuy nhiên, không có sự miễn dịch l}u d|i [44] . Nghiên cứu ban đầu trong c{c nhóm tình nguyện đã chứng minh rằng khoảng 30% trường hợp nhiễm bệnh m| không có triệu chứng đi kèm v| có khoảng 50% dẫn đến bệnh [33,45] . Gần đ}y, nghiên cứu cho thấy rằng những người 5 nhiễm bệnh NoV phụ thuộc v|o sự hiện diện của c{c thụ thể kh{ng nguyên nhóm m{u histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong ống tiêu hóa [18] . HBGAs ở người l| phức hợp c{c carbohydrate bao gồm một oligosaccharide liên kết với protein hoặc lipid trên niêm mạc biểu mô của hệ hô hấp, sinh dục, v| ống tiêu hóa, hoặc như c{c oligosaccharide tự do trong c{c dịch sinh học như nước bọt [23] . Cả 3 họ HBGA chính (họ ABO, Lewis, v| họ secretor) đã cho thấy có sự liên quan đến việc nhận diện NoV. Sự phối hợp của liên kết đặc hiệu chủng v| biểu hiện biến đổi trên thụ thể HBGA có thể giải thích sự mẫn cảm của người nhiễm kh{c nhau được theo dõi trong c{c vụ dịch NoV v| trong c{c nghiên cứu ở người tình nguyện [9,39] . 4. Chẩn đoán Có nhiều phương ph{p thích hợp để chẩn đo{n bệnh nhiễm NoV. Những phương ph{p n|y bao gồm hiển vi điện tử trực tiếp (EM), hiển vi điện tử miễn dịch (IEM), thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch (IAHA), thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm miễn dịch enzym (EIA), thử nghiệm sắc ký miễn dịch (IC), RT-PCR, real-time PCR, v| giải trình tự nucleic acid. Trong số những phương ph{p n|y thì RT-PCR, real-time PCR v| giải trình tự nucleic acid được sử dụng rộng rãi để ph{t hiện v| x{c định kiểu gen của NoV [15,28,25,42] . C{c kỹ thuật n|y đã thay thế c{c thử nghiệm miễn dịch truyền thống v| trở th|nh tiêu chuẩn v|ng cho chẩn đo{n nhiễm trùng NoV trong thập kỷ qua. Các kỹ thuật thông thường. Vì NoV ở người không thể ph{t triển trên môi trường nuôi cấy tế b|o, chẩn đo{n ban đầu viêm dạ d|y ruột liên quan đến sự nhiễm NoV được dựa v|o quan s{t trực tiếp bằng c{ch sử dụng EM [11] . Vì kỹ thuật n|y ph{t hiện một lượng virus > 10 6 /ml trong dịch huyền phù ph}n, nó chỉ có thể th|nh công khi {p dụng trong giai đoạn sớm của bệnh [38] . Trong khi c{c hạt virus n|y có thể được quan s{t trong mẫu lọc của ph}n tiêu chảy ở giai đoạn rất sớm, quan s{t được tăng cường bằng kỹ thuật IEM với huyết thanh miễn dịch thêm v|o. Trong kỹ thuật n|y, huyết thanh miễn dịch được sử dụng để n}ng cao sự ph{t hiện virus bởi sự ngưng kết của c{c hạt virus trong dịch huyền phù ph}n. Sự kết cụm virus xảy ra trong sự hiện diện của kh{ng thể đặc hiệu có thể ph{t hiện v| cải thiện khả năng chẩn đo{n đặc hiệu. Tuy nhiên, kỹ thuật n|y chỉ được sử dụng cho c{c mẫu ph}n thu nhận trong giai đoạn đầu của bệnh [19] . Thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch (IAHA) v| RIA đang được ph{t triển. IAHA l| thử nghiệm để đ{nh gi{ nồng độ kh{ng thể NoV trong một lượng lớn huyết thanh vì thế c{c nghiên cứu dịch tễ học về huyết thanh có thể 6 được thực hiện bằng thử nghiệm n|y [12] . Những hạt virus được l|m sạch từ mẫu ph}n có thể được dùng như một kh{ng nguyên, v| tương t{c của phức hợp giữa kh{ng nguyên/kh{ng thể được ph{t hiện bởi sự ngưng kết hồng cầu nhóm m{u O ở