xây dưng quy trình phân loại nấm candida

• Đặc biệt rất khó hoặc không thể định loại được trong trường hợp mẫubệnh phẩm: + Đồng nhiễm nhiều chủng nấm, + Nghi nhiễm nấm huyết + Mẫu bệnh phẩm không vô khuẩn: Đờm, phân v.v… • Làm

XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA

I Đặt vấn đề

Từ thời Hypocrate và Galen đã đề cập trong y văn thế giới Frank (1792)

mô tả lâm sàng bệnh Wilkinson (1894) căn nguyên do nấm Lodder và van-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men Năm 1984 Kreger-van-Rij 196 loài.Thế giới đã sử dụng nhiều kỹ thuật trong định loại nấm men, tính đến nay phân lập hơn 300 loài nấm Candida. Điều đó chứng tỏ tỷ lệ nhiễm nấm ngày càng cao Đặc biệt trước sự gia tăng của các bệnh suy giảm miễn dịch, trong đó

Kreger-có đại dịch HIV/AIDS và nhiều nguyên nhân khác như: thuốc ức chế miễn dịch,dùng corticoid kéo dài, thừa cân béo phì…

Hơn nữa, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nhiệt độ và độ

ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, lan truyền và dễ dàng gây bệnh ở người

Tại phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượt bệnh nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, trong đó số ca xét nghiệm dương tính là 11.900.000 Tỷ lệ nhiễm nấm do chủng Candida gây ra chiếm gần 1/3 Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân đã tăng lên gấp đôi

Điều đó cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trò quan trọng trong việc phục

vụ bệnh nhân cũng như giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị hiệu quảhơn

Qua từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật, những người làm công tác xét nghiệm luôn có nhiều cải tiến về kỹ thuật xét nghiệmsao cho phù hợp với từng thời kỳ

Năm 1972 Việt Nam đã áp dụng một số kỹ thuật xác định hình thái và tính chất hoá sinh vi nấm như:

• Khả năng đồng hoá 6 loại đường và lên men đường trong 4 ống pepton lỏng có Brom crezol và ống Durham…

• Sau đó, năm 1995 đã xuất hiện test mới: Candiselect-4, Lên men đường test Auxacolor (Bio-rad), API 20…

• Gần đây có máy định danh Vitex

• Năm 2010, BV Nhiệt đới Quốc Gia đã thực hiện: “ Cải tiến quy trìnhchẩn đoán nấm Candida từ bệnh phẩm bằng bộ tranh mẫu”.( phụ lục)

• Bộ tranh mẫu chỉ chẩn đoán sơ bộ 4-5 chủng nấm Candida, mà mỗi chủng có 5 ảnh nhưng thực tế chỉ có 2-3 ảnh nêu ra sự khác biệt giữa các loài

Candida về hình thái vi thể Tuy nhiên, sự minh chứng đó chưa đủ để định loại về hình thái vi thể Tuy nhiên, schính xác tên loài Candida gây bệnh

• Đặc biệt rất khó hoặc không thể định loại được trong trường hợp mẫubệnh phẩm:

+ Đồng nhiễm nhiều chủng nấm,

+ Nghi nhiễm nấm huyết

+ Mẫu bệnh phẩm không vô khuẩn: Đờm, phân v.v…

• Làm cho người thực hiện thụ động vì lệ thuộc hoàn toàn vào các bức hình trong bộ tranh mẫu Đặc biệt họ sẽ rất lúng túng khi gặp chủng nấm cần định loại mà không có trong bộ tranh mẫu ( Bộ tranh chỉ đinh danh 4-5 loài Cònthực tế hơn 300 loài Can

thực tế hơn 300 loài Candida)

• Thao tác phức tạp.

