phương pháp phân tích xác định chỉ số cod và nồng độ amoni, nồng độ nitrat

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Môc lôc Mở đầu Phần 1:Tổng quan 1.1 Rác thải sinh hoạt 1.1.1.Nguồn gốc 1.1.2 Thành phần rác thải sinh hoạt 1.1.3.Phân loại 1.2 Vi sinh vật vai trò vi sinh vật chu trình biến đổi chất 1.2.1 Vi sinh vËt 1.2.2 Vai trß cđa vi sinh vËt vòng tuần hoàn chuyển hoá nguyên tố cacbon 1.2.2.1 Sự phân giải hợp chất Gluxit 1.2.2.1.1 Sự phân giải hợp chất đờng 1.2.2.1.2 Sự phân giải tinh bột 1.2.2.1.3 Sự phân giải Xenlulo 1.2.2.1.4 Sự phân giải Xilan 1.2.2.1.5 Sự phân giải Lignin 1.2.2.2 Sự phân giải Lipit 1.2.2.3 Sự phân giải Protein 1.2.3 Vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá Nitơ 1.2.4 Vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá Photpho 1.2.5 Vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá Lu huỳnh 1.3 Phơng pháp xử lý rác thải sinh hoạt 1.3.1 Xử lý chất thải hữu điều kiện hiếu khí 1.3.2 Xử lý chất thải hữu điều kiện kị khí 1.3.3 Nhu cầu chất dinh dỡng vi sinh vật 1.4 Các yếu tố ảnh hởng đến trình xử lý 1.4.1 Các yếu tố ảnh hởng đến trình ủ rác 1.4.2 Các yếu tố ảnh hởng đến trình xử lý nớc rác phần 2: Thực nghiệm 2.1 Mơc ®Ých cđa thùc nghiƯm Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 2.2 Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học 2.2.1 Phơng pháp chuẩn bị môi trờng dinh dỡng 2.2.2 Chuẩn bị dụng cụ 2.2.2.1 Rửa dụng cụ thuỷ tinh 2.2.2.2 Làm nút bao gãi 2.2.2.3 Khư trïng dơng thÝ nghiƯm 2.2.2.4 Phơng pháp tạo môi trờng 2.2.3 Tiến hành phân lập vi khuẩn 2.2.4 Phơng pháp nuôi cấy 2.2.5 Tinh 2.2.6 Xác định hoạt tính phân huỷ Xenlulo vi khuẩn phơng pháp đặt thạch 2.2.7 Hoá chất dụng cụ 2.3 Phơng pháp phân tích xác định số COD nồng độ amoni, nồng độ Nitrat 2.3.1 Xác định số COD 2.3.2 Xác định amoni nớc rác 2.3.3 Xác định Nitrat Kết thảo luận 3.1.Phân lập vi khuẩn có khả phân giải Xenlulo từ phần chất xơ dày bò 3.2 ứng dụng vi khuẩn từ phần chất xơ vào trình phân huỷ rác thải 3.3 Phân lập vi khuẩn có khả phân giải Xenlulo có nớc rác rò rỉ 3.4 xác định khả phân hủy hợp chất hữu vi khuẩn nớc rác rò ri 3.5 Hớng nghiên cứu Kết luận Tài liệu tham khảo Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Mở đầu Môi trờng trở thành vấn đề mang tính toàn cầu Nó đòi hỏi phải có phối hợp chặt chẽ, lâu dài, đầu t hợp lý, đồng nhằm giảm thiểu ảnh hởng có hại gây suy thoái huỷ hoại môi trờng Cùng với phát triển Khoa học- Công nghệ mức độ đô thị hoá ngày nhanh chóng, nhu cầu ngời tăng nhanh năm gần Từ thực tiễn, chất thải rắn đợc thu gom, mà không đợc phân loại xử lý nguồn phát sinh nên đà gây ô nhiễm môi trờng tất khâu: từ thu gom, lu giữ nhà, rơi vÃi đờng phố vận chuyển đến ô nhiễm bÃi rác Nếu giữ nguyên phơng thức thu gom xử lý chất thải rắn nh quy mô bÃi rác ngày tăng, chi phí cho xây dựng bÃi chứa rác