súng bắn gen

Biến nạp gen bằng súng bắn gen- Phương pháp bắn gen với các thuật ngữ gene gun method, particle acceleration method, microprojecticle bombardment, - Được phát triển bởi vì sự chuyển đổi

Biolistic Transformation

Biến nạp gen bằng súng bắn gen

PGS TS Nguyễn Thị lang

a4 Bắn DNA vào tế bào

Đối với tế bào thực vật, muốn thực hiện biến nạp

phải tạo tế bào trần mất vách tế bào thì DNA mới

ngấm được vào trong Việc tạo tế bào trần không đơn giản, tốn công sức và thường tế bào có sức sống kém, khó phân chia để tự tái sinh (regeneration) Để khỏi phải làm những công việc kể trên, phương pháp bắn DNA tái tổ hợp trực tiếp vào tế bào thực vật được sử dụng Các hạt kim loại tungsten hay vàng (đường

kính trung bình 4 micrometer) mang DNA hoặc RNA được bắn với tốc độ nhanh xuyên thủng vách tế bào đưa vào trong Phương pháp này có nhiều ưu thế và được dùng nhiều trong tạo các thực vật nhiễm gen.

Sử dụng màng lipid bao DNA đưa vào tế bào

Ví dụ : sử dụng cấu trúc tương tự liposome.

Dùng tinh trùng mang DNA tái tổ hợp xâm

nhập tế bào trứng.

Các vector virus tự động thực hiện tải nạp đưa

DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao

hơn nhiều, nên cũng được sử dụng rộng rãi ở cả

tế bào người, động và thực vật.

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái

tổ hợp vào tế bào như :

Tấm chắn

Mô nhận gen lạ thông qua bắn gen

Lổ thông gió

Kim hỏa

Hệ thống năng lượng

Nylon Macroprojectil e

Microprojectiles

Biến nạp gen bằng súng bắn gen

- Phương pháp bắn gen với các thuật ngữ

gene gun method, particle acceleration

method, microprojecticle bombardment,

- Được phát triển bởi vì sự chuyển đổi gen

qua trung gian agrobacterium tumefaciens

- developed because Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây một lá mầm và

nhiều loài khác ngoài Solanaceae

- Biến đổi gen của cây một lá mầm thì rất

quan trọng bởi vì nó tạo thành phần chính

yếu cung ứng lương thực của thế giới

- Sự chuyển gen tính chất sinh lý học sử dụng phương pháp bắn gen thì đơn giản hiệu quả nhanh chóng để chuyển DNA vào tế bào

thực vật

- Các mô được biến nạp trong phương pháp này bao gồm mô phân sinh ngọn, mô tế bào,

mô sẹo phôi, lá bao mầm, phôi trưởng thành

và không trưởng thành, phiến lá, phấn hoa,

vi bào tử và cánh hoa, rễ và phần thân

- Sự chuyển đổi các gen được nhân bản đã đạt được các thành tựu ở các loài thực vật

sau:Arabidopsis Thaliana, bông vải, cây

nam việt quất, ngô, đu đủ, cây dương, lúa,

miến, đậu nành, mía, thuốc lá, lúa mì và cây vân sam

- Sự bổ sung DNA nhiễm sắc thể Quá trình này có thể làm cho việc chuyển gen và sự

biểu hiện gen trong genome lục lạp, ti thể

của thuốc lá bền vững và sinh vật đơn bào

Chlamydomonas

Phương pháp cơ bản để chuyển gen tính chất sinh lý có liên quan đến sự phân bố DNA, thông qua các phân tử nhỏ vàng, tungsten hoặc titanium được áo bên ngoài acid

nucleic (DNA ngoại lai, mRNA, hoặc phân

tử sinh học) cho quá trính xâm nhập không ảnh hưởng đến màng và vách tế bào, và sự biểu hiện DNA này trong cá thể hoặc mô tế bào

- Một vài viên đạn nhỏ vào trong tế bào và DNA sẽ được chuyển mã và giải mã Kết quả này trong sự biểu hiện gen (biểu hiện thể chuyển gen) trước

khi DNA bị thoái hoá hoặc các tế bào chết đi

- Trong một vài trường hợp, tế bào sữa chữa những thương tổn cho chính nó, DNA thoát khỏi viên

đạn và hợp nhất vào genome thực vật cho phép

tiến trình chuyển mã và giãi mã gen ngoại lai xảy

ra Sự hợp nhất này thì được hiểu không rõ ràng nhưng có lẽ nó có liên quan đến cơ chế sữa lỗi

DNA tự nhiên của tế bào

- Một khi quá trình biến nạp gen hoàn

thành, các tế bào biểu hiện gen ngoại lai chắc chắn phải được chọn lọc

- Thông thường, chúng ta sẽ sử dụng

marker chọn lọc để chèn vào cấu trúc

DNA Các marker chọn lọc này phải

kháng thộc trừ sâu hoặc kháng sinh học (VD: phosphinotricin, kanamycin)