• Tốn kém kinh tế

Vậy để khắc phục một số hạn chế trên, phòng xét nghi

Vậy để khắc phục một số hạn chế trên, phòng xét nghiệm nấm nói riêng và tập thể khoa xét nghiệm nói chung đang từng bước xây dựng một hệ thống quản

lý chất lượng chung trong phòng thí nghiệm Hệ thống này cần những thành phần thiết yếu như: quản lý thiết bị, quản lý nhân sự và kiểm soát quá trình thực hiện Mỗi yếu tố trên bao gồm rất nhiều khâu, đặc biệt là khâu kiểm soát chất lượng xét nghiệm thông qua xây dựng quy trình thường quy chuẩn và Nó được coi như là tài liệu hướng dẫn chi tiết giúp ta từng bước thực hiện các thao tác xét nghiệm (SOPS) Đồng thời, đòi hỏi ngắn gọn, rõ ràng, dễ hiểu và phải cập nhật thường xuyên ít nhất mỗi năm một lần Từ đó, nhằm đảm bảo rằng xét nghiệm do phòng thí nghệm thực hiện là đúng và đáng tin cậy

Đ

Để thực hiện tốt công việc đó, chúng tôi luôn nhận được sự quan tâm chỉ đạo và tạo nhiều điều kiện thuận lợi của Ban Giám Đốc bệnh viện, Ban Lãnh đạo khoa Xét nghiệm Đ ồng th ời, kế thừa kinh nghi ệm c ủa những người đi trước V à tiếp thu kiến thức m ới cập nhật t ừ các chuyên gia Nấm học của CDC

Chúng tôi thấy Cải tiến → Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm

2 Đánh giá hi

2 Đánh giá hiệu quả quy trình mới và có so sánh với một số quy trình khác

3 Có thể áp dụng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các tuyến y tế cơ sở

Yêu cầu:

1 Quy trình ngắn gọn, dễ hiểu.

2. Các thao tác kỹ thuật dễ thực hiện

3. Các môi trường được kiểm chuẩn theo hướng dẫn ASM/CDC

II Tổng quan

1 Vài nét nấm men ( yeast, levure)

Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn Hình tròn hoặc hình bầu dục Kích thước từ 3 – 10 µm, lớn hơn gấp 10 lần vi khuẩn Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi Khả năng thích nghi môi trường đường cao Tồn tại trong thiên nhiên và trong các môi trường chứa đường như: hoa quả, rau dưa, mật mía…

Tính chất gây bệnh

Candida thuộc vi hệ tuy nhiên có thể bền vững hoặc thoáng qua Người ta

có thể tìm thấy Candida ký sinh ở da, họng miệng, đường tiêu hoá và âm đạo…,

mà không gây bệnh Chúng chỉ gây bệnh khi có yếu tố thuận lợi, đặc biệt khi cơ thể suy giảm miễn dịch Những loài Candida khác nhau có độc tính khác nhau

nên khả năng gây bệnh cũng khác nhau (Hay gặp nhất là C.albicans). Candida

có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan:

Ở nông trên da, niêm mạc miệng lưỡi, niêm mạc sinh dục nam, nữ và xâm nhập sâu gây bệnh: Phổi, tim, nhiễm nấm Candida huyết bệnh cảnh lâm sàng diễn biến nặng nề, nguy kịch, có thể tử vong rất nhanh…

Ngoài ra, còn gặp một số nấm men khác: Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Rhodotorula, Protheca…

III Đ

III Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Quy trình định loại sớm nấm Candida

- Thời gian: Từ tháng 2 đến tháng 10 năm 2012

2 Vật liệu

- Chủng nấm:

Chủng chuẩn quốc tế có mã số (ATCC: 90028, 66032, 66029, 22019, MYA-4560, 6258, 201382, 204092) và chủng nấm của bệnh nhân chưa định danh loài gây bệnh

- Môi trường:

Sabouraud + chloramphenicol, Bột ngô + Tween 80, CHROMO agar Candida, Auxacolor, Huyết thanh người khoẻ đã loại trừ HbsAg (-), HIV(-) và không dùng thuốc

kháng nấm trước đó 05 ngày

2 Phương pháp tiến hành

2.1 Xây dựng quy trình định loại sớm Candida

 Có 3 điểm “mấu chốt” của quy trình là ( Phụ lục):

* Chọn một thử nghiệm “đầu tiên” có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm sàng lọc nhanh Candida albicans

→ Test mầm giá đậu (Germ tube test): Thời gian cho kết quả sơ bộ là 3h và test dương tính gặp 95% là C.albicans