lớn Vấn đề di chuyển, quy hoạch bÃi rác đơn giản Chất thải rắn sinh hoạt mối quan tâm không nhà quản lý, nhà khoa học mà ngời dân địa bàn sinh sống Vấn đề đặt cần có phơng pháp xử lý rác thải phù hợp, tiện lợi, dễ tiến hành nhất, nhằm giữ gìn môi trờng cảnh quan đồng thời giảm thiểu mức độ ô nhiễm Dựa quan điểm đó, với hớng cần phân loại rác thải để phục vụ cho mục đích phân huỷ phơng pháp sinh học Trong nội dung khoá luận này, tập trung nghiên cứu : Phân lập, tuyển chọn ứng dụng số vi khuẩn có khả phân giải xenlulo, góp phần xử lý rác thải sinh hoạt Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Tổng quan 1.1 Rác thải sinh hoạt 1.1.1 Nguồn gốc Rác thải sinh hoạt tạo tõ c¸c ngn chđ u sau : - Tõ c¸c khu dân c - Từ trung tâm thơng mại - Từ sở trờng học, công trình công cộng - Từ dịch vụ đô thị, sân bay - Từ hoạt động xây dựng đô thị - Từ trạm xử lý nớc thải, đờng ống thoát nớc thành phố 1.1.2 Thành phần Rác thải sinh hoạt có thành phần phức tạp nh : - Những hợp chất vô cơ: kim loại, sành sứ, gạch ngói vỡ, đất đá - Những hợp chất hữu cơ: loại thực phẩm d thừa hạn sử dụng, xơng động vật, rau xanh, vỏ hoa quả, loại tre gỗ, lông gà, lông vịt, vải sợi, giấy, xác ®éng - thùc vËt, cao su, nhùa - Nh÷ng loại khác: hợp chất dễ bay hơi, có chất mang mùi nặng 1.1.3 Phân loại Rác thải đợc đa vào môi trờng từ nhiều nguồn khác Dựa tính chất thành phần chia rác thải sinh hoạt thành nhóm sau: ã Nhóm 1: Chất thải thực phẩm Đó loại thức ¨n d thõa, hoa qu¶, rau xanh ChÊt th¶i thực phẩm hợp chất hữu cơ, mang chất sinh học Vì vậy, chúng dễ bị phân huỷ đờng sinh học Quá trình phân huỷ chúng tạo nên mùi khó chịu CO2, NH3, H2S đặc biệt thời tiết ẩm ã Nhóm 2: Chất thải từ hoạt động công nghiệp, xây dựng Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Gåm loại phế thải: đất đá, gạch ngói, bê tông, vật liệu kim loại, thuỷ tinh, chất dẻo Đây nhóm chất thải khó phân huỷ, bền vững theo thời gian Trong đó, vật liệu kim loại, thủy tinh, loại chất dẻo tái sử dụng thành vật liệu composit số dạng đặc biệt khác ãNhóm 3: Chất thải từ nông nghiệp Là chất thải mẩu thừa từ hoạt động sản xuất nông nghiệp (trồng trọt, thu hoạch) loại trồng, phế thải từ trình chế biến sữa, lò giết mổ Nhóm đợc tập kết với nhóm để xử lý phơng pháp phân huỷ sinh học 1.2 Vi sinh vật vai trò vi sinh vật chu trình biÕn ®ỉi chÊt 1.2.1 Vi sinh vËt Vi sinh vËt (Microbe, Microorganism) sinh vật nhỏ bé không thÊy b»ng m¾t thêng Chóng gåm: vi rót, vi khn, vi nấm, số động vật nguyên sinh tảo Trong tự nhiên, vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trình chuyển hoá chất, chúng có khả lớn trình phân giải hợp chất hữu Chúng tham gia vào việc phân giải biến chất có hại thành chất vô hại Tuy nhiên khả hoạt động chúng tuỳ thuộc vào yếu tố môi trờng: nồng độ hợp chất hữu cơ, kim loại nặng có tính độc, loại hoá chất độc