Quá trình này tạo ra sự biến nạp gen bền

vững khi DNA ngoại lai được nhân bản

cùng với DNA của tế bào thực vật, và sẽ

được chuyển mã và giải mã trong quá trình sống của thế hệ sau của chúng

Nhìn chung,

Phân tử kim loại áo DNA rất nhỏ thì được

giữ trong macroprojectile

Một sự phóng điện (từ một chất nổ bột

súng hoặc từ phá vở một màng được gắn chặt trong khoang áp suất) để đẩy

macroprojectile

Macroprojectile sẽ dừng lại do một tấm kim

loại (stopping plate) nhưng microprojectile

có thể tiếp tục vào trong mô phía dưới

DNA được chuyển cùng với các phân tử nhỏ

thì được biểu hiện

Hạt phần tử nhỏ tungsten thì

có kích thích đường kính

trung bình 0.5 đến 2.0 µm Trong một vài trường hợp, kích thích trung bình lá 1µm được sử dụng cho quá trình biến nạp gen hoặc tạo ra thể chuyển gen thành công

Chất mang kích thước nhỏ

(Microcarriers)

Hạt chuyển gen bằng vàng-

có kích thước lớn hơn (hình cầu) và đồng bộ

Bất tiện: giá trị cao và tạo

ra biến dị lớn hơn trong hiệu quả của sự áo các phần tử nhỏ

DNA được áo mỏng trên bề mặt của các

chất mang kích thước nhỏ bằng cách

lắng tụ lại với calcium chloride

Chất mang kích thước nhỏ

Sanford (1993) đề nghị rằng kích

thước chất mang phần tử nhỏ không nên vượt quá 1/10 kích thước tế bào

Thành phần chủ yếu

của hệ thống áp suất

sử dụng khí heli

With DNA-coated microcprokectiles

Súng bắng gen

sử dụng khí heli

Súng bắn gen với đơn vị

PDS-1000/He

Khoang

áp suất

Bước 1:

Thiết bị súng bắn gen làm việc trên lực của chân không và áp

suất Một máy bơm gắn kết với khoang tạo ra chân không

Một dụng cụ chứa khí heli tạo ra áp lực là

nguồn cung cấp áp suất

Hoạt động súng

bắn gen

Tiếp theoKhí heli được sử dụng bởi vì:

- Nó là một chất khí

có trọng lượng nhẹ,

có thể phồng ra nhanh chóng sau khi phóng áp suất

-Nó sẵn có

- nó không độc hại đến tế bào thực vật

Bước 2:

Một dĩa nhựa hình

tròn (dĩa ngăn cách) thì được đặt gần lối vào của khí heli

Độ dày đĩa ngăn cách quyết định áp suất khí heli được yêu

cầu để làm đẩy

nhanh các phần tử nhỏ

Tiếp theo

Đường kính màng macrocarrier 2.5cm, dày

0.06mm

- Khối lượng nhỏ của nó cho phép màng tạo

ra khoảng cách ngắn mà không tạo ra các

mãnh vụn (phá huỷ tế bào hoặc mô) tác

động ảnh hưởng đến màng thanh lọc

(stopping screen)

- Màng chỉ sử dụng được một lần sau mỗi tiến trình bắn gen

Bước 4:

Một tấm lưới kim loại hình tròn

(stopping screen) đặt dưới

macrocarrier

Bước 5:

Môi trường chân không được tạo ra trong máy bơm

Khí heli được chuyển

đến Đĩa ngăn cách sẽ ngăn cản khí heli từ lối vào khoang

Kết quả là áp suất được tạo ra trên đĩa ngăn

cách

Bước 6:

Đĩa ngăn cách mở ra

khi đạt được áp suất cực đại của nó Một luồng khí heli vào

khoang và vào

macrocarrier chứa các phần tử nhỏ được áo DNA

tự nhiên của vật liệu được xử lý

Đối với hầu hết tế bào, 1000psi thì gần như là mức độ tối ưu, áp suất lớn hơn có thể là

nguyên nhân tạo ra sự va chạm giữa khí heli, nâng mức độ thương tổn và giảm hiệu quả

biến nạp gen

macrocarrier, xuyên qua tấm kim loại thanh lọc

và di chuyển với vận tốc cao hướng đến mô

mục tiêu đặt ngay bên dưới Môi trường chân không bên trong khoang sẽ đệm cho dòng chảy

Marker có tính chất chọn lọc

- Plasmid pAHC25 chứa gen bar – marker

chọn lọc kháng thuốc trừ sâu (Lemaux et al., 1997)

