báo cáo- phướng pháp microarays

Đặt vấn đềTrừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Báo cáo seminar:

Nhóm sinh viên thực hiện:

MỤC LỤC

I. Đặt vấn đề

II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray

III. Khái niệm về Microarray

IV. Cấu tạo và phân loại Microarray

X. Câu hỏi trắc nghiệm

XI. Tài liệu tham khảo

I. Đặt vấn đề

Trừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để

có thể tăng cường hoặc giảm bớt sự biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của gen trong một thí

nghiệm giản đơn và hiệu quả

Trong quá khứ, các nhà khoa học chỉ có thể tiến hành các phân tích di truyền của một vài gen cùng một lúc Với sự phát triển của kỹ thuật

microarrays các nhà khoa học giờ đây có thể kiểm tra hàng ngàn gen hoạt động như thế nào, ở bất kỳ thời điểm nào

Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn

về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu

về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người

II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray

Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA microarray vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng

nhiệt hoặc dung dịch kiềm Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình

ra phương pháp lai in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang,

FISH Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979

Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra Với kỹ thuật này, các trình

tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu) Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos

(1991) Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa

màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu

Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật

độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể

Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu

Hình 1: Quá trình phát triển của kĩ thuật di truyênTất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay.

III. Khái niệm về Microarray

Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm đơn giản và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người

Nói về microarray, hiện nay đa số ai cũng liên tưởng đến DNA microarray vì kỹ thuật này đã được biết đến từ cuối thập niên 80, do nhóm khoa học dưới sự chủ trì của tiến sĩ Stephen P.A Fodor phát minh Sau đó được hãng Affymetrix (Mỹ) phát triển và phổ biến rộng khắp ở Mỹ và thế

DNA.Trình tự DNA trên mỗi điểm là duy nhất.Hàng ngàn điểm được dàn trận trong hàng và cột trật tự trên một bề mặt rắn (thường là thủy tinh) Vị trí chính xác và trình tự của từng vị trí được ghi lại trong một cơ sở dữ liệu máy tín Mỗi vị trí đại diện cho một gen.

IV. Cấu tạo và phân loại Microarray

DNA microarray hay còn gọi là DNA chip, được chế tạo trên bề mặt thủy tinh hoặc nylon hoặc silicone Trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất Bằng kĩ thuật tự động tốc độ cao, gồm vô số các probe (đoạn dò) đã biết trước trình tự

Probe để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng,

có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài

(50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) các chấm trên microarray thường có đường kính 200 μm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner)

Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 μm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 μm

Hình 2: kích thước cDNA

a. Theo mật độ mẫu dò (mật độ thấp,cao,vừa)

b. Theo loại mẫu dò (cell array, glycan array,DNA array,protein array…

bằng : đồng vị phóng xạ , chất phát huỳnh quang Khi quan sát dưới máy dò tìm đặc hiệu dễ dàng nhận diện cặp mẫu dò nào đã gắn với mẫu DNA hay RNA nào

VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray

Hình 3: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray

Qúa trình thực hiện DNA microarray gồm hai bước chính :

Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon , trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất Giá thể thường được biến đổi

hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng

Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này

Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-

3000 bp) Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên

bề mặt mảng bằng hai cách:

Hình 4: Mẫu dò cDNA

 tổng hợp in situ (oligonucleotide)

Hinh 5: Mãu dò tổng hợp insitu Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (μCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (μFN)) và in mạ (electro

capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai

Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (μWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ

• In kim (Contact-tip deposition printing):Kỹ thuật này có giá trị

thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA Đầu tiên người ta hoà tan axit

nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất ,Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc

Hình 6: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing

Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ

500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2

• In vi tiếp xúc (μCP- Micro-contact printing): Phương pháp μCP có nguyên lý tương tự in kim Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao

Hình 7: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing

• In vi kênh (FN- Micro-fludics network)

FN là kĩ thuật CP cải tiến Trong đó con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thủy tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản

Toàn bộ chíp trừ phần không gian của bộ cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo

vệ bởi lớp Si3N4 Trên cùng của chíp là lớp –streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hóa

Hình 9: In mạ

Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin hóa Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy

qua mỗi điện cực Hiện tại, chíp với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền.

• In quang hoạt (Photolithography)

Công ty Sffymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in situ trên giá thể rắn Qúa trình này dựa trên kỹ thuật công nghiệp bán dẫn

Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân hủy bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn Dùng mặt nạ để hoạt hóa chọn lọc các

vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hóa, kết thúc một chu kỳ Lập lại kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một

“bãi chông” dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ tại những vị trí xác định trên cơ chất Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28cm

Hình 10: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt

• In áp điện (Piezoelectric printing)

In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in bình thường Đầu áp điện tạo ra các giọt trên đầu phân phối Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000

chấm/cm2

Hình 11: Sơ đồ ống phun áp điện Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp

Hình 12: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện Thủ tục nhiều ống phun DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá

Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oliigonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử triyn hóa)

mảng

Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thủy tinh tạo thành hệ thống kênh Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực

Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ

Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu kỳ Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất Hệ thống này cũng có thể được sử dụng

để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể

Hình 13: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng

2. Tiến hành thí nghiệm

a) Chuẩn bị mẫu

Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu Mẫu để lai có thể là DNA hoặc RNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai Cho đến nay đã

có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của

nescent) như digoxigenein, biotin và nhuộm vàng/bạc Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất.

Hình 14: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5

b) Tiến hành lai

Sau khi đánh dấu , tiến hành lai trên mảng Do sử dụng chất mảng rắn nên phương pháp microarry dễ tiến hành hơn các phương pháp blot Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã đánh dấu đi qua mảng Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích Nếu dùng chất mảng thủy tinh,

có thể úp một phiến kính thủy tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe trống giũa chúng bởi lực mao dẫn Một cách đơn giản khac là đặt

trực tiếp mảng trong bể nhỏ chứa dung dịch lai Các điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn vào kích thước mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm Hiệu quả lai có thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trạng thái động so với bề mặt mảng.

c) Xác định và phân tích tín hiệu lai

Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm

microarray rất lớn do trên mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò Tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hóa dữ liệu, đơn giản hóa quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác

Các bước chuyng khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy nhưng

vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên

có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng

Hình 15: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng

tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu.

o Rẻ, có thể tự chế tạo

o Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự

o Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu

o Không có khả năng định lượng

o Cần lượng lớn đích

 Màng chứa mẫu dò oligonucleotide

Các con chíp tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gen khác nhau, mỗi gen được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 cặp mẫu dò khác nhau Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò

có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính xác và loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã nghỉ ra mô mẫu dò bắt cặp hoàn hảo/không hoàn hảo (MM/PM) Oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ một base chính giữa So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu gắn Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau nên không được dùng để đánh giá Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì cường độ tín hiệu lai MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu Tất cả các vùng khác có kết quả lai đặc hiệu và là đối tượng phân tích

lượng đồng nhất và có thể so sánh hiệu quả

trên một aray

trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng Do đó , tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot

Nhược điểm