hại khác, ®é pH, ®iỊu kiƯn nhiƯt ®é, nång ®é oxy hoµ tan 1.2.2 Vai trß cđa vi sinh vËt vòng tuần hoàn chuyển hoá nguyên tố cacbon Cacbon nguyªn tè rÊt phỉ biÕn tù nhiªn Nã tham gia vào việc cấu thành hợp chất có vai trò quan trọng đặc trng cho sống ngời động vật Các hợp chất cacbon quan träng tíi møc ngêi ta gäi hƯ thèng sèng lµ hệ thống cacbon Các hợp chất cacbon hữu có mặt động - thực vật, vi sinh vật Khi sinh vật chết để lại lợng chất hữu khổng lồ trái đất Nhờ hoạt động nhóm vi sinh vật dị dỡng cacbon, hợp chất hữu dần bị phân Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 huû đến sản phẩm cuối CO 2, H2O Thực vËt vµ mét sè vi sinh vËt tù dìng quang sử dụng CO2, H2O trình quang hợp tổng hợp nên hợp chất cacbon hữu thực vật Động vật ngời sử dụng cacbon hữu từ thực vật động vật để tổng hợp nên hợp chất cacbon hữu đặc trng cho thông qua đờng đồng hoá dị hoá Quá trình hô hấp ngời, động vật thải CO2 Sau chết xác động vật ngời bị phân huỷ dới tác dụng vi sinh vật Cacbon động vật Cacbon thực vật Chất hữu đất CO2 Hình 1: Vi sinh vật chu trình chuyển hoá cacbon 1.2.2.1 Sự phân giải hợp chất Gluxit Các hợp chất Gluxit thành phần chủ yếu chất khô thực vật (rau quả, cối ) Đồng thời, nguồn lợng cho trình sống thực vật Khi thực vật (cây cối, rau ) chết để lại lợng lớn hợp chất Gluxit Quá trình chuyển hoá hợp chất Gluxit nh sau: I.2.2.1.1 Sự phân giải hợp chất đờng Xenlulo tinh bột bị phân giải tạo thành đờng đơn Đờng đơn tiếp tục bị phân giải dới tác dụng vi sinh vật theo đờng lên men (etylic, lactic, butyric, focmic) Nhiều loài vi khuẩn kị khí hiếu khí tuỳ tiện tham gia vào trình lên men Saccharomyces cerevisae - loại nấm men-là tác nhân lên men mạnh nhất, đợc sử dụng trình lên men rợu, bia Ph¶n øng : Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 S.cerevisae C6H12O6 2C2H5OH+2CO2 Quá trình lên men lactic dới tác dụng vi khuẩn họ Lactobacteriaccae Streptococcus lactics Phản ứng : Lactobacteriaccae C6H12O6 2CH3CHOCOOH Quá trình lên men Butyric thực chi vi khuẩn Clostridium Ngoài ra, trình trao đổi chất nhãm vi sinh vËt dÞ dìng hiÕu khÝ tham gia vào trình phân giải đờng Glucoza thành CO2, H2O 1.2.2.1.2 Sự phân giải tinh bột Tinh bột (C6H10O5)n hợp chất hydratcacbon cao phân tử Tinh bột chiếm tû lƯ lín thùc vËt, díi d¹ng h¹t tinh bét NhiỊu vi sinh vËt tiÕt hƯ enzym amylaza ( α - amylaza, β -amylaza, γ amylaza) ph©n hủ tinh bột thành hợp chất đơn giản: đờng axit hữu Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả phân giải tinh bột: Nấm Aspergillus awarmorii Vi khuÈn Bacillus amyloliquefaciens B.subtilis A.candidus A.niger B.coagulans Candida japonica Clotridium amyloliticum 1.2.2.1.3 Sự phân giải Xenlulo Xenlulo thành phần màng tế bào thực vật Xenlulo có rau (vỏ hạt, vỏ tế bào, vỏ ) Thực vật chết để lại lợng lớn xenlulo thân cây, cành rụng xuống Hàm lợng