Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô slide

Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống invitro Giai đoạn 3: nhân giống invitro Giai đoạn

Chương 4 Các phương pháp nhân giống thực

vật bằng NCMTB

Tạ Ngọc Ly

Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô

tính in vitro

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống invitro

Giai đoạn 3: nhân giống invitro

Giai đoạn 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Quá trình sinh trưởng của cơ quan

hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt.

nhanh chóng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.

đầu sự hoá gỗ các thành tế bào, xuất hiện ở trên đó những chỗ dầy lên có cấu tạo và kết quả là không còn khả năng tiếp tục sinh trưởng.

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

3 khả năng về nguồn gốc cây :

sinh trưởng

chồi bên

chồi từ mô sẹo hoặc từ phôi

Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh

sinh trưởng nuôi cấy

mầm)

Mục đích nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy chồi ngọn

- Giai đoạn khử trùng mẫu cấy

- Giai đoạn nhân nhanh

- Giai đoạn tạo rễ in vitro

- Giai đoạn thuần hóa cây in vitro ở vườn ươm

Nuôi cấy tạo chồi bất định từ các cơ quan khác nhau

 Một số loại mẫu vật được dùng

như sau:

- Đoạn thân: thuốc lá, cam,

chanh, cà chua, bắp cải…

- Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp

cải, cà phê, ca cao…

- Cuống lá: thủy tiên…

- Các bộ phận của hoa: súp lơ,

Các yếu tố ảnh hưởng sự tạo chồi

Qui trình nhân giống invitro

1 Đối với các cây có chồi ngọn dài 2 Đối với các cây có chồi ngọn điểm hoa thị

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng làm sạch virus

~0.5 mm

6

7

~0.5 mm

Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus

Qui trình nuôi cấy ĐST tạo cây sạch bệnh

khởi đầu, nguồn gốc và kích thước của mẫu

Các phương pháp kết hợp để tăng hiệu quả diệt virus

Qui trình vi ghép?

4.2 Nhân giống thông qua giai đoạn mô sẹo

Mô sẹo (A) và tái sinh chồi từ mô sẹo (B) của chi Lilium

- Giai đoạn phát sinh mô sẹo

-Giai đoạn phân chia tế bào

-Giai đoạn biệt hoá

- Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân to và tế bào chất loãng Loại tế

bào này rất khó tái sinh thành cơ quan.

- Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc

Loại tế bào này dễ tái sinh thành cơ quan

Sự phát sinh mô sẹo

Sự tạo thành mô sẹo

Sự hình thành chồi từ mô sẹo

- Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường.

- Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo.

# Auxins : 0.01 - 10 mg / L

hoạt tính IAA

IBA NAA 2,4 - D 2,4,6 - T Dicamba Picloram

2 - ip Zeatin

ảnh hưởng của auxin lên sự tạo mô sẹo

Phát sinh cơ quan

 Auxin/cytokinin 10:1-100:1 phát sinh rễ.

 Auxin/cytokinin 1:10-1:100 phát sinh chồi

 Auxin/cytokinin 1:1 phát sinh mô sẹo

Ảnh hưởng kết hợp NAA và BA

Ảnh hưởng kết hợp NAA và BAP

1.Shoot tip in the medium 2.Shoot callus

3.Growth of stem

4.Root initiation

5.Hardening

6.Whole plant

4.3 Kỹ thuật nhân giống qua tái sinh phôi soma

Phôi soma

 Phôi soma là các cá thể nhân giống có cực

tính bắt nguồn từ các tế bào soma

 3 nguồn phát sinh phôi soma:

+ tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành

+ mô tái sinh không phải là hợp tử

+ lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con

 Con đường phát sinh phôi soma

+ Phát sinh trực tiếp không qua giai đoạn mô sẹo

+ Phát sinh từ tế các tế bào phôi hóa cảm ứng trong mô sẹo

Phát sinh phôi trực tiếp

Phát sinh phôi gián tiếp

 Đặc điểm tế bào hình thành phôi

 Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính

 Hình cầu (Globular)

 Trái tim (Heart)

 Thủy lôi (Torpedo)

 Lá mầm (Cotyledonary)

 Hạt giống (Germination)

Các giai đoạn hình thành phôi vô tính

 Gđ 1: Cảm ứng biệt hóa của tế bào tiền phôi

 Gđ 2:Biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi

Các giai đoạn phát triển của phôi

Soybean – Wayne Parrot, UGA

Các nhân tố ảnh hưởng đến phát sinh phôi vô tính

 Các chất điều hoà sinh trưởng:

 Auxin (2,4D, IBA, picloram) là một trong những yếu tố cần thiết

để cảm ứng sự phát sinh phôi nhưng lại là yếu tố có thể ức chế

sự hình thành và phát triển phôi ở giai đoạn hai và các giai đoạn tiếp theo

 Cytokinin: Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin ảnh hưởng đến sự sinh cơ quan phôi