- Mã hoá Phosphinotricin acetyltransferase

(PAT) làm bất hoạt phosphinotricin (PPT), thành phần chủ yếu của bialaphos

Hợp nhất marker chọn lọc (như gen kháng phi sinh học) và reporter gen (GUS gen hoặc β-glucuronidase) vào DNA được chuyển gen

thể được sử dụng để xác định sự biểu hiện

gen được biến nạp

Mô sẹo phôi

Thế hệ sau của cây không được chuyển gen

Thế hệ sau cây

chuyển gen

Phôi được bắn

gen

Sử dụng súng bắn gen để bắn gen vào phôi

thuộc hợp tử của ngô

1 Bước đầu:

-Mô thực vật: phôi hợp tử chưa trưởng

thành nên được thu hoạch khi chiều dài

1-2 mm (8-14 ngày sau khi thụ tinh)

-mô được chọn là một vào mô có khả năng sống cao như phôi, mô sẹo hoặc lục lạp

hoặc một vật liệu không khác biệt mấy

Phôi thuộc hợp tử bắp chưa trưởng thành (8-14 ngày sau khi thụ tinh)

2 Sự chuẩn bị các phần tử nhỏ vàng với

plasmid DNA cho việc bắn gen

a Vô trùng và không làm đông tụ các phần

tử nhỏ vàng (microcarrier)

b Áo phần từ nhỏ vàng: Plasmid được áo trên phần tử nhỏ vàng 1 hoặc 0.6µm

Plasmids: pBAR or pBAR/GUS +

Plasmid(s) với gen mục tiêu

4 Chọn lọc dòng mô sẹo chuyển gen:

Chọn lọc bialaphos:

• Phôi đu7c5 chuyển đến bề mặt của môi trường trong môi trường bialaphos sau 1-4 ngày sau khi bắn gen (cho phép tế bào hồi phục lại)

• Mô sẹo phôi sẽ được chuyển đến môi

trường tái sinh với bialaphos khoảng

14-21 ngày, sự chọn lọc dễ quan sát đối với các mô sẹo phôi dễ vỡ

Mô sẹo không biểu hiện bất cứ dấu hiệu nào

về sự tăng trưởng thì không được chọn lọc

nhiễm

5 Thanh lọc cây kháng bialaphos

Cây tái sinh từ việc nhân bản mô sẹo được chọn lọc trong môi trường với bialaphosChuyển cây vào nhà kính Phun vào phần đầu lá 1% dung dịch thuốc trừ sâu gây

cháy lá

Sự ghi nhận các cây trồng kháng

sự phá hại lá từ thuốc trừ sâu trong một tuần sau khi xử lý

Được chuyển gen

Không được chuyển gen

Chuyển gen vào lúa mì

Bước đầu tiên trong quá trình chuyển gen

vào cây lúa mì là phân lập phôi chưa trưởng thành Sự phát triển hạch quả của lúa mì thì được vô trùng trên bề mặt Sau đó mô vỏ

quả chậm phát triển và các phôi chưa trưởng thành (0.5-1.0 mm) thì được loại bỏ

Vỏ quả

Phôi chưa trưởng thành thì được đặt trên môi trường gây tạo mô sẹo mà không có

sự chọn lọc thuốc diệt cỏ khoảng 5 ngày

Các mô sẹo được sắp xếp trong một hình tròn trên đĩa petri, tương ứng với khu vực sẽ bị loại bỏ với các phần tử nhỏ vàng được phủ bởi DNA

DNA chứa cả hai là một marker chọn lọc

như một gen kháng thuốc trừ cỏ và một gen mục tiêu được áo trên bề mặt của các hạt

vàng kích thước nhỏ Sau đó các mô sẹo

được đặt trong khoang chân không của

súng bắn gen Áp suất của khí heli được tạo nên và phóng thích các hạt vàng kích thước nhỏ áo DNA và được bắn vào mô sẹo

Khoang chân không Đồng hồ

đo chân không Đồng hồ

đo áp suất

Súng bắn gen

DNA đang được

áo với vàng

Mô sẹo tồn tại trên môi trường khoảng 20 giờ sau khi bắn

Sau đó, chúng được đặt trên một môi

trường chọn lọc chứa thuốc trừ cỏ trong giai đoạn khoảng 3 tuần

Các mô sẹo biểu hiện tăng trưởng mạnh sau

3 tuần trên môi trường chọn lọc thì được chuyển đến một môi trường để tạo chồi

Sau khi nó hình thành chồi con, chúng được chuyển đến dụng cụ chứa môi trường tạo rễ

Các chồi con trong môi trường tạo rễ

Mô sẹo trong môi trường tạo chồi

Các cây non còn nhỏ được cấy vào đất và làm thích nghi khí hậu với điều kiện ẩm độ cao trong khoảng 1 tuần