xenlulo xác thực vật thờng thay đổi khoảng 50-80% Một phần khác ngời tạo dạng chất thải: rác, rơm rạ, giấy vụn, mùn ca, vỏ bào, Có thể tính toán tổng lợng xenlulo trái đất vào khoảng 3500 tỉ Nếu nh trình phân giải xenlulo lợng chất ngập tràn trái đất Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Trong tù nhiªn cã nhiỊu loµi vi sinh vËt - mang hƯ enzym xenluloza ngoại bào - có khả phân hủy xenlulo.Việc vi sinh vËt ph©n hủ xenlulo cã ý nghÜa rÊt lớn vòng tuần hoàn địa hoá, góp phần nâng cao độ phì nhiêu cho đất nh vào việc tiêu hoá thức ăn loài động vật nhai lại Hệ vi sinh vật phân giải xenlulo phong phó bao gåm : nÊm, x¹ khn, vi khn Chóng bao gồm hệ vi sinh hiếu khí yếm khí Do đó, trình phân huỷ xenlulo diễn theo hai đờng hiếu khí yếm khí ã Phân giải xenlulo điều kiện hiếu khí Một sè vi sinh vËt tham gia ph©n hủ Xenlulo ®iỊu kiƯn hiÕu khÝ: NÊm Alternaria X¹ khn Actinomyces Vi khuÈn Acetobacter xylinum Aspergillus ustus Micromonospora Achromobacter a.candidus Streptomyces Pseudomonasflourescens Botritis Chaetomiumglobosum Str.cellulosae Str.celluloflavus C.thermophil Fusariumoxysporum Trong ®iỊu kiƯn hiÕu khí vi sinh vật thực phân huỷ xenlulo mạnh Đặc biệt xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả phân giải xenlulo đợc ứng dụng trình phân huỷ rác thải sinh hoạt Những xạ khuẩn thuộc nhóm a nóng, sinh trởng, phát triển tèt nhÊt ë nhiƯt ®é 45- 50 °C, rÊt thÝch hợp với trình ủ rác Hai enzym tham gia phân huỷ xenlulo xenlulaza C xenlulaza Cx enym xenlulaza C1 tác động sơ vào phân tử xenlulo thiên nhiên biến chúng thành chuỗi xenlulo mạch thẳng Sau đó, dới tác dụng enzym xenlulaza Cx , xenlulo bị phân huỷ thành xenlobiose (gồm phân tử gluco) Loại đờng có thĨ tan níc, díi t¸c dơng cđa β- glucosidase biến thành gluco ã Phân giải xenlulo điều kiện yÕm khÝ Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Ngoài vi sinh vật hiếu khí mét sè vi sinh vËt yÕm khÝ còng tham gia tích cực vào trình phân huỷ xenlulo Clotridium thermocellum, Clotridium omelianskii tham gia phân huỷ xenlulo đờng lên men xenlulo C.thermocellum loài vi khuẩn có hoạt tính phân giải xenlulo đợc nghiên cứu đợc phân lập từ phân ngựa Đặc điểm C.thermocellum : lúc non có hình que ngắn, trởng thành có hình uốn cong, kích thớc dài, bào tử sinh đầu Chúng phát triển tốt môi trờng có nguồn xenlulo xenlubiose, nguồn NH4+, nhiệt độ thích hợp 60-65C Sản phẩm trình lên men : etanol, axit axetic, axit focmic, H2, CO2 Đặc biệt, nhóm vi sinh vật có khả phân giải xenlulo mạnh điều kiện yếm khí nhóm vi sinh vật sống cỏ trâu, bò động vật nhai lại Trong nghiên cứu cho thấy: 1ml chất lấy từ cỏ bò có khoảng 109-1010 tế bào vi khuẩn Hệ vi khuẩn động vật nguyên sinh cỏ động vật nhai lại gồm nhiều loài có khả phân giải xenlulo : Bảng 3: Hệ vi khuẩn động vật nguyên sinh cỏ động vật nhai lại Hệ vi khuẩn Hệ động