Công nghệ biểu hiện gen trên nấm men

Công nghệ biểu hiện gen trên nấm men

CÔNG NGHỆ GEN GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc NHÓM : 3 LỚP: 52CNSH TOPIC TOPIC TỔNG QUAN Saccharomyces cerevisiae (???!!!) I II TẠO DÒNG TẾ BÀO NẤM MEN BIỂU HIỆN α-AMYLASE CHỊU NHIỆT TRÊN BỀ MẶT TẾ BÀO NỘI DUNG NỘI DUNG  Là sinh vật nhân chuẩn, có thể nuôi cấy với quy mô lớn, cấu trúc gen đã được giải trình vào năm 1996 kích thước 1,35×10 7 I. Tổng quan I. Tổng quan 1. Đặc điểm nấm men  Có đặc tính không gây bệnh, không tạo nội độc tố, có quá trình ứng dụng lâu dài trong thực phẩm nên S.cerevisiae được xếp vào nhóm sinh vật an toàn GRAS.  So với tế bào hữu nhũ, tế bào nấm men sinh trưởng tương đối nhanh.  Có khả năng tạo sinh khối lớn, thao tác di truyền đơn giản, protein sản phẩm được tiết ra môi trường nên thu hồi dễ dàng.  Có các cải biến sau dịch mã (đường hóa, phosphoryl hóa) để tạo protein có đầy đủ hoạt tính sinh học 2. Các loại vector  Hầu hết các vector sử dụng trong tế bào nấm men là những vector vận chuyển mà nó có thể sao chép trong cả E.coli và S.cerevisiae.  Các loại vector: • Vector sát nhập YIp • Vector YEp (plasmid 2 µm) • Vector YRp • Vector YCp • Vector YAC 1 Vector sát nhập YIp 2 Vector YEp 2 loại vector thường dùng Vector sát nhập YIp  Vector sát nhập có tính bền vững cao, chỉ mất 1% qua 1 thế hệ, không cần áp lực chọn lọc.  Sự sát nhập vector vào bộ gen của nấm men xảy ra nhờ sự trao đổi chéo giữa vector và nhiễm sắc thể tạo nên 2 dạng DNA tương đồng mang ở giữa nó là trình tự DNA của vector.  Tần số sát nhập khoảng 1-10 thể biến nạp/µg DNA [...]...3 Gen chọn lọc  Các gen mã hóa cho các enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào  Các gen chọn lọc trội được tìm thấy từ gen ở các tế bào chủ nấm men hoang dại như CUP1 hoặc từ nấm men biến đổi di truyền như G418R 4 Promoter  Các promoter được nhận biết bởi RNA polymerase của tế bào nấm men chia làm 2 vùng chức năng Nhân... nhân tố TATA - Là vị trí gắn các protein điều hòa Công nghệ biểu hiện gen mã hóa enzyme α- amylase chịu nhiệt trên bề mặt tế bào Saccharomyces cerevisiae A Vật liệu 1 Các vi sinh vật  Escherichia coli DH5α Saccharomyces ceereviseae MT8-1 2 các plasmid Plasmid pICAS1 Plasmid pKTH10 - Có kích thước 6,8 kbp, mang gen kháng neomycine và đoạn 2,2kb chứa gen amyQ mã hóa cho enzyme α-amylase từ B.amyloliquefaciens... đó, nuôi cấy lắc ở 37C Chọn dòng E.coli DH5a tăng trưởng mạnh trên môi trường LB-Amp c Kiểm tra kết quả và chọn dòng mang plasmid mong muốn d Tách chiết plasmid từ các dòng E.coli biến nạp theo pp SDS kiềm 2 Chuẩn bị plasmid mang gen đích Plasmid pKTH10 mang gen amyQ thu được làm khuôn mẫu, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen amyQ để kiểm tra plasmid thu được sau khi tách chiết từ các... ứng PCR: Mẫu chứng dương sử dụng plasmid pKTH10 chuẩn Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 3 Tạo dòng pBAmyQ/DH5a a Chuẩn bị DNA gen mục tiêu - Gen amyQ được khuếch đại từ khuôn mẫu là pKTH10 bằng phản ứng PCR - Cặp mồi đặc hiệu cho gen được thiết kế tạo vị trí cắt cho enzyme cắt giới hạn là XhoI và NcoI  Đoạn gen có mang các trình tự cắt chuyên biệt cho enzyme cắt giới hạn XhoI và NcoI 3... sư người Đức Pbluescript Có kích thước 2958bp, chứa gen chọn lọc Amp 3 Thành phần pản ứng PCR • Taq DNA polymerase • Pfu Turbo DNA polymerase • 10X PCR buffer: dùng cho Taq polymerase (KCl 500mM, MgCl2 15mM, Tris-HCl 100mM, pH9) • 10X Pfu PCR butffer • dNTP Cặp mồi để khuếch đại gen amyQ 4 Enzyme cắt giới hạn XhoI NhoI HincII B Quy trình thực hiện Chuẩn bị vector và DNA đích Chuẩn bị E.coli khả nạp... ở 42C ở 42’’ Để lạnh nước đá 5’ Trải trên đĩa mt LB có Ampicillin Ủ ở 37C trong 16h Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng không bổ sung plasmid c Kiểm tra kết quả và chọn dòng mang plasmid mong muốn Sau khi ử ở 37C trong 16h, kiểm tra kết quả biến nạp bằng cách quan sát sự phát triển của E.coli trên các đĩa biến nạp và đói chứng Chọn các khuẩn lạc to và rời rạc trên đĩa biến nạp, cấy vào 5ml môi trường... Dùng bộ kit SephaglasTMBand Prep để tinh sạch mẫu cắt Cắt bằng HincII 3 Tạo dòng pBAmyQ/DH5a c Chèn gen amyQ được vào vector pBluescript bằng phản ứng nối dưới tác dụng của ligase Thành phần phản ứng nối: 3 Tạo dòng pBAmyQ/DH5a 3 Tạo dòng pBAmyQ/DH5a d Biến nạp và sàng lọc pBAmyQ/DH5a DNA dung hợp giữa gen mục tiêu và vector được biến nạp vào E.coli DH5a Chọn các thể biến nạp dựa vào các khuẩn lạc xanh... E.coli khả nạp 50ul E.coli DH5α 500ul dịch nuôi cấy Lắc qua đêm 370C 5ml LB lỏng Lắc trong 2-3h ở 370C Ly tâm thu sinh khối 13000v trong 20 phút, 40C 5ml LB lỏng 1 Bảo quản bằng glycerol 80%, - 800C Thực hiện bước 1 và 2 ba lần Rửa sinh khối thu được bằng 1ml CaCl2, 100mM, lạnh Ly tâm thu sinh khối 13000 vòng trong 20 phút, 40C Huyền phù sinh khối trong 1ml CaCl2, để trong đá ít nhất 1h 2 b Biến nạp plasmid . CÔNG NGHỆ GEN GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc NHÓM : 3 LỚP: 52CNSH TOPIC TOPIC TỔNG QUAN Saccharomyces cerevisiae (???!!!) I II TẠO DÒNG TẾ BÀO NẤM MEN BIỂU HIỆN α-AMYLASE CHỊU NHIỆT TRÊN. protein điều hòa 4. Promoter