 Sự tăng trưởng của phôi bị ức chế do sự hiện diện của auxin trong môi

trường, do có sự liên quan tới sự tổng hợp ethylen

 - Sự gia tăng sinh tổng hợp các polyamine và loại bỏ auxin

là cần thiết cho sự hình thành phôi.

chất giữa quá trình sinh tổng hợp ethylen và polyamine

 Ảnh hưởng của pH đến sự phát sinh phôi soma

- sự phát triển của phôi soma ở những giai đoạn khác nhau thường làm biến đổi pH của môi trường

- Những phôi soma hình thành ở những pH thấp (pH 3,8) thường cho tỉ lệ nảy mầm thành cây con thấp

phát sinh hình thái

 Nguồn nitơ: Các nitrogen hữu cơ cũng là yếu tố thúc đẩy quá

trình sinh phôi

 Nito dạng khử (amon) kết hợp axit hữu cơ (a malic, a xitric)

 Hàm lượng đường cao cần thiết cho sự tái sinh phôi soma

 Các điều kiện nuôi cấy phôi soma

 Ánh sáng :

- Giai đoạn phôi non được nuôi cấy trong tối

- Khi tái sinh phôi: cần ánh sáng

 Mô sẹo

Kỹ thuật nuôi cấy phôi

- ngâm nguyên liệu vào trong dung dịch khử trùng thương mại có hypochlorite (Clorox 5-10%, sodium hoặc calcium hypochlorite 0,45%) trong 5-10 phút hoặc cồn (70-75%)

trong 5 phút

- bổ sung nồng độ thấp của các chất hoạt dịch (surfactant) như Tween 20, Tween 80, Teepol, hoặc Mannoxol làm tăng tính thấm của mô Đối với hạt ngô, và các phôi tách rời:

ngâm trong cồn 70% cộng với 5-10 phút khử trùng bằng sodium hypochlorite 2,6%.

Những đặc tính cơ bản của cây từ phôi soma

nông học khác Phôi soma bảo tồn mọi đặc tính ưu thế lai của cây mẹ nếu mẹ có ưu thế lai cao

nhiễm phải

Hạt nhân tạo

- Là phôi vô tính bọc trong một lớp vỏ polymer, trong cấu

trúc lưới của lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ.

Hạt nhân tạo gồm có ba phần:

- Phôi vô tính

- Vỏ bọc polymer tự nhiên được chiết xuất từ

cỏ biển (agar, alginate) hoặc cây trồng

(arabic), nhựa từ hạt (tamarind) hoặc từ vi

sinh vật (dextran)

- Màng ngoài (calcium alginate)

Cấu tạo của hạt nhân tạo

Tạo phôi vô tính

 Mô thực vật được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D từ 30 –

40 µ M để tạo mô sẹo.

 Sự tăng sinh mô sẹo được cấy chuyền và thực hiện nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 10 µM 2,4-D và 1µM BA, hay môi trường lỏng có 5µM 2,4-D.

 Phôi được sản sinh ra được phát triển thành phôi trưởng thành

thông việc cấy chuyền những khối tế bào mô sẹo lớn từ môi trường

có 2,4-D sang lắc môi trường lỏng không có 2,4-D

Bao hạt

nhiên từ rong biển (agar, caragreenan, alginate), cây trồng, chất gôm (chất dính) của hạt hoặc sinh khối vi sinh như

dextran, gellan gum Alginate được sử dụng nhiều nhất

-Na- alginate được làm tan trong nước với nồng độ 2-4 %,

- Dùng pipet nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 (2,5%)

 [(C 5 H 7 O 4 COO) 2 Ca] n + nNa 2 CO 3  2[C 5 H 7 O 4 COONa] n + nCaCO 3

Alginat Ca Alginat Na

Alginat Na là dạng tan trong nước

 2[C 5 H 7 O 4 COONa] n + nCaCl 2  [(C 5 H 7 O 4 COO) 2 Ca] n + 2nNaCl

Alginat Na Alginat Ca

Alginat Ca kết tủa, trở thành dạng không tan, tạo thành màng không thấm nước

Hỗn hợp alginat Na 4 % và môi trường MS

Chuyển phôi vào giọt nhiểu

Tạo màng bao alginat Ca trong 20 phút

Ngâm nước và thu hạt nhân tạo

Hoà tan 100 ml Alginat Na 4% vào 1 lít môi trường MS có chứa các muôi

khoáng, đường, vitamin, các chất sinh trưởng Tiến hành nhỏ từng giọt nhẹ

nhàng hỗn hợp này vào một cốc dung dịch CaCl2 2,5% hay CaNO3 100mM Mỗi lần nhỏ dùng một ống hút chuyển vào trong gịot đó một phôi soma

 Bảo quản hạt nhân tạo

- Hạt nhân tạo sau khi tạo thành được làm khô, bảo quản trong

- Thời gian bảo quản thường chỉ trong vòng 2 đến 4 tháng

A) Proembryogenic mass with somatic embryos in different development

stages (bar = 2 mm); B) zygotic embryos of Nothofagus alpina; C) encapsulate

of somatic embryo through micropipette with sodium alginate; D) artificial

seeds rinsed with sterile water for 40 min; E) survival of somatic embryo

encapsulated after 21 d; F) elongation of somatic embryo encapsulated in

sodium alginate at 4%; G) germination of zygotic embryo encapsulated in

sodium alginate at 4% after 5 d; H) conversion of encapsulated zygotic embryo

to plant after 14 d.