vật nguyên sinh Ruminococcus flaveciens Ophryoscolex Bacteroid succinogenes Isotrich Clotridium cellobioparum Nhê cã hÖ vi sinh vËt phong phú, số lợng lớn nh nên giúp cho trâu bò động vật nhai lại tiêu hoá đợc cỏ, rơm rạ, hợp chất xenlulo khác Chính điểm đặc biệt nh Trong nghiên cứu này, đặc biệt ý ®Õn hƯ vi sinh vËt sèng d¹ cá cđa loài động vật nhai lại nh : trâu, bò, ngựa 1.2.2.1.4 Sự phân giải Xilan Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Xilan (Hemixenlulo) cã nhiÒu xác thực vật Hemixenlulo cấu tạo đơn vị nhỏ gốc - Xylose Trong rơm rạ khô Xilan chiếm 1520%, bà mía 30%, gỗ thông 7-12% Nhiều vi sinh vật nh nấm mèc, nÊm men, vi khuÈn tiÕt enzym Xilanaza cã khả phân giải Xilan 1.2.2.1.5 Sự phân giải Lignin Các hợp chất Lignin có gỗ chiếm 20-30% Đơn vị cấu trúc Lignin dẫn xuất phenylpropan Trong có 69%C, 7%H, 24%O Lignin có cấu tạo vô định hình không tan nớc axit vô Chỉ với kiềm, bisunfit natri, H 2SO4 Lignin bị phân huỷ phần chuyển sang dạng hoà tan Sự phân giải Lignin nhanh phổ biến tự nhiên loại nấm Các loại nấm tiết enzym Phanerochaeto Chrysosporium phân huỷ hầu hết thành phần gỗ kể Lignin gồm nhóm: - Nấm mục trắng: chủ yếu Basidomyces số ascomycetes nhóm phân huỷ Lignin hữu hiệu - Nấm mục nâu: gồm số Basidomycetes tác dụng công vào polysacarit gỗ, Lignin không bị phân huỷ nhng bị biến tính - Nấm mục mềm: gồm số actinomyces xâm nhập vào thành thứ cấp tế bào gỗ điều kiện ẩm cao, vi sinh vật làm mềm tế bào gỗ, làm giảm đáng kể trọng lợng Khả phân huỷ Lignin vi khuẩn thấp Lignin bền vững điều kiện yếm khí, chúng bị phân huỷ điều kiện hiếu khí mạnh mẽ Thông thờng, phân giải Lignin xảy đồng thời sử dụng nguồn cacbon khác: glucose, xenlulo Riêng Lignin vi sinh vật sử dụng làm nguồn dinh dỡng đợc Nói chung phân huỷ Lignin khó khăn Điều ảnh hởng lớn đến hiệu trình xử lý ủ rác 1.2.2.2 Sự phân giải hợp chất Lipit Trong rác thải sinh hoạt hợp chất Protein, Gluxit phần khác hợp chất Lipit (este Glixerin axit béo), chất Sáp (este phức tạp axit béo rợu cao phân tử đơn chức) Sáp lớp bao phủ bên l¸ 10 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Các dụng cụ thuỷ tinh để nuôi cấy vi sinh vật phải thật tơng đối trung tính Các vết mỡ, vết hoá chất, môi trờng dính lại dụng cụ thuỷ tinh ¶nh hëng xÊu ®Õn kÕt qu¶ thÝ nghiƯm Thủ tinh míi mua vỊ tríc sư dơng ph¶i rưa thËt sau ngâm đêm dung dịch HCl hay H2SO4 1-2 % råi rưa níc thËt kü vµ sấy khô Các dụng cụ vừa dùng để nuôi cÊy vi sinh vËt tríc rưa ph¶i hÊp khư trùng áp suất 1atm 30 phút Nếu nuôi cấy loại vi sinh vật biết không gây bệnh bỏ qua giai đoạn Tránh dùng cát sỏi để cọ dụng cụ thuỷ tinh dễ làm xây sát làm mờ thuỷ tinh Rửa kỹ nớc sấy khô Đối với pipet trớc hết lấy que nhỏ để khều nút dùng vòi nớc cho chảy ngợc pipet để kéo hết cặn có pipet Pipet rửa xong nên ngâm vào dung dịch rửa ngày đem rửa lại Dung