xây dưng quy trình phân loại nấm candida

XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA I. Đặt vấn đề I. Đặt vấn đề Từ thời Hypocrate và Galen đã đề cập trong y văn thế giới. Frank (1792) Từ thời Hypocrate và Galen đã đề cập trong y văn thế giới. Frank (1792) mô tả lâm sàng bệnh. Wilkinson (1894) căn nguyên do nấm. Lodder và Kreger- mô tả lâm sàng bệnh. Wilkinson (1894) căn nguyên do nấm. Lodder và Kreger- van-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men. Năm 1984 Kreger-van-Rij 196 van-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men. Năm 1984 Kreger-van-Rij 196 loài.Thế giới đã sử dụng nhiều kỹ thuật trong định loại nấm men, tính đến nay loài.Thế giới đã sử dụng nhiều kỹ thuật trong định loại nấm men, tính đến nay phân lập hơn 300 phân lập hơn 300 loài nấm loài nấm Candida. Candida. Điều đó chứng tỏ tỷ lệ nhiễm nấm ngày Điều đó chứng tỏ tỷ lệ nhiễm nấm ngày càng cao. Đặc biệt trước sự gia tăng của các bệnh suy giảm miễn dịch, trong đó càng cao. Đặc biệt trước sự gia tăng của các bệnh suy giảm miễn dịch, trong đó có đại dịch HIV/AIDS và nhiều nguyên nhân khác như: thuốc ức chế miễn dịch, có đại dịch HIV/AIDS và nhiều nguyên nhân khác như: thuốc ức chế miễn dịch, dùng corticoid kéo dài, thừa cân béo phì… dùng corticoid kéo dài, thừa cân béo phì… Hơn nữa, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nhiệt độ và độ Hơn nữa, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nhiệt độ và độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, lan truyền và dễ dàng gây ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, lan truyền và dễ dàng gây bệnh ở người. bệnh ở người. Tại phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượt bệnh Tại phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượt bệnh nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, trong đó số ca xét nghiệm nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, trong đó số ca xét nghiệm dương tính là 11.900.000. Tỷ lệ nhiễm nấm do chủng dương tính là 11.900.000. Tỷ lệ nhiễm nấm do chủng Candida Candida gây ra chiếm gần gây ra chiếm gần 1/3. Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân đã tăng lên gấp đôi. 1/3. Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân đã tăng lên gấp đôi. Điều đó cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trò quan trọng trong việc phục Điều đó cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trò quan trọng trong việc phục vụ bệnh nhân cũng như giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị hiệu quả vụ bệnh nhân cũng như giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. hơn. Qua từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật, những Qua từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật, những người làm công tác xét nghiệm luôn có nhiều cải tiến về kỹ thuật xét nghiệm người làm công tác xét nghiệm luôn có nhiều cải tiến về kỹ thuật xét nghiệm sao cho phù hợp với từng thời kỳ. sao cho phù hợp với từng thời kỳ. Năm 1972 Việt Nam đã áp dụng một số kỹ thuật xác định hình thái và tính Năm 1972 Việt Nam đã áp dụng một số kỹ thuật xác định hình thái và tính chất hoá sinh vi nấm như: chất hoá sinh vi nấm như: • • Khả năng đồng hoá 6 loại đường và lên men đường trong 4 ống pepton Khả năng đồng hoá 6 loại