người. Mặc dù thử nghiệm có lợi thế l| đòi hỏi kh{ng nguyên ít hơn, nó nhanh chóng được thay thế bằng RIA. RIA đã được ph{t triển như l| một phương ph{p thay thế cho IEM để ph{t hiện kh{ng nguyên NoV trong c{c mẫu ph}n [8] . Các kỹ thuật phân tử: Sau th|nh công về tạo dòng v| giải trình tự bộ gen virus Norwalk (NoV), thử nghiệm RT-PCR được ph{t triển để ph{t hiện NoV trong cả mẫu bệnh phẩm v| mẫu môi trường trong hai thập kỷ qua. Ứng dụng RT-PCR v| c{c kỹ thuật giải trình tự cDNA để ph{t hiện v| mô tả đặc điểm di truyền NoV đã tăng cường đ{ng kể sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học của bệnh nhiễm NoV [30,39,42] . Gần đ}y, RT-PCR được sử dụng rộng rãi như một công cụ để chẩn đo{n bệnh nhiễm NoV. Một bước ngoặt đ{ng tin cậy nhất cho chẩn đo{n nhiễm NoV l| sự hiện diện RNA của NoV trong c{c mẫu ph}n. Do đó, c{c mẫu được lựa chọn l| mẫu ph}n từ bệnh nh}n bị tiêu chảy. Để tạo điều kiện cho việc ph}n tích ph}n tử RNA của NoV, khuếch đại bộ gen RNA của chúng v| trình tự của sản phẩm khuếch đại phải được thực hiện. Thêm v|o đó, c{c kỹ thuật ph}n tử kh{c như l| PCR-miễn dịch, RT-LAMP v| real-time-PCR, những kỹ thuật đó nhanh v| nhạy hơn phương ph{p RT-PCR chuẩn, gần đ}y c{c phương ph{p real-time RT-PCR đã được ph{t triển để ph{t hiện nhanh NoV trong một số lượng lớn c{c mẫu ph}n v| mẫu hải sản trong suốt mùa dịch bệnh v| c{c vụ dịch của NoV [10,40] . Trong những năm gần đ}y, baculovirus đã biểu hiện protein vỏ NoV v| nó được khai th{c để tạo hạt giống virus (VLPs). Những VLPs n|y sau đó biểu hiện hình th{i v| kh{ng nguyên giống với c{c hạt virus nguyên thể. C{c VLPs rất hữu ích cho việc tạo miễn dịch của nhiều lo|i động vật kh{c nhau (chuột, chuột lang, v| thỏ) để sản xuất sản phẩm huyết thanh miễn dịch đa v| đơn dòng v| sau đó có thể được sử dụng để thiết lập c{c thử nghiệm chẩn đo{n cơ bản EIA như thử nghiệm ELISA v| thử nghiệm IC [37] . Một số bộ kít ELISA dùng để ph{t hiện NoV trong c{c mẫu ph}n đã được ph{t triển v| thương mại hóa. Mặc dù c{c mẫu ph}n có thể được thử nghiệm trực tiếp bằng những bộ kít ELISA m| không cần bước tinh chế v| cô đặc qu{ phức tạp, độ nhạy của phương ph{p ELISA thì thấp hơn nhiều so với phương ph{p RT-PCR [3,2,16] . Độ nhạy thấp l| hạn chế của phương ph{p ELISA, điều đó l|m cho nó không phù hợp cho việc ph{t hiện trực tiếp NoV trong c{c mẫu ph}n, mẫu hải sản m| không có sự cải thiện độ nhạy. Gần đ}y, thử nghiệm ph{t hiện nhanh bằng bộ 7 kít IC cũng đã trở th|nh thương mại hóa, có sẵn để ph{t hiện NoV. Bộ kít IC n|y đã chứng minh có độ nhạy cao hơn so với c{c thử nghiệm bằng ELISA. Tuy nhiên, hạn chế của c{c thử nghiệm chẩn đo{n EIA cơ bản để ph{t hiện NoV l| chỉ có kiểu gen NoV m| c{c kh{ng thể đơn dòng đặc hiệu có thể được ph{t hiện. 5. Các kỹ thuật sinh học phân tử 5.1 Phương pháp RT-PCR L| phương ph{p PCR m| nucleic acid đích cần phải ph{t hiện l| RNA. Để có thể thực hiện được PCR n|y thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT-reverse transcription) th|nh cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự n|y. Vì phải thực hiện hai giai đoạn RT rồi mới đến PCR, nên kỹ thuật n|y được gọi l| kỹ thuật