dịch rửa sulfo-cromic ®ỵc pha chÕ theo tû lƯ: K2Cr2O7 : 60 g H2SO4 : 66 ml H2O : 1000 ml §em 60g K2Cr2O7 hoà tan vào 500 ml nớc Thêm từ từ 66 ml H2SO4 đặc, cuối thêm 500ml nớc K2Cr2O7 tác dụng với H2SO4 sinh axit cromic Chất có tác dụng oxy hoá mạnh, tẩy vết bẩn dụng cụ thuỷ tinh Dịch ngâm sulfo- cromic dùng nhiều lần biến thành màu lục đen h·y bá ®i Cho dơng thủ tinh ®· rưa vào ngâm dung dịch sulfo- cromic khoảng 1-2 ngày rửa thật kỹ nớc Không nên đem dụng cụ lọc vi khuẩn ngâm vào dịch sulfo-cromic Đối với dụng cụ thuỷ tinh có dính mì, vazolin, dÇu, parafin tríc rưa cÇn lÊy mét tẩm xylen để lau cho dùng nớc xà phòng nóng để rửa Cũng đun sôi 30-60 phút dung dịch NaHCO3 5% 2.2.2.2 Làm nút bao gói Trớc khử trùng dụng cụ thuỷ tinh cần làm nút bao gói Làm nút cho ống nghiệm bình tam giác: Cần phải làm nút vừa phải, không lỏng quá, không chặt quá, không ngắn quá, không dài Đầu nút phải tròn, gọn không méo mó xổ 26 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Có thể cuộn lại, cuộn cần gấp phía nút dày Tốt dùng que nhỏ ấn vào miếng có kích thớc vừa phải đặt đầu ống nghiệm bình tam giác, sau dùng tay sửa lại cho gọn Đối với pipet: Cần lấy sợi thép nhỏ để nhét vào đầu lớn pipet Cần phải ý chặt không nút đợc, lỏng dễ bị nhiễm trùng Đối với ống nghiệm, bình tam giác sau làm nút xong cần bọc đầu lại mảnh giấy dầu giấy báo để hấp khử trùng nớc không làm ớt nút Pipet, hộp lồng (hộp petri), que gạt thuỷ tinh, trớc khử trùng cần bao kỹ giấy báo giấy để khử trùng xong giữ đợc dụng cụ trạng thái vô trùng 2.2.2.3 Khư trïng dơng thÝ nghiƯm Dơng thÝ nghiƯm (thuỷ tinh, sứ, vải, kim loại) sau làm nút bao gói cẩn thận đợc mang khử trùng cách sấy nhệt độ 160-170C 1,5-2 Các dụng cụ dùng để đựng môi trờng nuôi cÊy vi sinh vËt bao giê cịng ph¶i khư trïng sức nóng khô, sau phân phối môi trờng vào khử trùng sức nóng ớt Không nên cho nhiệt độ khử trùng sức nóng khô vợt 180C làm nh nút bao gói giấy cháy Các dụng cụ đà khử trùng xong đem cất vào nơi khô sẽ, sử dụng bỏ giấy bao gói 2.2.2.4 Phơng pháp tạo môi trờng Cân đun thạch (với môi trờng đặc), hoá chất (theo công thức loại môi trờng ) tan Điều chØnh pH b»ng NaOH hc CH 3COOH Khi khư trïng pH thờng bị giảm nên phải điều chỉnh pH tăng lên chút Môi trờng đặc tăng lên 0.4 môi trờng dịch thể tăng lên 0.2 Lọc phân phối môi trờng vào bình cầu, bình tam giác ống nghiệm Đậy nút bao gói đầu bình Ghi rõ loại môi trờng ngày sản xuất Hấp tiƯt trïng ë atm, 120°C 30 27 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Nguyªn liƯu hóa chất phải bảo đảm chất lợng số lợng làm môi trờng Môi trờng tạo phải thật Công thức số loại môi trờng Môi trờng thạch thờng cải tiến: Pepton :10g Nớc mắm :10ml Thạch aga : 15-20g Nớc máy : 990ml Môi trờng Xenlulo: CMC( Cacboxymetyl Xenlulozơ): 5g Pepton : 5g Thạch aga : 15-20g Nớc mắm :10ml Nớc máy :990ml Môi trờng