đường và lên men đường trong 4 ống pepton lỏng có Brom crezol và ống Durham… lỏng có Brom crezol và ống Durham… • • Sau đó, năm 1995 đã xuất hiện test mới: Candiselect-4, Lên men đường Sau đó, năm 1995 đã xuất hiện test mới: Candiselect-4, Lên men đường test Auxacolor (Bio-rad), API 20… test Auxacolor (Bio-rad), API 20… • • Gần đây có máy định danh Vitex Gần đây có máy định danh Vitex • • Năm 2010, BV Nhiệt đới Quốc Gia đã thực hiện: “ Cải tiến quy trình Năm 2010, BV Nhiệt đới Quốc Gia đã thực hiện: “ Cải tiến quy trình chẩn đoán nấm chẩn đoán nấm Candida Candida từ bệnh phẩm bằng bộ tranh mẫu”.( từ bệnh phẩm bằng bộ tranh mẫu”.( phụ lục phụ lục ) ) → → Nhược điểm: Nhược điểm: • • Nếu định danh bằng máy Vitek Nếu định danh bằng máy Vitek → → Phụ thuộc vào sự hoạt động của máy Phụ thuộc vào sự hoạt động của máy định danh và không phải đơn vị nào cũng có máy định danh. Nhất là các tuyến y định danh và không phải đơn vị nào cũng có máy định danh. Nhất là các tuyến y tế cơ sở. tế cơ sở. • • Nhiều máy chỉ cài đặt một số chủng thường gặp. Mà trên thực tế bệnh Nhiều máy chỉ cài đặt một số chủng thường gặp. Mà trên thực tế bệnh nấm chiếm tỷ lệ cao và các chủng nấm gây bệnh ngày càng đa dạng và phức nấm chiếm tỷ lệ cao và các chủng nấm gây bệnh ngày càng đa dạng và phức tạp. tạp. • • Bộ tranh mẫu chỉ chẩn đoán sơ bộ 4-5 chủng nấm Bộ tranh mẫu chỉ chẩn đoán sơ bộ 4-5 chủng nấm Candida Candida , mà mỗi , mà mỗi chủng có 5 ảnh nhưng thực tế chỉ có 2-3 ảnh nêu ra sự khác biệt giữa các loài chủng có 5 ảnh nhưng thực tế chỉ có 2-3 ảnh nêu ra sự khác biệt giữa các loài Candida Candida về hình thái vi thể. Tuy nhiên, s về hình thái vi thể. Tuy nhiên, sự minh chứng đó chưa đủ để định loại minh chứng đó chưa đủ để định loại chính xác tên loài Candida gây bệnh. chính xác tên loài Candida gây bệnh. • • Đặc biệt rất khó hoặc không thể định loại được trong trường hợp mẫu Đặc biệt rất khó hoặc không thể định loại được trong trường hợp mẫu bệnh phẩm: bệnh phẩm: + Đồng nhiễm nhiều chủng nấm, + Đồng nhiễm nhiều chủng nấm, + Nghi nhiễm nấm huyết + Nghi nhiễm nấm huyết + Mẫu bệnh phẩm không vô khuẩn: Đờm, phân v.v… + Mẫu bệnh phẩm không vô khuẩn: Đờm, phân v.v… • • Làm cho người thực hiện thụ động vì lệ thuộc hoàn toàn vào các bức hình Làm cho người thực hiện thụ động vì lệ thuộc hoàn toàn vào các bức hình trong bộ tranh mẫu. Đặc biệt họ sẽ rất lúng túng khi gặp chủng nấm cần định trong bộ tranh mẫu. Đặc biệt họ sẽ rất lúng túng khi gặp chủng nấm cần định loại mà không có trong bộ tranh mẫu ( Bộ tranh chỉ đinh danh 4-5 loài. Còn loại mà không có trong bộ tranh mẫu ( Bộ tranh chỉ đinh danh 4-5 loài. Còn thực tế hơn 300 loài Can thực tế hơn 300 loài Candida ). ). • • Thao tác phức tạp. Thao tác phức tạp. • • Tốn kém kinh tế Tốn kém kinh tế Vậy để khắc phục một số hạn chế trên, phòng xét nghi Vậy để khắc phục một số hạn chế trên, phòng xét nghiệm nấm nói riêng và tập thể khoa xét nghiệm nói chung đang từng bước xây dựng một hệ thống quản lý chất lượng chung trong phòng thí nghiệm. Hệ thống này cần những thành phần thiết yếu như: quản lý thiết bị, quản lý nhân sự và kiểm soát quá trình thực hiện. Mỗi yếu tố trên bao gồm rất nhiều khâu, đặc biệt là khâu kiểm soát chất lượng xét nghiệm thông qua xây dựng quy trình thường quy chuẩn. và Nó