Quy trình chuyển gen vào tế bào thuốc lá BY2

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Thiết bị !2!A11!)l%!&7/(9"7%!1B@/(1! 72'9D)<.1!(021!3#(02011!2-17wHX ba00.d1!c`z&-1!1=L(89FN(`7((< :89-:&&-cN(:[(<1:()1`7((<(0<`7((<  2.3. PHƯƠNG PHÁP 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào BY-2 :89-I2JKLM)+,72~((17+5(JKLM98)E&) <<)DMQ•`(I&-2'MR&N(€^:-S17+5((B1 1I&-&1a9E( 1(€210RR1(€21!L2MR1(€2 220•elMc‚ƒRM1(€2MƒLwuR(€20l)+,_&st9W(e‚l:8 2 9-)+,%!!-(S(9"17+5(1&„2<RysRb12.F 89-(sR12ad _=)<89-!/JKLM/,& )<N([(<1^(7)*8-[(<1$)F#+O( B()D89-9)S)8C(%89-`^(782s7(V 7%!yMuƒs9W(2%!2S2+,Rs12…12…s12…M12…Ms 1289-9)S)0172'(sR1217+5(2~(OMQ†`(I b+>(V(&„2<yyRR…ysR…yuuu…yMs…yMRdaC(+O(8 9-)+,$)F9W(-12+,(b[0(1d)+,)012!A1& I)DuRRR&N(€^R121‡9"7%!(I(}2s12( R^&-249~.F 2.3.2. Chuyển gen vào tế bào BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium  :4.F!/ &_X(901 10r0`sQc(&MMtR 1( &0`JuRvYay ˆ"-!(B19++y Lh%!(_GI((U(&-%!&42;17+5(hJ)T=9E ((yr1!0bsR1(€2d1!bsR1(€2d7(E <MQ†`ƒQ(5 L`1D_24;(9<I;)‰_&-%!&-M12 hJ2~(b=9E(24(2+7O17+5(hJ )TdJ"72~()+,)T(1!2'&I)DMRR&N(€^O<)D MQ†` );1 L`!Rs12.F!/)*7 );1(sR12hJ2~(b7( V(d)73B(ƒa@.3(&_X10r0= 1)D)4‚w tRR #(R)984  `_9F89-I2JKLM J(-!+!)E9')S%!!y!1289-JKLM (RR1217+5(17(@2'OMQ†`(I  B(7%! h%!s1289-JKLM&-1‡)‰0JE(sŠ20!(0 bMR‹(€12d&-)‰2'Œ-(X0!(02-1D,%.69!> 3 02=#C(#1V(&(0 & (:L21. X(90110r0L)A!2-1D(U(9<=2-1 C(#C($A1&_&-(89-&.•C( < #!(0:8)89E(RR12.F_X(9011( &0!(0wcŽ21&-OMs•`((-!  z@_&-289-!(0 l(-!)B(7%!8-@_+y La@.3(0012')S72-1E+>(89-^8 9-JKLMG1‡)‰0&-I(rs12 L:;1sL•12a&-1‡I())4ƒLs12&-)#Œas^) 2'(Œ-(^9~S.F9;;:83;1a&-2T249+ @&au2S:83@&17+5(a9E(sRR1(€20r$10M 2S:;1a€0r$10)8M12B)#Œ-( Lh%!1289-)*@4#2;1D)‰c0VsR1217 +5(a9E(sRR 1(€2  0r$10 )249~89- X(901 b7(   2d  &-  12 2; a 9E  ( sRR 1(€2 0r$10  &-  sR 1(€2 1!)2w-)89-;1T4&->sLR^(9$ %!)889-91)2;1T4wcŽ21&-OMs•` Các thí nghim nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau lên hiu quả chuyển gen • Thí nghiệm 1:•+O(B()D_)8< #! (0 $)FB()D&_X(901[,^(78- @(<12+,(.(.F_=‚w tRR ‘RGRR‹2sR‹2MRR‹2MsR‹2 )8uRR‹2aM(-!)B(7A!8-@_&-$)F< # !(0uSl< #!(0)+,$)F9OI2+,(.N(8 9-;17+5(2 • Thí nghiệm 2:•+O(5()B(7%!)8< # !(0y B(7%!0 !"!(0;a9845( )B(7%!!)EO)‰GMu&-ƒ(-!z@_&-$ 4 )F< #!(0uSl< #!(0)+,$)F9OI 2+,(.N(89-;17+5(2 • Thí nghiệm 3:•+O(<)D)B(7%!)8< # !(0y B(7%!0 !"!(0; a984!)E <)D)B(7%!O)‰y••`Ms•`M••`uR•`uu•`u••`a M(-!8-@_&-$)F< #!(0uSl< # !(0)+,$)F9OI2+,(.N(89-;17+5(2 2.3.3. Tôi ưu hóa quá trình chuyển gen thông qua gen chỉ thị Gus i. Phương pháp xác định biểu hin của gen GUS :1•G3189-;17+5(2I& U(89-)+,!%^`JvYa9<(0()+,1 9W(  D1  (  .(  .F  ’L(2  bsR  1  HMlc‚ƒ  &-  HlMc‚ƒ…  l•… R1“eub}0b`Hdt”…  R1  eƒ“b}0b`Hdt”…  R  1  HM|w:X…  R•  :LRR… s1’L(2.0d•89-JKLM)+,(A1(.(.F’L(2&- (E<O<)Du••`5(GMƒLƒQ(5 a5(1•)+,@49W(+%@/(a)=1• )+,)+2;[&E &-3# ue–:ˆ• 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào ban đầu đến năng suất và chất lượng tế bào BY-2 :[(<1%!