Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 71 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
71
Dung lượng
3,52 MB
Nội dung
Biolistic Biolistic Transformation Transformation Biến nạp gen bằng súng bắn gen Biến nạp gen bằng súng bắn gen PGS. TS. Nguyễn Thị lang a4. Bắn DNA vào tế bào Đối với tế bào thực vật, muốn thực hiện biến nạp phải tạo tế bào trần mất vách tế bào thì DNA mới ngấm được vào trong. Việc tạo tế bào trần không đơn giản, tốn công sức và thường tế bào có sức sống kém, khó phân chia để tự tái sinh (regeneration). Để khỏi phải làm những công việc kể trên, phương pháp bắn DNA tái tổ hợp trực tiếp vào tế bào thực vật được sử dụng. Các hạt kim loại tungsten hay vàng (đường kính trung bình 4 micrometer) mang DNA hoặc RNA được bắn với tốc độ nhanh xuyên thủng vách tế bào đưa vào trong. Phương pháp này có nhiều ưu thế và được dùng nhiều trong tạo các thực vật nhiễm gen. Sử dụng màng lipid bao DNA đưa vào tế bào. Ví dụ : sử dụng cấu trúc tương tự liposome. Dùng tinh trùng mang DNA tái tổ hợp xâm nhập tế bào trứng. Các vector virus tự động thực hiện tải nạp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao hơn nhiều, nên cũng được sử dụng rộng rãi ở cả tế bào người, động và thực vật. Ngoài ra, còn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào như : Tấm chắn Mô nhận gen lạ thông qua bắn gen Lổ thông gió Kim hỏa Hệ thống năng lượng Nylon Macroprojectil e Microprojectiles Biến nạp gen bằng súng bắn gen Biến nạp gen bằng súng bắn gen - Phương pháp bắn gen với các thuật ngữ gene gun method, particle acceleration method, microprojecticle bombardment, - Được phát triển bởi vì sự chuyển đổi gen qua trung gian agrobacterium tumefaciens - developed because Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây một lá mầm và nhiều loài khác ngoài Solanaceae - Biến đổi gen của cây một lá mầm thì rất quan trọng bởi vì nó tạo thành phần chính yếu cung ứng lương thực của thế giới - Sự chuyển gen tính chất sinh lý học sử dụng phương pháp bắn gen thì đơn giản hiệu quả nhanh chóng để chuyển DNA vào tế bào thực vật - Các mô được biến nạp trong phương pháp này bao gồm mô phân sinh ngọn, mô tế bào, mô sẹo phôi, lá bao mầm, phôi trưởng thành và không trưởng thành, phiến lá, phấn hoa, vi bào tử và cánh hoa, rễ và phần thân - Sự chuyển đổi các gen được nhân bản đã đạt được các thành tựu ở các loài thực vật sau:Arabidopsis Thaliana, bông vải, cây nam việt quất, ngô, đu đủ, cây dương, lúa, miến, đậu nành, mía, thuốc lá, lúa mì và cây vân sam - Sự bổ sung DNA nhiễm sắc thể. Quá trình này có thể làm cho việc chuyển gen và sự biểu hiện gen trong genome lục lạp, ti thể của thuốc lá bền vững và sinh vật đơn bào Chlamydomonas Phương pháp cơ bản để chuyển gen tính chất sinh lý có liên quan đến sự phân bố DNA, thông qua các phân tử nhỏ vàng, tungsten hoặc titanium được áo bên ngoài acid nucleic (DNA ngoại lai, mRNA, hoặc phân tử sinh học) cho quá trính xâm nhập không ảnh hưởng đến màng và vách tế bào, và sự biểu hiện DNA này trong cá thể hoặc mô tế bào - Một vài viên đạn nhỏ vào trong tế bào và DNA sẽ được chuyển mã và giải mã. Kết quả này trong sự biểu hiện gen (biểu hiện thể chuyển gen) trước khi DNA bị thoái hoá hoặc các tế bào chết đi - Trong một vài trường hợp, tế bào sữa chữa những thương tổn cho chính nó, DNA thoát khỏi viên đạn và hợp nhất vào genome thực vật cho phép tiến trình chuyển mã và giãi mã gen ngoại lai xảy ra. Sự hợp nhất này thì được hiểu không rõ ràng nhưng có lẽ nó có liên quan đến cơ chế sữa lỗi DNA tự nhiên của tế bào [...]