được coi như là tài liệu hướng dẫn chi tiết giúp ta từng bước thực hiện các thao tác xét nghiệm (SOPS). Đồng thời, đòi hỏi ngắn gọn, rõ ràng, dễ hiểu và phải cập nhật thường xuyên ít nhất mỗi năm một lần. Từ đó, nhằm đảm bảo rằng xét nghiệm do phòng thí nghệm thực hiện là đúng và đáng tin cậy. Đ Để thực hiện tốt công việc đó, chúng tôi luôn nhận được sự quan tâm chỉ được sự quan tâm chỉ đạo và tạo đạo và tạo nhiều điều kiện thuận lợi của Ban Giám Đốc bệnh viện, Ban Lãnh nhiều điều kiện thuận lợi của Ban Giám Đốc bệnh viện, Ban Lãnh đạo khoa Xét nghiệm. Đ đạo khoa Xét nghiệm. Đ ồng th ời, kế thừa kinh nghi kế thừa kinh nghi ệm c ủa những người đi những người đi trước. V trước. V à tiếp thu kiến thức m à tiếp thu kiến thức m ới cập nhật t cập nhật t ừ các chuyên gia Nấm học của các chuyên gia Nấm học của CDC. CDC. Chúng tôi thấy Chúng tôi thấy Cải tiến Cải tiến → → Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm Candida Candida là là cần thiết và quan trọng. cần thiết và quan trọng. Mục đích kỹ thuật: Mục đích kỹ thuật: 1. Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn thời gian, tiết Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn thời gian, tiết kiệm kinh tế nhưng vẫn chính xác. Từ đó, giúp cho chẩn đoán và điều trị các kiệm kinh tế nhưng vẫn chính xác. Từ đó, giúp cho chẩn đoán và điều trị các bệnh lý do nấm Candida bệnh lý do nấm Candida gây ra một cách nhanh v gây ra một cách nhanh v à hiệu quả. à hiệu quả. 2. Đánh giá hi 2. Đánh giá hiệu quả quy trình mới và có so sánh với một số quy trình khác 3. Có thể áp dụng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các tuyến y tế cơ sở Có thể áp dụng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các tuyến y tế cơ sở Yêu cầu: Yêu cầu: 1. 1. Quy trình ngắn gọn, dễ hiểu. Quy trình ngắn gọn, dễ hiểu. 2. 2. Các thao tác kỹ thuật dễ thực hiện Các thao tác kỹ thuật dễ thực hiện 3. 3. Các môi trường được kiểm chuẩn theo hướng dẫn ASM/CDC Các môi trường được kiểm chuẩn theo hướng dẫn ASM/CDC II. Tổng quan II. Tổng quan 1. 1. Vài nét nấm men ( yeast, levure) Vài nét nấm men ( yeast, levure) Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn. Hình tròn hoặc hình bầu dục. Kích thước từ 3 – 10 µm, lớn hơn gấp 10 lần vi khuẩn. Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi. Khả năng thích nghi môi trường đường cao . . Tồn tại trong thiên nhiên và trong các môi trường chứa đường như: hoa quả, rau dưa, mật mía… Tính chất gây bệnh Candida thuộc vi hệ tuy nhiên có thể bền vững hoặc thoáng qua. Người ta có thể tìm thấy Candida ký sinh ở da, họng miệng, đường tiêu hoá và âm đạo…, mà không gây bệnh. Chúng chỉ gây bệnh khi có yếu tố thuận lợi, đặc biệt khi cơ thể suy giảm miễn dịch Những loài Candida khác nhau có độc tính khác nhau nên khả năng gây bệnh cũng khác nhau (Hay gặp nhất là C.albicans). Candida có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan: Ở nông trên da, niêm mạc miệng lưỡi, niêm mạc sinh dục nam, nữ và xâm nhập sâu gây bệnh: Phổi, tim, nhiễm nấm Candida huyết bệnh cảnh lâm sàng diễn biến nặng nề, nguy kịch, có thể tử vong rất nhanh… Ngoài ra, còn gặp một số nấm men khác: Ngoài ra, còn gặp một số nấm men khác: Cryptococcus, Trichosporon, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Rhodotorula, Protheca… Geotrichum, Rhodotorula, Protheca… III. Đ III. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 1. Đ 1. Đối tượng: - B - Bệnh phẩm lâm sàng có xét nghiệm trực tiếp dương tính và nghi nhiễm nấm Candida spp. - Quy trình định loại s - Quy trình định loại sớm nấm Candida - Thời gian: Từ tháng 2 đến tháng 10 năm 2012 2. Vật liệu - Chủng nấm: Chủng chuẩn quốc tế có mã số (ATCC: 90028, 66032, 66029, 22019, MYA-4560, 6258, 201382, 204092) và chủng nấm của bệnh nhân chưa định danh loài gây bệnh - Môi trường: Sabouraud + chloramphenicol, Bột ngô + Tween 80, CHROMO agar Candida, Auxacolor, Huyết thanh người khoẻ đã loại trừ HbsAg (-), HIV(-) và không dùng thuốc kháng nấm trước đó 05 ngày. 2. Phương pháp tiến hành 2. Phương pháp tiến hành 2.1 Xây dựng quy trình định loại sớm 2.1 Xây dựng quy trình định loại sớm Candida Candida   Có 3 điểm “mấu chốt” của quy trình là Có 3 điểm “mấu chốt” của quy trình là ( ( Phụ lục Phụ lục ): ): * * Chọn một thử nghiệm “ Chọn một thử nghiệm “ đầu tiên đầu tiên ” có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm ” có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm sàng lọc nhanh sàng lọc nhanh Candida albicans Candida albicans → → Test mầm giá đậu (Germ tube test): Thời gian cho kết quả sơ bộ là 3h và Test mầm giá đậu (Germ tube test): Thời gian cho kết quả sơ bộ là 3h và test dương tính gặp test dương tính gặp 95% 95% là là C.albicans C.albicans * * Chọn môi trường nuôi cấy vi Chọn môi trường nuôi cấy vi thể chọn lọc để quan sát hình thái vi thể đặc thể chọn lọc để quan sát hình thái vi thể đặc trưng nấm Candida nhưng phải sẵn có dễ mua, rẻ tiền, tự pha chế môi trường. trưng nấm Candida nhưng phải sẵn có dễ mua, rẻ tiền, tự pha chế môi trường. → → Thạch Bột ngô + Tween 80: Hạt ngô được coi là “Thực phẩm vàng” Thạch Bột ngô + Tween 80: Hạt ngô được coi là “Thực phẩm vàng” bởi: Giàu Vitamin tự nhiên nhóm B (B1, B2,B6, Niacin) khoáng chất cần thiết, bởi: Giàu Vitamin tự nhiên nhóm B (B1, B2,B6, Niacin) khoáng chất cần thiết, giàu chất đạm, chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì. Thời gian cho kết quả 02 ngày. giàu chất đạm, chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì. Thời gian cho kết quả 02 ngày. * * Thay đổi cách cấy trên lam để quan sát rõ ràng và nhiều vị trí hình thái Thay đổi cách cấy trên lam để quan sát rõ ràng và nhiều vị trí hình thái Nấm nhưng vẫn tiết kiệm môi trường và thao tác dễ thực hiện. Nấm nhưng vẫn tiết kiệm môi trường và thao tác dễ thực hiện. 2.2 Kiểm tra độ chuẩn xác môi trường pha chế và thao tác kỹ thuật 2.2 Kiểm tra độ chuẩn xác môi trường pha chế và thao tác kỹ thuật - Môi trường Bột ngô + Tween 80 và CHROM agar Candida: Lấy chủng - Môi trường Bột ngô + Tween 80 và CHROM agar Candida: Lấy chủng nấm men chuẩn CDC (ATCC) cấy kiểm tra môi trường sau khi đổ xong. Nếu nấm men chuẩn CDC (ATCC) cấy kiểm tra môi trường sau khi đổ xong. Nếu chủng nấm mọc mang hình thái đặc trưng chủng nấm mẫu → môi trường đó chủng nấm mọc mang hình thái đặc trưng chủng nấm mẫu → môi trường đó pha chế chuẩn. pha chế chuẩn. - Khi thao tác kỹ thuật phải làm đồng thời cùng lúc với chủng chuẩn - Khi thao tác kỹ thuật phải làm đồng thời cùng lúc với chủng chuẩn (ATCC) và mẫu bệnh phẩm cần định loại. Qua đó, vừa làm chứng dương để so (ATCC) và