cao thịt bò vi luợng: Thịt bò : 10g Phân bón tổng hợp : 10g Thạch aga :15-20 g Nớc :1000ml 2.2.3 Tiến hành phân lập vi khuẩn - Chuẩn bị nớc vô trùng để pha loÃng mẫu: lấy vào ống nghiệm (đà khử trùng) khoảng 9ml nớc máy Đậy nút bao gói ®Çu èng, sau ®ã khư trïng b»ng søc nãng 1atm 30 phút - Lắc mẫu, dùng 1ml mÉu pha lo·ng 9ml níc v« trïng ta có độ pha loÃng 10 1.Tiếp tục pha loÃng gấp 10 lần để có nhiều nồng độ khác 10 –2 ®Õn 10 –6 t theo kinh nghiƯm, víi mẫu khác mà nên tiến hành phân lập từ độ pha loÃng Dùng pipet vô trùng để hút mẫu nhỏ giọt (1-2 giọt) đĩa petri cã chøa m«i trêng nu«i cÊy vi khuÈn Sau dùng que gạt thuỷ tinh inox vô trùng gạt bề mặt môi trờng - Những hộp petri đà đợc cấy bao gói cẩn thẩn ®Ĩ tđ Êm 24-48 giê Khi khn l¹c ®· mọc tốt bề mặt môi trờng, chọn hộp petri có độ 28 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 phân tán khuẩn lạc (không dày đặc không tha quá) để tiến hành chọn khuẩn lạc có khả ứng dụng tốt 2.2.4 Phơng pháp nuôi cấy Muốn nghiên cứu đặc ®iĨm sinh häc cđa tõng lo¹i vi sinh vËt, ngêi ta phải cấy chúng môi trờng dung dịch Vậy cấy công việc đa tế bào vi sinh vật vào tế bào đà khử trùng Khi cấy (hoặc cấy chuyển) phải tiến hành theo quy tắc định đảm bảo cho giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm vi sinh vật khác Dụng cụ để cấy gồm: que cấy, que gạt Các dụng cụ đợc khử trùng cách đốt lửa đèn cồn 2.2.5 Tinh Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trờng thạch nghiêng (trong ống nghiệm), cấy thành đờng thẳng liên tiếp góc phần t thứ đĩa petri có chứa môi trờng thạch thờng môi trờng xenlulo Khử trùng lại que cấy: lấy đờng thẳng liên tiếp góc phần t thứ hai Tiếp tục lặp lại kín hộp lồng Để hộp petri vào tủ ấm khoảng 2448 Khi xuất khuẩn lạc riêng rẽ đồng dạng hình thái hộp petri, cấy chuyển vào môi trờng thạch nghiêng để giữ giống đem thử hoạt tính sinh hoá 2.2.6 Xác định hoạt tính phân giải Xenlulo vi khuẩn phơng pháp đặt thạch - Để xác định hoạt tính phân giải Xenlulo, cần phải có chủng vi khuẩn đà đợc phân lập khiết - Cấy chúng vào hộp Petri để đợc lớp vi khuẩn mọc dày đặc - Dùng ống kim loại hình trụ có đờng kính 0,8-1 cm, cao 1-1,5 cm để khoanh vi khuẩn - Dùng kẹp vô trùng để đặt khoanh vi khuẩn vào môi trờng thử hoạt tính phân giải Xenlulo (đà khoanh lỗ trống) Khoảng cách vi khuẩn với vi khuẩn phải cm cách thành hộp Petri 1cm - Đọc kết quả: Các hộp Petri để tủ ấm 24-48 Sau đó, lấy đổ dung dịch Lugol vào đọc kÕt qu¶ 29 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 2.2.7 Hoá chất dụng cụ 2.2.7.1 Hoá chất - NaH2PO4 - NaOH - CH3COOH - Pepton, th¹ch aga, nớc mắm, CMC (Cacboxymetyl Cellulozơ) 2.2.7.2 Dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Bình nón, ống nghiệm, hộp Petri, pipet - Que gạt inox, que cấy 2.3 Phơng pháp phân tích xác định số COD nồng độ amoni, nitrat nớc rác 2.3.1 