Theo sau sự thích nghi với khí hậu, cây sẽ được thanh lọc cho tính kháng thuốc cỏ

bằng cách phun xịt với thuốc trừ cỏ có

Cây chuyển gen thành công thì được

chuyển đến nhà kính, phân tích DNA

(phương pháp Southern) cho gen mục tiêu

và cho phép để lấy hạt

Sự phát triển hạch quả của lúa mì

Phôi chưa trưởng thành sau khi phân cắt

Mô sẹo sau 3 tuần tăng trưởng

Mô sẹo sau 3 tuần tăng trưởng trong môi trường tạo chồi

cây con sau một vài tuần trên môi trường tạo rễ

Q: ưu điểm của súng bắn gen

- Súng bằng gen có hiệu quả cao đối với hầu

thuật này trái ngược với kỹ thuật chuyển

gen theo truyền thống)

Có khả năng chèn DNA vào nhân, ti thể và lục lạp (Johnson, 1988, 1990)

Q: Nhược điểm

DNA chèn vào một cách ngẫu nhiên vào genome

ký chủ sau đó mới là sự kiểm soát bởi các nhà

trong genome có thể được không chú ý đến

Giá trị thiết bị cần thiết có thể là vấn đề đáng quan tâm như là một sự bất lợi

Súng bắn gen được chế tạo một cách đơn giản và hiệu quả cao có thể mua được được tạo ra bởi

H.U.Koopp và P.Demel

có thể giải quyết vấn đề này ít nhất 366 USD

(chưa tính đến một vài

thành phần có giá trị)

Triển vọng cho sự cải tiến quá trình chuyển

gen bằng súng bắn gen

Sự chuyển gen tính chất sinh lý học có thể liên quan đến ít nhất một phần tử nhỏ được áo bởi DNA với mỗi tế bào mục tiêu Một sự cải tiến có thể tăng cường tỉ lệ thành công trong chuyển nạp gen một cách nhanh chóng Kỹ thuật hiện tại phân phát các phần tử nhỏ chiếm khoảng 15% của tế bào, vì vậy nghiên cứu để cải tiến sự phân tán và giảm sự thương tổn của các phần tử nhỏ là nhu cầu cấp bách

Tiếp theo

Là phương pháp và hiệu quả của sự kết tủa DNA trên các hạt phần tử nhỏ CaCl2/quy trình áo cây có hoa thì nhạy cảm với các điều kiện thay đổi nhỏ, nó có thể dẫn đến sự không đảm bảo tính chắc chắn trong thí nghiệm

Rõ ràng, công việc hơn hết là nhu cầu tất yếu trong lĩnh vực này để cải tiến tính bền vững trong quá trình phân phối gen

Tiếp theo

Nghiên cứu cách để cải tiến

a Kiểm soát vận tốc và sự xâm nhập của hạt

chuyển gen có kích thước nhỏ vào trong các tế bào và mô chuyên biệt

b Kiểm soát nơi nào DNA của phần tử nhỏ

được chèn vào

c Khả năng kiểm soát noi nào trong DNA

genome ký chủ được chèn vào mà không làm bất hoạt gen được chuyển

Đặc tính về kích thước, hình dáng, mật độ, thành phần hoá học và bề mặt hoá học có ảnh hưởng đến hiệu quả của sự chuyển nạp gen

Nhà thiết kế hạt chuyển gen có kích thước nhỏ cho phép sự kiểm soát các tốt thông số này, tạo ra sự tối ưu hoá tốt hơn trong quá trình bắn gen và nâng cao đáng kể tỉ lệ

chuyển nạp gen di truyền

Tài liệu tham khảo

Clapham, D., Demel, P., Elfstrand, M., Koop, H.-U., Sabala, I and von Arnold, S (2000) Gene transfer by particle bombardment to embryogenic cultures of Picea abies and the production of transgenic plants Scandinavian Journal of Forest Research 15, 151-160.

Johnston, S.A., Anziano, P.Q., Shark, K., Sanford, J.C and Butow, R.A (1988) Mitochondrial transformation in yeast by bombardment with microprojectiles Science 240, 1538-41.

Lewin, B 1994 Genes V Oxford University Press Oxford.

Russell, J.A., M.K Roy & J.C Sanford 1992 Major improvements in biolistic transformation of suspension-cultured tobacco cells In Vitro Cell Dev Biol 28P: 97-105.

Sanford, J.C., Smith, F.D and Russell, J.A (1993) Optimization of the biolistic process for

different bioloical applications Methods of Enzymology 217, 483-509.

Wetterauer, B., K Salger, P Demel, and H Koop Transformation of Dictyostelium discoideum

with a particle gun this is part of a manuscript to be published in BBA

Wilm, T., Demel, P., Koop, H.U., Schnabel, H and Schnabel, R (1999) Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans Gene 229, 31-5.