mẫu bệnh phẩm cần định loại. Qua đó, vừa làm chứng dương để so sánh vừa kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của thao tác kỹ thuật. sánh vừa kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của thao tác kỹ thuật. Tóm tắt sơ đồ tiếp cận quy trình định danh nấm Candida spp Tóm tắt sơ đồ tiếp cận quy trình định danh nấm Candida spp Bệnh phẩm Xét nghiệm trực tiếp(+) Sabouraud+Chloramphenicol 24-48h, tº=25-30ºC Khuẩn lạc thuần Test mầm giá (3h, tº=37ºC) (1) Dương tính Âm tính 95% 95% C. albicans C. albicans Non Non . albicans . albicans Bột ngô+Tween 80 (48h, Bột ngô+Tween 80 (48h, tº=25-30ºC ) ) (2) (2) Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác (3) (3) (97%) (97%) CHROM agar Candida CHROM agar Candida 3. Tóm tắt quy trình xét nghiệm 3. Tóm tắt quy trình xét nghiệm - Xét nghiệm trực tiếp: - Xét nghiệm trực tiếp: • • Soi tươi, Soi tươi, • • Nhuộm Gram, Nhuộm Gram, • • Dầm mực tàu. Dầm mực tàu. - Nuôi cấy: - Nuôi cấy: • • Sabouraud with chloramphenicol Sabouraud with chloramphenicol • • Nhiệt độ 25-30ºC, Nhiệt độ 25-30ºC, • • Thời gian 24-48h . Thời gian 24-48h . - Phân loại: - Phân loại: • • Test ống mầm giá đậu Test ống mầm giá đậu • • Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( môi trường Bột ngô), Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( môi trường Bột ngô), • • CROMO agar Candida CROMO agar Candida • • Auxacolor (Bio-rad). Auxacolor (Bio-rad). C. krusei C. krusei C. tropicalis C. tropicalis C. parapsilosis C. parapsilosis C. glabrata… C. glabrata… C. albicans C. albicans Auxacolor Auxacolor Auxacolor 3.1 Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm Candida 3.1.1 Dụng cụ, hoá chất - Kính hiển vi quang học - Ete, cồn 90°, đèn cồn - Lam kính, lá kính - Ống tube thuỷ tinh vô khuẩn - Que cấy, tăm bông vô khuẩn. - Bàn phụ khoa - Mỏ vịt (các kích cỡ) - Pank, bông thấm nước, - Găng tay, khẩu trang. - Thuốc nhuộm Gram, Nacl 9‰, KOH 20%. - Môi trường Sabouraud +Chloramphenicol+ Actidion - Huyết thanh thỏ( hoặc người) - Môi truờng lên men và hấp thu đường. - Môi trường PCB, KIT Auxacolor hãng Bio-rat 3.1.2 Nội dung xét nghiệm 3.1.2.1 Xét nghiệm trực tiếp * Lấy bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm tuỳ thuộc vào vị trí thương tổn. Thông thường bệnh phẩm xét nghiệm tìm nấm Candida là: - Lưỡi miệng: Dùng dao cùn lấy giả mạc trắng, và dùng tăm bông ngoáy họng - Da, móng và rãnh quanh móng: Dùng dao cùn cạo thương tổn da nhẵn, cắt khối sừng mủn dưới móng và cạo rãnh quanh móng. - Bệnh phẩm là máu: phải tiến hành nuôi cấy - Bệnh phẩm dịch não tuỷ: ly tâm lấy cặn để soi tươi, nhuộm soi, nuôi cấy - Nếu là dịch âm đạo trong viêm âm hộ - âm đạo nghi do Candida: Mở mỏ vịt và lấy bệnh phẩm ở cùng đồ sau. * Làm tiêu bản - Bệnh phẩm ở da, niêm mạc lưỡi miệng và móng đem nhỏ KOH 20% và soi kính hiển vi quang học - Dịch cùng đồ sau tiến hành nhuộm Gram hoặc soi trong Nacl 9‰ - Dịch não tuỷ: + Lấy cặn để nhuộm Gram hoặc soi tươi trong Nacl 9‰ + Dầm trong mực tàu, để yên tĩnh 2-3 phút - Đờm: phết tiêu bản nhuộm Gram * Nhận định kết quả - Trên tiêu bản soi tươi: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính 10, 40: + Bào tử nấm men hình tròn hoặc bầu dục, kích thước 3-6- 10µm. Có rất nhiều tế bào men nẩy chồi, đôi khi thấy hiện tượng giả sợi nấm. - Trên tiêu bản nhuộm Gram: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100 Tế bào nấm men có chồi hoặc không, hình tròn hoặc bầu dục, đôi khi thấy sợi nấm hoặc giả sợi. Bắt màu Gram dương. - Trên tiêu bản mực tầu thấy tế bào men nảy chồi hoặc không có vỏ dày, chiết quang. Hình ảnh đó sơ bộ định hướng tới Cryptococcus. 