Xác định COD 2.3.1.1 Nguyên tắc Dùng K2Cr2O7 chất oxy hoá mạnh để oxy hoá hợp chất hữu Sau đó, chuẩn độ lợng K2Cr2O7 d dung dịch muối Morh với thị feroin Để oxy hoá hoàn toàn chất hữu mạch thẳng, hydrocacbon thơm khó bị oxy hoá có mặt nớc rác, cần phải cho ag2SO4 làm xúc tác, 80-90% chất đợc oxy hoá Trong nớc có ion Cl- phải dùng HgSO4 để tránh sai số phân tích 2.2.1.2 Chuẩn bị hoá chất a Chuẩn bị dung dịch K2Cr2O7 0,25 N: Sấy khô K2Cr2O7 loại PA 1050C giờ, để nguội bình hút ẩm Cân xác 12,258 g K2Cr2O7 hoà tan nớc cất lần, định mức 1000ml b ChuÈn bÞ dung dÞch amoni sunfat (dung dÞch muối Morh) 0,1 N: Hoà tan 39,2 g sắt amoni sunfat Fe(NH 4)2SO4.6H2O loại PA 20ml H2SO4 đặc, cho vào bình định mức 1000ml nớc cất Mỗi lần dùng muối Morh phải kiểm tra lại nồng độ cách chuẩn dung dịch K2Cr2O7 chuẩn biết trớc nồng ®é 30 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Nồng độ dung dịch muối Morh tính theo công thức : NMorh= VK2Cr2O7 0,25 VMorh c ChuÈn bÞ chØ thÞ feroin: Hoµ tan 1,48g octo- phenan throlin Monohydrat víi 0,695 g FeSO 4.7H2O nớc cất lần, định mức 100ml 2.3.1.3 Quá trình phân tích Lấy Vm (ml) mẫu cho vào bình cầu, thêm V ml dung dịch K2Cr2O7 0,25 N HgSO4 tinh thể lắc Cho thêm 2-3 viên đá bọt, lắp sinh hàn håi lu Hoµ tan mét Ýt ag2SO4 tinh thĨ H2SO4 đặc Đổ từ từ H2SO4 vào bình cầu Đun hồi lu giờ, để nguội Chuyển toàn dung dịch bình cầu sang bình nón, tráng bình cầu nớc cất từ 2- lần Thêm 1-2 giät chØ thÞ feroin ChuÈn K2Cr2O7 d b»ng muèi Morh 0,1 N, dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu nâu đỏ kết thúc phép chuẩn độ Chỉ số COD đợc xác định theo công thức: COD = (V1×N1- V2× N2)×8 ×1000/ Vm (mg/l) Vm : ThĨ tÝch mẫu đem phân tích V1 : Thể tích K2Cr2O7 V2 : ThĨ tÝch mi Morh N1 : Nång ®é đơng lợng K2Cr2O7 N2 : Nồng độ muối Morh : Đơng lợng gam oxy 2.3.2 Xác định amoni nớc rác 2.3.2.1 Nguyên tắc amoni môi trêng kiỊm ph¶n øng víi thc thư Nessler( K 2HgI4), tạo phức màu vàng hay màu nâu sẫm phụ thuộc vào hàm lợng amoni có mẫu nớc Sau đó, ®o ë mËt ®é quang λ = 420nm 2.3.2.2.ChuÈn bÞ thuèc thö 31 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 a Thuốc thử Nessler Dung dịch A: Cân xác 36,0 g KI cho vào bình định mức 1000ml 100ml nớc cất lần Sau đó, cân 13,55 g HgCl cho vào bình lắc kỹ Định mức đủ 1000ml nớc cất lần Dung dịch B: Cân 50 g NaOH ( 57,5 g KOH hoà tan cốc thuỷ tinh, để nguội, định mức 100ml Hỗn hợp thuốc thử A B: Trộn tỷ lệ A 100ml = B 30ml Lắc để lắng gạn lấy phần nớc Đây thuốc thử Nessler Dung dịch đợc bảo quản chai màu bịt kín nót nhùa cao su, tr¸nh ¸nh s¸ng b Thc thư Xegnhit: Cân xác 40g NaOH hoà tan 80ml nớc cất lần, để nguội thêm 60g muối Natri Kali tactrat, định mức đủ 100ml nớc cất Dung dịch Xegnhit bảo quản chai Polyetylen 2.3.2.3 Cách tiến hµnh - Läc mÉu - Pha lo·ng mÉu b»ng níc cất cho nồng độ nằm khoảng đ- ờng chuÈn (