RT-PCR. Kỹ thuật RT-PCR gồm hai giai đoạn: − Giai đoạn phiên mã ngược: (RT) l| một giai đoạn hết sức quan trọng quyết định sự th|nh công của RT-PCR. Enzym được sử dụng trong giai đoạn n|y l| Reverse transcriptase. Mồi sử dụng trong giai đoạn n|y l| mồi “ngược” của PCR giai đoạn sau, có thể l| oligonucleotic oligodT (để bắt cặp với đuôi poly A của c{c mRNA), hoặc cũng có thể l| một mồi ngẫu nhiên (random primer) có bản chất l| một hexan nucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên mRNA. − Giai đoạn khuếch đại: l| phản ứng PCR với c{c cặp mồi đặc hiệu khuếch đại theo cấp số nh}n c{c cDNA nhờ Taq polymerase. 5.2 Real – time PCR Real-time PCR l| một phương ph{p kiểm so{t lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng chu kỳ của qu{ trình khuếch đại, tr{i ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại. Real-time PCR l| một phản ứng động, cho phép ph{t hiện "huỳnh quang ph{t ra nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR”. Tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Ph}n tích kết quả m| không cần qua bước điện di trên gel như phản ứng PCR truyền thống. Kết quả được ph}n tích thông qua tín hiệu huỳnh quang ph{t ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR. Kỹ thuật Real-time PCR cũng qua hai bước giống RT-PCR: tạo cDNA, v| sau đó sử dụng cDNA n|y để thực hiện phản ứng real-time PCR. [...]... hành  Cho 40µl mẫu t{ch chiết RNA v|o tube PCR có chứa sẵn 3µl NKRTmix đang ng}m trong đ{  Thực hiện tổng hợp cDNA trong m{y lu}n nhiệt theo chương trình như sau: 5 phút: 25oC, 30 phút: 42oC, 5 phút: 85oC, Giữ 4oC 6.2 Chu trình nhiệt Real Time PCR phát hiện Norovirus GI và GII Sử dụng 5µl mẫu cDNA cho v|o 20 µl Real Time PCR mix v| tiếp tục chạy Real Time PCR trên m{y Bio Rad, với chu trình nhiệt như... ACA 11 Probe: Probe để ph{t hiện NoV GI có đầu gắn huỳnh quang FAM v| probe để ph{t hiện NoV GII có đầu gằn huỳnh quang HEX, có trình tự sau: Genogroup Oligonucleotide GI JJV1P GII RING2-P Trình tự (5' - 3') TGT GGA CAG GAG ATC GCA ATC TC TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT Vị trí 5319 – 5341 5048 – 5067 5.5 Bộ kít Real Time PCR Thành phần Real Time PCR- mix phát hiện Norovirus GI và GII Nồng độ cho 1 Thể tích... detection of Norovirus by using Taqman-Based one-step RT -PCR assay and Aplication to naturally contaminated Shellfish samples Applied and Environmental Microbiology, p 1870-1875, 2004 3 NGUYÊN TẮC Real-time PCR l| một phản ứng động, cho phép ph{t hiện "huỳnh quang FAM cho ph{t hiện NoV GI v| huỳnh quang HEX cho ph{t hiện NoV GII nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR Tại mỗi chu kỳ của phản ứng Real Time PCR, ... PCR Tại mỗi chu kỳ của phản ứng Real Time PCR, kết quả được ph}n tích thông qua tín hiệu huỳnh quang ph{t ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR Kỹ thuật Real-time PCR qua hai bước: tạo cDNA, v| sau đó sử dụng cDNA n|y để thực hiện phản ứng real-time PCR 4 DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 4.1 Dụng cụ - Chai Dural 250ml, 500ml - Eppendorf 1,5ml, 0,2ml - Ống nghiệm 18x150mm - Túi nylon vô trùng - Pipetteman c{c... tăng thêm