+O(89-JKLM3D—< &-B()D89-9)S)017%!:()=7(Vs&B()D 2*(&17+5(2-yMR)*)4C(+O(%IA s(-!&-)4I2%2-MRt(€12˜(-!7%! Bảng 1. Sự tăng trưởng của tế bào BY-2 sau 10 ngày nuôi cấy. Công thức Ngày b(€12d Mb(€12d ub(€12d ƒb(€12d sb(€12d R R R R R R 5 M RRRM RRRs RRRu RRRM RRR u RRRƒ RRs RRM RRMƒ RRM ƒ RR RRMƒ RRs RRts RRƒM s RRƒs RRtQ RQR Rsu• Rsƒs t RRtu Rsus Rtt RR ss • RsM• RMQ R˜ Mƒ •M Q Ru RtR Ms •• ˜R ˜ Rƒ• R˜ƒ ƒ˜ Q• MRt R Rss RQs s˜ •t MRR  RuR RtQ us ƒR ˜u w&!„2<yMR)+,@.3([(<180 3.2. Chuyển gen vào tế bào BY-2 :[(<1!(0(&-89-)+,2T24M2S1‡2S )+,s3189-€)‰0a((&[(<1!(0[ (<1)IV()+,829W()T89-7(!(0 2;17+5(a=9E((.<_&-(2 :-9D89-7(!(0)+,)T2;17+5(=9E(( )&-(.S&-8:()=;17+5(2  #(S9')S )+,U(3189-1-'(&-7( =9<)(;2789-!(0&-7(!(0 V(~ "89-I282([(<1-!= < # Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiu quả chuyển gen  Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến hiu quả chuyển gen 6 Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn h7[(<1  M u ƒ s aI‹2.F_ RR sR MRR MsR uRR :Z2<2*( ysR yuuu yMs yMR yyt• aI.N(I( =€)‰ ƒ t MR Q • e8 #(J#(M%!W(&B()D_2-MRR‹2( s1289-JKLM[(<1984)4< #%I.N(89- I(=;17+5(22-MR3189-I)B( )  Thí nghim 2:Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiu quả chuyển gen auS)89-;17+5()T^(7 %!y Lh7LB(7%!(-!y89-)+,;17+5( 2%[1I)‰Z=LM3189-I Lh7MLB(7%!M(-!y89->&27( ™1>&27u Lh7uLB(7%!u(-!y89-I>#&27 [(<1N243189-)B() Lh7ƒLB(7%!ƒ(-!y$%<3189-=1-&-(= <+,(61_O24  Thí nghim 3: Ảnh hưởng của nhit độ đồng nuôi cấy đến hiu quả chuyển gen auS)89-;17+5()T^(7 %!y L<)Duu†`u•†`89-7()+,1-9F8 &-( L<)DuR†`89-%[$%<MLu31€)‰ 7 L<)Dy•†`Ms†`M•†`89-I()=O Ms†`89-I># :G8 #(;VW1_=+>(!(0 &-89-I2-JKLM7( X(901/(&8 #[ (<19E(^(7) !"!(0&-89-I2-JKL M+y L:8289-I2JKLM9W(!1289-JKLM( RR1217+5(17(@2'OMQ†`(Iu(-!+ )B(7%! L:4.F!/&_X(901)4‚w tRR ‘ LB(7%!yh%!s1289-JKLM&-1‡)‰0JE(sŠ2 0!(0 bMR‹(€12d&-)‰ 2'Œ-( JE(MRR12.F _ X(901 1(&0!(0wcŽ21&-OMs•` ((-! LaM(-!8-@_ X J ` w | } l"e8 #!(0&-89-JKLM 8 X:89-)IV(;17+5(7(2 JL}y:89-;17+5(2 J(-!@_ `S@_ wMS@_ |:89-2)+,!()‰17+5(1b2 2SMd }wN(89-)*22SuS7%! 3.1.3. Phân tích sơ bộ tế bào chuyển gen gus bằng nhuộm tế bào h%!3189-I2+O(;17+5(2=V 1!0(A1(.(.F)<1>%’LY2aMƒLƒQ1• D1)+, ;[&EHU(.N(89-!(0 =9<1-$)T+((+(l"M  l"MJ<(0(;89-JKLM `89-!(01(1-$)T+(( H+&!& !"!(0+;^(7)*)+, 89-!(0&<%bR•dHU(8 #-!2-) 9 [(<180W1489-I2JKLM1((0S(; V 10 . #!(0&-89-JKLM 8 X:89-)IV(;17+5(7(2 JL}y:89-;17+5(2 J(-!@_ `S@_ wMS@_ |:89-2)+,!()‰17+5(1b2 2SMd }wN(89-)*22SuS7%! 3.1.3. Phân tích sơ bộ tế bào chuyển gen gus bằng nhuộm tế bào h%!3189-I2+O(;17+5(2=V 1!0(A1(.(.F)<1>%’LY2aMƒLƒQ1• D1)+,. # !(0)+,$)F9OI2+,(.N(89-;17+5(2 2.3.3. Tôi ưu hóa quá trình chuyển gen thông qua gen chỉ thị Gus i. Phương pháp xác định biểu hin của gen GUS :1•G3189-;17+5(2I& U(89-)+,!%^`JvYa9<(0()+,1 9W(. ƒR ˜u w&!„2<yMR)+,@.3([(<180 3.2. Chuyển gen vào tế bào BY-2 :[(<1!(0(&-89-)+,2T24M2S1‡2S )+,s3189-€)‰0a((&[(<1!(0[ (<1)IV()+,829W()T89-7(!(0 2;17+5(a=9E((.<_&-(2 :-9D89-7(!(0)+,)T2;17+5(=9E(( )&-(.S&-8:()=;17+5(2