* Chọn môi trường nuôi cấy vi thể chọn lọc để quan sát hình thái vi thể đặc trưng nấm Candida nhưng phải sẵn có dễ mua, rẻ tiền, tự pha chế môi trường

→ Thạch Bột ngô + Tween 80: Hạt ngô được coi là “Thực phẩm vàng” bởi: Giàu Vitamin tự nhiên nhóm B (B1, B2,B6, Niacin) khoáng chất cần thiết,giàu chất đạm, chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì Thời gian cho kết quả 02 ngày

* Thay đổi cách cấy trên lam để quan sát rõ ràng và nhiều vị trí hình thái Nấm nhưng vẫn tiết kiệm môi trường và thao tác dễ thực hiện.

2.2 Kiểm tra độ chuẩn xác môi trường pha chế và thao tác kỹ thuật

- Môi trường Bột ngô + Tween 80 và CHROM agar Candida: Lấy chủng nấm men chuẩn CDC (ATCC) cấy kiểm tra môi trường sau khi đổ xong Nếu chủng nấm mọc mang hình thái đặc trưng chủng nấm mẫu → môi trường đópha chế chuẩn

- Khi thao tác kỹ thuật phải làm đồng thời cùng lúc với chủng chuẩn (ATCC) và mẫu bệnh phẩm cần định loại Qua đó, vừa làm chứng dương để sosánh vừa kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của thao tác kỹ thuật

Tóm tắt sơ đồ tiếp cận quy trình định danh nấm Candida spp

Bệnh phẩm

Xét nghiệm trực tiếp(+)

Sabouraud+Chloramphenicol

24-48h, tº=25-30ºC Khuẩn lạc thuần

Bột ngô+Tween 80 (48h, Bột ngô+Tween 80 (48h, tº=25-30ºC )

(2)

Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác (3) (97%)

CHROM agar Candida 3 Tóm tắt quy trình xét nghiệm - Xét nghiệm trực tiếp: • Soi tươi, • Nhuộm Gram, • Dầm mực tàu - Nuôi cấy: • Sabouraud with chloramphenicol • Nhiệt độ 25-30ºC, • Thời gian 24-48h - Phân loại: • Test ống mầm giá đậu • Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( môi trường Bột ngô), • CROMO agar Candida • Auxacolor (Bio-rad) C krusei C tropicalis C parapsilosis C glabrata…

C albicans

Auxacolor Auxacolor Auxacolor

3.1 Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm Candida

3.1.1 Dụng cụ, hoá chất

- Kính hiển vi quang học

- Ete, cồn 90°, đèn cồn

- Lam kính, lá kính

- Ống tube thuỷ tinh vô khuẩn

- Que cấy, tăm bông vô khuẩn

- Bàn phụ khoa

- Mỏ vịt (các kích cỡ)

- Pank, bông thấm nước,

- Găng tay, khẩu trang

- Thuốc nhuộm Gram, Nacl 9‰, KOH 20%

- Môi trường Sabouraud +Chloramphenicol+ Actidion

- Huyết thanh thỏ( hoặc người)

- Môi truờng lên men và hấp thu đường

- Môi trường PCB, KIT Auxacolor hãng Bio-rat

3.1.2 Nội dung xét nghiệm

- Bệnh phẩm là máu: phải tiến hành nuôi cấy

- Bệnh phẩm dịch não tuỷ: ly tâm lấy cặn để soi tươi, nhuộm soi, nuôi cấy

- Nếu là dịch âm đạo trong viêm âm hộ - âm đạo nghi do Candida: Mở mỏ vịt và lấy bệnh phẩm ở cùng đồ sau.