... thành phần được giữ trong một khoang để tạo môi trường chân không để làm giảm lực đẩy của các phần tử nhỏ With DNA-coated microcprokectiles Súng bắng gen sử dụng khí heli Súng bắn gen với đơn vị PDS-1000/He Khoang áp suất Hoạt động súng bắn gen Bước 1: Thiết bị súng bắn gen làm việc trên lực của chân không và áp suất Một máy bơm gắn kết với khoang tạo ra chân không Một dụng cụ chứa khí heli tạo ra áp lực... chứa gen bar – marker chọn lọc kháng thuốc trừ sâu (Lemaux et al., 1997) - Mã hoá Phosphinotricin acetyltransferase (PAT) làm bất hoạt phosphinotricin (PPT), thành phần chủ yếu của bialaphos Hợp nhất marker chọn lọc (như gen kháng phi sinh học) và reporter gen (GUS gen hoặc βglucuronidase) vào DNA được chuyển gen Vì vậy, sự phân tích PCR và Southern blot có thể được sử dụng để xác định sự biểu hiện gen. .. Southern blot có thể được sử dụng để xác định sự biểu hiện gen được biến nạp Phôi lúa mạch Phôi được bắn gen Mô sẹo kháng thuốc trừ sâu Cây non trên môi trường bialaphos Thế hệ sau cây chuyển gen Mô sẹo phôi Cây non kháng thuốc trừ sâu Không được chuyển gen Cây chuyển gen Thế hệ sau của cây không được chuyển gen ... tử nhỏ tungsten thì có kích thích đường kính trung bình 0.5 đến 2.0 µm Trong một vài trường hợp, kích thích trung bình lá 1µm được sử dụng cho quá trình biến nạp gen hoặc tạo ra thể chuyển gen thành công Chất mang kích thước nhỏ Hạt chuyển gen bằng vàngvàng có kích thước lớn hơn (hình cầu) và đồng bộ (dao động từ µm), giảm độc tính DNA được áo mỏng trên bề mặt của các chất mang phần tử nhỏ bằng cách...- Một khi quá trình biến nạp gen hoàn thành, các tế bào biểu hiện gen ngoại lai chắc chắn phải được chọn lọc - Thông thường, chúng ta sẽ sử dụng marker chọn lọc để chèn vào cấu trúc DNA Các marker chọn lọc này phải kháng thộc trừ sâu hoặc kháng sinh học (VD: phosphinotricin, kanamycin) Quá trình này tạo ra sự biến nạp gen bền vững khi DNA ngoại lai được nhân bản cùng với DNA... cho phép màng tạo ra khoảng cách ngắn mà không tạo ra các mãnh vụn (phá huỷ tế bào hoặc mô) tác động ảnh hưởng đến màng thanh lọc (stopping screen) - Màng chỉ sử dụng được một lần sau mỗi tiến trình bắn gen Bước 4: Một tấm lưới kim loại hình tròn (stopping screen) đặt dưới macrocarrier Bước 5: Môi trường chân không được tạo ra trong máy bơm Khí heli được chuyển đến Đĩa ngăn cách sẽ ngăn cản khí heli... vật, và sẽ được chuyển mã và giải mã trong quá trình sống của thế hệ sau của chúng Nhìn chung, Phân tử kim loại áo DNA rất nhỏ thì được giữ trong macroprojectile Một sự phóng điện (từ một chất nổ bột súng hoặc từ phá vở một màng được gắn chặt trong khoang áp suất) để đẩy macroprojectile Macroprojectile sẽ dừng lại do một tấm kim loại (stopping plate) nhưng microprojectile có thể tiếp tục vào trong... vật liệu được xử lý Đối với hầu hết tế bào, 1000psi thì gần như là mức độ tối ưu, áp suất lớn hơn có thể là nguyên nhân tạo ra sự va chạm giữa khí heli, nâng mức độ thương tổn và giảm hiệu quả biến nạp gen Bước 7: Macrocarrier di chuyển và đụng tấm kim loại thanh lọc stopping screen) Các phần tử nhỏ vàng/tungsten thoát ra macrocarrier, xuyên qua tấm kim loại thanh lọc và di chuyển với vận tốc cao hướng . nhận gen lạ thông qua bắn gen Lổ thông gió Kim hỏa Hệ thống năng lượng Nylon Macroprojectil e Microprojectiles Biến nạp gen bằng súng bắn gen Biến nạp gen bằng súng bắn gen - Phương pháp bắn. Biolistic Biolistic Transformation Transformation Biến nạp gen bằng súng bắn gen Biến nạp gen bằng súng bắn gen PGS. TS. Nguyễn Thị lang a4. Bắn DNA vào tế bào Đối với tế bào thực vật, muốn thực. khoang để tạo môi trường chân không để làm giảm lực đẩy của các phần tử nhỏ Súng Súng bắng gen bắng gen sử dụng sử dụng khí heli khí heli