bài giảng về PCR (polymerase chain reaction)

PCR (polymerase chain reaction)  Chương II Taq polymerase Các bước PCR 1 phản ứng PCR Nguyên tắc máy PCR Làm thế nào để phân lập được gen I. Giới thiệu Kary Mullis 1985 Nobel 1993 Giới thiệu  PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp  Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, khơng cần sự hiện diện của tế bào  Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại một đoạn DNA nằm giữa 2 mồi chuyên biệt, nhờ men DNA polymerase Nguyên tắc • Dựa trên sự hoạt động của emzyme • Sự hiện diện của mồi chuyên biệt • Khả năng nối dài mồi của taq polymerase • Các nu tự do trong môi trường Máy PCR Thực nghiệm  Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 3 bước  Bước 1: Biến tính (denaturation)  94-98 o C  2-5 phút  Bước 2: Gắn mồi (anneealing)  30-65 o C  20s-2’  Bước 3: kéo dài (extending)  68-72 o C  20s-5’ Thực nghiệm http://users.ugent.be/~avierstr/pdf/PCR.pdf III. THỰC NGHIỆM http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html III. THỰC NGHIỆM http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html [...]... Real-time PCR  Một máy luân nhiệt  Một hệ thống phát và đọc tín hiệu huỳnh quang  Chương trình vi tính để theo dõi và phân tích kết quả Quá trình nhân bản sao ADN trong một phản ứng PCR Số lượng ADN Pha bình nguyên Thềm phát hiện Pha chậm Pha log Trong pha Log : Qn = Số bản sao sau n chu kỳ Q0 = Số bản sao khởi đầu E = Hiệu suất PCR n = số chu kỳ Qn = Q0 (E)n A-6 A-5 A-4 A-3 A-2 A-1 A1 PCR cổ điển... ngẫu nhiên được tổng hợp nhân tạo Ngun tắc Dùng kỹ thuật PCR, sử dụng mồi là các sợi oligonucleotide đơn gồm 10 mer có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên  SV cùng lồi sẽ có kiểu gen hồn tồn giống nhau, sẽ khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR  SV khác nhau ít nhiều về kiểu gen _ đa dạng về sinh hoc, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn... khác    Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống Dầu khống CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR        1 DNA mẫu: (100ng-1µg) 2 Enzyme 3 Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai) 4 dNTP: 20-200µM/ mỗi lọai nu 5 Nồng độ Mg++ 6 Số lượng... A-1 = 10-1ng A1 = 1ng Real-Time PCR : quá trình nhân bản sao ADN được theo dõi trực tiếp theo từng chu kỳ Với kỹ thuật này, ADN ban đầu được đònh lượng một cách chính xác Phương pháp tạo huỳnh quang dùng SYBRGreen Kích thích 490nm Phát quang 530nm SYBRGreen phát huỳnh quang khi chèn giữa 2 mạch của ADN Tín hiệu huỳnh quang được đo sau giai đoạn kéo dài của mỗi chu kỳ PCR Ưu điểm : rẻ, đơn giản Nhược... quang khi chèn giữa 2 mạch của ADN Tín hiệu huỳnh quang được đo sau giai đoạn kéo dài của mỗi chu kỳ PCR Ưu điểm : rẻ, đơn giản Nhược điểm : không đặc hiệu p dụng của PCR Tạo dòng DNA Tìm hiểu mức biểu hiện của gen (Reverse Transcription PCR) Chẩn đoán bệnh (của người, súc vật, cây cối) Phát hiện đột biến Kiểm tra chất lượng (thực phẩm, GMO, ô nhiễm nước…) Phát hiện khác biệt giữa các bộ gen (Đa dạng... phạm vụ án, giải đáp những bí mật lòch sử…) TĨM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN MỘT PHẢN ỨNG PCR Thiết kế mồi Chuẩn bị mẫu DNA Pha mix với các thành phần theo thứ tự sau: 1 2 3        4 5 6 H2O tiệt trùng Buffer dNTP tổng số mồi xi mồi ngược taq polymerase DNA mẫu Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt của thang chuẩn Phân tích kết quả RAPD (Random... phẩm khơng đặc hiệu Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase, DNA mẫu và thành phần buffer gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM dNTPs là loại hóa chất kém bền Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP Việc tăng dNTP khơng làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác Chất khác  ... khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 (Welsh và McClelland; William và ctv.) Dùng nghiên cứu sự khác biệt di truyền của những lồi khác nhau Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Primer RAPD    Là . PCR (polymerase chain reaction)  Chương II Taq polymerase Các bước PCR 1 phản ứng PCR Nguyên tắc máy PCR Làm thế nào để phân lập được gen I nghiệm http://users.ugent.be/~avierstr/pdf /PCR. pdf III. THỰC NGHIỆM http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html III. THỰC NGHIỆM http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html Mồi (primers) Mồi. glycerol, and betaine trong thành phần PCR.  Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống.  Dầu khoáng CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR  1. DNA mẫu: (100ng-1µg)  2.