+ Lấy cặn để nhuộm Gram hoặc soi tươi trong Nacl 9‰

+ Dầm trong mực tàu, để yên tĩnh 2-3 phút

- Đờm: phết tiêu bản nhuộm Gram

* Nhận định kết quả

- Trên tiêu bản soi tươi: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính 10, 40:+ Bào tử nấm men hình tròn hoặc bầu dục, kích thước 3-6- 10µm Có rất nhiều tế bào men nẩy chồi, đôi khi thấy hiện tượng giả sợi nấm

- Trên tiêu bản nhuộm Gram: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100

Tế bào nấm men có chồi hoặc không, hình tròn hoặc bầu dục, đôi khi thấy sợi nấm hoặc giả sợi Bắt màu Gram dương

- Trên tiêu bản mực tầu thấy tế bào men nảy chồi hoặc không có vỏ dày, chiết quang Hình ảnh đó sơ bộ định hướng tới Cryptococcus

3.1.2.2 Nuôi cấy, định loại

- Môi trường: Sabouraud, Chloramphenicol (gentamycine), Actidion

- Bệnh phẩm sau khi lấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường trên theo phương pháp ria cấy hoặc cấy điểm Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay

- Ria cấy từ 2-3 ống, t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24- 48h

* Đại thể

- Khuẩn lạc tròn, màu trắng kem, sền sệt, bề mặt trơn nhẵn, có một số chủng thô ráp, sần sùi Khi để già tạo tua sợi đâm sâu xuống môi trường thạch

(C.albicans).

* Vi thể

- Thay đổi tuỳ theo loài Nói chung, nấm men hình cầu, hình tròn hoặc bầu dục Kích thước thay đổi Tất cả đều sinh chồi và bào tử chồi có thể tròn hoặc thon dài Thường xuất hiện sợi giả có thể ngắn hoặc dài, đôi khi uốn cong, chia nhánh Sợi nấm thật thường dài, có thể xuất hiện bào tử màng dầy ( 95%

C.albicans)

3.1.2.2.1 Chẩn đoán giống

- Dựa vào đại thể (đã nêu trên)

3.1.2.2.2 Chẩn đoán loài

Thử nghiệm tạo ống mầm.( Germ tube test)

Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C.albicans Tuy nhiên, chỉ mang

• Dùng ăng chữ L lấy một lượng khuẩn lạc nhỏ bằng đầu ăng

• Hoà tan hoàn toàn vào ống tube đã nhỏ sẵn huyết thanh

• Đem ủ ở 37°C, thời gian khoảng 3h

• Lấy một giọt dung dịch đó nhỏ lên lam kính sạch, đậy lá kính đem soi dưới kính hiển vi quang học

- Nhận định kết quả: Vật kính 10 nhận định sơ bộ, vật kính 40 khẳng định

+ Xuất hiện các bào tử nấm men và sợi nấm ngắn nối với nhau, mọc về một phía của bào tử, trông giống như hiện tượng giá đậu lên mầm và thường xuất hiện với số lượng nhiều.

Thử nghiệm này dương tính gặp trong 97% các trừơng hợp là C.albicans

Chú ý:

- Tốt nhất nên dùng huyết thanh ngựa Không nên dùng huyết thanh người, còn nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn không có kháng thể kháng nấm

- Đọc kết quả trong vòng 3h, không nên để quá lâu hoặc đọc quá sớm Bởi

có thể gây nhầm lẫn khi nhận định kết quả

- Thử nghiệm còn cho kết quả âm tính nếu như chỉ thấy toàn tế bào nấm men

- Bên cạnh đó, thử nghiệm còn cho kết quả dương tính giả khi thấy có sự giới hạn giữa bào tử nấm men gắn với sợi nấm

- Bảo quản huyết thanh ở 2- 8°C, nếu cất trữ lâu để dùng dần bảo quản ở -20°C

Kỹ thuật cấy trên lam

Mục đích: Quan sát bào tử màng dày và giả sợi

- Môi trường: Tự chuẩn bị môi trường thạch Bột ngô + Tween 80

- Phương pháp cấy trên lam:

+ Đun cách thuỷ ống môi trường đến khi tan chảy hoàn toàn thành dịch lỏng

+ Đổ thạch lên lam kính d= 2cm, dùng que cấy “L” lấy một lượng khuẩn lạc bằng đầu ăng

+ Cấy thành 1 đường ziczac (6-8 điểm) cách đều nhau giữa miếng thạch + Đậy lá kính vô khuẩn