để tăng số lượng khuẩn lạc được biến nạp - Hình 1.4 Promoter và trình tự đa nối của vector pGEM-T Easy Sợi trên chịu trách nhiệm tổng hợp RNA nhờ enzym T7 RNA polymerase Sợi dưới chịu trách nhiệm tổng hợp RNA nhờ SP6 RNA polymerase 8 QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ 1 PHẠM VI ÁP DỤNG X{c định Norovirus trong thực phẩm 2 TÀI LIỆU ÁP DỤNG Tham khảo t|i liệu Narayanan... có thể điện di sản phẩm PCR trên gel agarose Tên thuốc thử NKTBE10X NKAgarose NKLoading buffer Ethidium bromide NKDNA ladder NK th|nh phần tris HCl, boric acid, EDTA agarose (MB grade) bromo phenol blue, glycerol tris-EDTA ethidium bromide thang DNA từ 100 đến 1000bps ĐK bảo quản ToPTN ToPTN ToPTN ToPTN 2-8oC 5.4 Các thành phần bộ kít Real Time PCR Mồi phát hiện NoV nhóm GI và GII như sau: GII GIJJ_V1F... thuốc thử Real Time PCR 20 Real Time PCR mix mix 20µl/mix PCR master mix 2X 1x 500µl Mồi GI JJ-V1 F (100µM) 12pm 2,4µl Mồi JJ-V1 R (100µM) 12pm 2,4µl JJ V1- Probe (100µM) 5pm 1µl Mồi GII JJ-V2 F (100µM) 12pm 2,4µl Mồi CO-G2 R (100µM) 12pm 2,4µl RIN-G2- Probe (100µM) 5pm 1µl MgCl2 (50mM) 3,5µM 70µl dNTP (100mM) 0,2mM 2µl miliQ water 219,3µl Tổng cộng 800 µl Chu trình nhiệt chạy Real Time PCR: : 1 chu kỳ 960C... Chuẩn bị mẫu thực phẩm ph{t hiện Norovirus C{c mẫu được t{ch chiết riêng biệt, số lượng tối thiểu 10 con/mẫu, được cắt nhỏ, cho v|o m{y nghiền, dập đều mẫu để giải phóng hạt virus ra khỏi tế b|o Hút dịch lỏng của mẫu 200µl, cho v|o ống eppendorf loại 1,5ml v| tiến h|nh t{ch chiết mẫu thu RNA bằng bộ kít chiết t{ch mẫu NKRNAPREP của Công ty Nam Khoa 6.1.2 T{ch chiết RNA to|n phần bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP... Đặc điểm của vector pGEM - T easy - Đầu thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩm PCR: pGEM-T Easy vector được thiết kế với một 3’- thymidine ở cả hai đầu T- nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của qu{ trình gắn sản phẩm PCR bằng c{ch ngăn chặn việc tự gắn vòng vector v| cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi c{c enzym tổng hợp - Lựa chọn các thể biến nạp Xanh/ Trắng:... GII.4 norovirus variants causing gastroenteritis outbreaks from 2001 to 2006 in Eastern Spain, J Med Virol., 80, 1288, 2008 2 Burin, E., et al., Diagnosis of norovirus outbreaks by commercial ELISA or RT -PCR, J Virol Methods, 137, 259, 2006 3 Burton-MacLeod, J A., et al., Evaluation and comparison of two commercial enzym-linked immunosorbent assay kíts for detection of antigenically diverse human noroviruses . Tâm Kiểm nghiệm VSATTP khu vực phía Nam Labo Vi sinh thực phẩm NOROVIRUS VÀ PHÁT HIỆN NOROVIRUS BẰNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR TS.NGUYỄN ĐỖ PHÚC Phó giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm. trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự n|y. Vì phải thực hiện hai giai đoạn RT rồi mới đến PCR, nên kỹ thuật n|y được gọi l| kỹ thuật RT-PCR. Kỹ thuật RT-PCR gồm hai giai. sớm, quan s{t được tăng cường bằng kỹ thuật IEM với huyết thanh miễn dịch thêm v|o. Trong kỹ thuật n|y, huyết thanh miễn dịch được sử dụng để n}ng cao sự ph{t hiện virus bởi sự ngưng kết của