3.1.2.2 Nuôi cấy, định loại - Môi trường: Sabouraud, Chloramphenicol (gentamycine), Actidion - Bệnh phẩm sau khi lấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường trên theo phương pháp ria cấy hoặc cấy điểm. Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay. - Ria cấy từ 2-3 ống, t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24- 48h. * Đại thể - Khuẩn lạc tròn, màu trắng kem, sền sệt, bề mặt trơn nhẵn, có một số chủng thô ráp, sần sùi. Khi để già tạo tua sợi đâm sâu xuống môi trường thạch (C.albicans). * Vi thể - Thay đổi tuỳ theo loài. Nói chung, nấm men hình cầu, hình tròn hoặc bầu dục. Kích thước thay đổi. Tất cả đều sinh chồi và bào tử chồi có thể tròn hoặc thon dài. Thường xuất hiện sợi giả có thể ngắn hoặc dài, đôi khi uốn cong, chia nhánh. Sợi nấm thật thường dài, có thể xuất hiện bào tử màng dầy ( 95% C.albicans) 3.1.2.2.1 Chẩn đoán giống - Dựa vào đại thể (đã nêu trên) 3.1.2.2.2 Chẩn đoán loài Thử nghiệm tạo ống mầm.( Germ tube test) Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C.albicans. Tuy nhiên, chỉ mang tính giả định. - Chuẩn bị: + Môi trường: Huyết thanh ngựa ( hoặc huyết thanh thỏ, người ) + Kỹ thuật: • Lấy pipet hút 200 µl huyết thanh cho vào ống tube thuỷ tinh đã hấp vô khuẩn • Dùng ăng chữ L lấy một lượng khuẩn lạc nhỏ bằng đầu ăng • Hoà tan hoàn toàn vào ống tube đã nhỏ sẵn huyết thanh • Đem ủ ở 37°C, thời gian khoảng 3h • Lấy một giọt dung dịch đó nhỏ lên lam kính sạch, đậy lá kính đem soi dưới kính hiển vi quang học. - Nhận định kết quả: Vật kính 10 nhận định sơ bộ, vật kính 40 khẳng định. [...]... chủng nấm mẫu chưa biết trước tên loài nấm, chỉ biết mã số( ATCC: 90028, 66032, 22019, 66029, MYA-4560, 6258, 201382, 204092)→ Bảng 1 - Áp dụng Quy trình mới” định loại các mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm nấm Candida Bên cạnh đó, vẫn đồng thời áp dụng quy trình mới” với một chủng ATCC nhằm mục đích tạo chứng dương so sánh và kiểm tra độ chính xác thao tác kỹ thuật + Chúng tôi áp dụng quy trình. .. nghiệm - Định danh hầu hết các loài nấm Candida gây bệnh Ngoài ra, định danh một số nấm men khác - Nếu làm thêm kỹ thuật Kháng sinh đồ nấm tiến hành lồng ghép cùng quy trình trên nên bệnh nhân vẫn không mất thêm thời gian chờ đợi kết quả - Triển khai đào tạo và chuyển giao cho tuyến y tế cơ sở 5 Kiến nghị - Triển khai quy trình định loại Candida tại phòng xét nghiệm nấm BV Da liễu TW - Có thể đào tạo... Chúng tôi áp dụng quy trình mới với một số mẫu bệnh phẩm lâm sàng Thường gặp một số loài Candida sau: C albicans, C glabrata, C tropicalis, C krusei,C parapsilosis, C guilliermondii… Bảng 1: So sánh kết quả định loại 6 chủng nấm Candida & 2 chủng nấm men khác (ATCC) Mã chủng số Kết quả quy trình “ Bộ tranh mẫu” quy trình mới” C.albicans Không kết chuẩn Kết quả Ghi chú C.albicans C parapsilosis CDC (ATCC)... chủng nấm men gây bệnh thường gặp Một số lưu ý  Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay  Test ống mầm mang tính giả định nên có thể dương tính giả  Bệnh nhân không dùng thuốc kháng nấm trước đó 3 ngày 4 Kết quả và bàn luận - Tiến hành kiểm định kết quả hai quy trình: “Bộ tranh mẫu” và Quy trình mới” nhằm định danh Candida spp bằng cách: Thực hiện đồng thời các thao tác kỹ thuật áp dụng cả 2 quy trình. .. tình trạng kháng tự nhiên với - Chưa định danh một Fluconazol số loài Candida khác: - Định loại hầu hết các C krusei, C.glabrata loài Candida … * Ưu điểm: Quy trình định loại mới - Thao tác đơn giản, dễ dàng quan sát nấm phát triển - Môi trường tự pha chế, dễ kiếm, cho kết quả nhanh, số lượng nhiều và điển hình (Bột ngô, CHROM agar Candida ) - Tiết kiệm kinh tế (10.000đ/xét nghiệm, chiếm 90% BN) - Rút... lần gạo, mì - Nếu nấm men không sinh bào tử màng dày và sợi nấm giả có thể cần phải làm thêm các thử nghiệm khác - Không được tiến hành nuôi cấy trên lam nếu nghi ngờ là chủng nấm lưỡng hình nguy hiểm Môi trường CHROM agar Candida - Môi trường đổi màu: Tự chuẩn bị - Cách tiến hành: Ria cấy phân vùng khuẩn lạc nấm men lên đĩa thạch - Đọc kết quả sau 2 ngày: Nhận định được ngay các loài Candida bởi mỗi... trưng cho một số loài Candida Kỹ thuật cổ điển Cắt khối thạch vuông và cấy 5 điểm Bào tử màng dày+ giả sợi C kru Thử nghiệm sinh hoá Nấm men Sei Kỹ thuật cũ Lên men đường Đồng hoá đường 48 Kỹ thuật hiện nay Auxacolor 30ºC, 24-48-72h, Định danh 25 loài nấm men API Candida 35ºC, 24-48h Định danh 13 loài nấm men Môi trường tạo màu Mục đích: Chẩn đoán và phát hiện đồng nhiễm nhiều chủng nấm men - Màu tím:... Geotrichu mmm - Xác định 6 loài Candida thể hiện qua 6 màu khác nhau, rất dễ nhận biết C.albicans albicans - Ngoài ra, xác định 2 loài nấm men hay gặp: 48 h 37C Trichosporon Geotricum và trên thạch Chrom C.tropicalis tropicalis Candida Trichosporo nnn C.novergenisi sssssss C.krusei - Thạch Chrom Candida - Đọc sau 48h, 37ºC Ref.: FRANK C ODDS* AND RIA BERNAERTS CHROMagar Candida, a New Differential Isolation... việc phát hiện các chủng nấm đồng nhiễm trên một mẫu bệnh phẩm Lên men đường + Auxacolor( Kit Bio-rad): Nhằm đánh giá khả năng sử dụng 13 loại đường của các chủng nấm men, biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị pH có trong môi trường thử nghiệm Thử nghiệm dương tính khi màu chuyển từ tím sang vàng, còn âm tính cho màu tím Ngoài ra, còn phát hiện sự kháng Actidion của nấm men và phát hiện Enzym... sở - Tiến hành đánh giá độ nhạy cảm các chủng nấm men với kháng sinh chống nấm Tài liệu tham khảo: 1 GS Nguyễn Thị Đào(2003), Bệnh nấm thường gặp, NXB Từ điển Bách Khoa 2 Prof.Dr Victo Silva.V(2011), Clinical MYCOLOGY Workshop, pp 3 Hèlène Koenig (1995), Guide de MYCOLOGY MEDICALE, pp 44- 2-15 58 Phụ lục KOH 20% 1 Bệnh phẩm Nhuôm Gram Giả sợi và tế bào nấm men Ống thạch Sabouraud Cấy được 1 bệnh nhân/ống . XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA I. Đặt vấn đề I. Đặt vấn đề Từ thời Hypocrate và Galen. Nấm học của các chuyên gia Nấm học của CDC. CDC. Chúng tôi thấy Chúng tôi thấy Cải tiến Cải tiến → → Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm Candida Candida . dương tính và nghi nhiễm nấm Candida spp. - Quy trình định loại s - Quy trình định loại sớm nấm Candida - Thời gian: Từ tháng 2 đến tháng 10 năm 2012 2. Vật liệu - Chủng nấm: Chủng chuẩn quốc