+ Đặt lam kính đó vào hộp lồng có sẵn giá đỡ là que thuỷ tinh hình chữ U

+ Đặt miếng bông tẩm nước cất vào hộp lồng để tạo độ ẩm

+ Ủ trong tủ ấm t°= 25 - 30°C, đọc kết quả sau thời gian 24h-48h

- Nhận định kết quả:

Ta thấy sự phát triển của sợi giả có thể rất mạnh mẽ Khoảng 95% các trường hợp sợi giả sinh bào tử màng dày Đó là những tế bào tròn, thành bào tử rất dầy, kích thước lớn 10-15 µm, thường sinh ra ở đầu sợi nấm Đôi khi xuất hiện ở giữa hoặc cuối sợi nấm

Hiện tượng sợi giả và bào tử màng dày gặp trong 95% C.albicans

Chú ý:

- Ta có thể sử dụng một trong các môi trường PCB hoặc RAT để tiến hành phương pháp nuôi cấy trên lam Tuy nhiên, theo kinh nghiệm chúng tôi thấy để tạo được nhiều sợi và bào tử màng dày thì nên chọn môi trường Thạch bột ngô Tween 80 Bởi trong hạt ngô hàm lượng các chất dinh dưỡng và chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì

- Nếu nấm men không sinh bào tử màng dày và sợi nấm giả có thể cần phải làm thêm các thử nghiệm khác

- Không được tiến hành nuôi cấy trên lam nếu nghi ngờ là chủng nấm lưỡng hình nguy hiểm

Môi trường CHROM agar Candida

- Môi trường đổi màu: Tự chuẩn bị

- Cách tiến hành: Ria cấy phân vùng khuẩn lạc nấm men lên đĩa thạch

- Đọc kết quả sau 2 ngày: Nhận định được ngay các loài Candida bởi mỗi loài cho một màu sắc đặc trưng Độ nhạy và độ đặc hiệu cao 95%

Rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng nấm đồng nhiễm trên một mẫu bệnh phẩm

Lên men đường

+ Auxacolor( Kit Bio-rad): Nhằm đánh giá khả năng sử dụng 13 loại đường của các chủng nấm men, biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị pH có trong môi trường thử nghiệm Thử nghiệm dương tính khi màu chuyển từ tím sang vàng, còn âm tính cho màu tím.

Ngoài ra, còn phát hiện sự kháng Actidion của nấm men và phát hiện Enzym

phenoloxydase của C.neoformans Thử nghiệm cho phép phát hiện 25

chủng nấm men gây bệnh thường gặp

Một số lưu ý

 Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay

 Test ống mầm mang tính giả định nên có thể dương tính giả

 Bệnh nhân không dùng thuốc kháng nấm trước đó 3 ngày

4 K ết quả và bàn luận

- Tiến hành kiểm định kết quả hai quy trình: “Bộ tranh mẫu” và “Quy trình mới” nhằm định danh Candida spp bằng cách: Thực hiện đồng thời các thao tác kỹ thuật áp dụng cả 2 quy trình trên đối với 8 chủng nấm mẫu chưa biết trước tên loài nấm, chỉ biết mã số( ATCC:

+ Chúng tôi áp dụng quy trình mới với một số mẫu bệnh phẩm lâm sàng Thường gặp

một số loài Candida sau: C albicans, C glabrata, C tropicalis, C krusei,C parapsilosis, C

4560

Không có tranh mẫu

5 Tính mớí so với các kỹ thuật khác 5.1 Bảng 2: So sánh loại sinh phẩm và giá thành xét nghiệm của các kỹ thuật

Thử

nghiệm

Sinh phẩm và giá thành

Kỹ thuật khác Kỹ thuật mới

MT nôi cấy Sabouraud 10.000đ/ống/ XN 5.000đ/XN (một đĩa chia làm2)

Tổng cộng - Sinh phẩm phải mua nên giá - Chọn sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu

Cao hơn và ko đặc hiệu cao cho kết quả điển hình Và tự đổ môi trường nên tiết kiệm kinh tế hơn

- Giá thành: 240.000đ /BN - Giá thành: 100.000đ/BN (BV thu 120.000đ)) (Khoảng 90% XN giá 10.000 BV thu

120.000đ)