Encapsulated somatic embryo (B) initial stage of seed

germination (C) germinated seed

of loda variety (D) germinated seed of china variety (E) plant obtained from synthetic seed and (F) callus was observed from

somatic embryo in seed bead

Các phương thức tạo hoàn chỉnh in vitro

Callus induction, plantlet regeneration and the artificial seed conversion of Pogonatherum paniceum

(A) Calli induced from mature seeds (bar = 1 cm) (B) Shoots regenerated from the calli on

regeneration medium (bar = 1 cm) (C) Tuft of multiple shoot buds from a piece of callus

(bar = 1 cm) (D) The surviving plants after transplantation (bar = 1 cm) (E) The shoot buds rooted

on MS basal medium (bar = 1 cm) (F) Calli sub-cultured for 2 years (bar = 1 cm) (G) Shoots

regenerated from the callus sub-cultured for 2 years (bar = 1 cm) (H) Calcium alginate capsule

formed by the encapsulation of shoot buds using 3% sodium alginate and 1% activated carbon

(bar = 1 cm) (I) Germination of artificial seed and recovery of complete plantlet (bar = 1 cm) (J) A healthy plant in pot containing fertile soil and vermiculite (2:1) (bar = 1 cm).

Ưu điểm của phương pháp nhân giống phôi vô tính

lưu giữ dài hạn

giống quy mô lớn, đặc biệt là nhân giống bằng bioreactor (Takayama and Akita , 1994)

trong nhân nhanh hàng loạt cây trồng, ví dụ: nhân giống xoan ấn Độ (Azadirachta indica A Jus.) (Murthy and

Saxena, 1998), thông (Garin cs.,1998), đu đủ (Jordan and Velozo, 1996; Castllo cs, 1998), loa kèn (Tribulato cs.1997)

Quy trình nuôi cấy mô

Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo ba

(hoặc bốn) giai đoạn :

1 Giai đoạn I – cấy gây:

Yêu cầu của mẫu: - tỉ lệ nhiễm thấp

- tỉ lệ sống cao

- tốc độ sinh trưởng nhanh

2 Giai đoạn II – nhân nhanh

Những khả năng tạo cây:

- Phát triển chồi nách

- Tạo phôi vô tính

- Tạo đỉnh sinh trưởng mới

3 Giai đoạn III – chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

- Tạo rễ

- Huấn luyện thích nghi với môi trường

- Chuyển từ dị dưỡng sang tự dưỡng

www.themegallery.com

Sự phát triển trên cấu

trúc có sẵn trước đó Phát sinh cơ quan dựa trên

tính toàn thế

Chồi ngủ Chồi bất định

Quả in vitro Hoa nở in vitro

Sự phát triển của quả Sự phát sinh rễ

Vi ghép in vitro Sự phát triển của thể giả

hành

Phát sinh chồi

Các vấn đề liên quan đến nhân giống invitro

trưởng đến nhân giống in vitro

chọn mẫu: các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ

quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng,

độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.

Ảnh hưởng của môi trường.

Tính bất định về mặt di truyền

+ kiểu di truyền

+ thể bội : cây đa bội thể tần số biến dị cao hơn cây nhị bội

+ số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng cao thì tần số biến

dị càng lớn

+ loại mô

Sự hoại mẫu đưa vào nuôi cấy

-Sử dụng thuốc kháng sinh

Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

-tách các phần tử phenol ra khỏi môi trường

bổ sung các chất khử redox (oxidation-redution) phenol vào môi trường

-ngăn chặn sự hoạt động của enzim phenolase

giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi trường rắn

-mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ, để ngoài vài giờ trước khi cấy, hay nơi cấy trong môi trường không có ánh sáng

+ sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo

+ gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

+ ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C và axit citric vài giờ

trước khi cấy

+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp không có đèn 1-2 tuần chuyển mẫu từ môi trường có nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường có nồng độ cao.

Hiện tượng thủy tinh thể

 Đặc điểm cây thủy tinh thể

 Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể

 + giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường

 + giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi

cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đối sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế

hình thành chồi.

 + giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi

trường cấy ít nhất ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng.

 + giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

 +chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến

cây bị thủy tinh thể.

 + giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt

 + tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.

Sự phát sinh cơ quan chồi và rễ

Sự tạo rễ

Ưu nhược điểm của vi nhân giống

Ưu điểm của vi nhân giống

Hạn chế của vi nhân giống

được

Phương pháp nhân giống quang tự dưỡng

không có đường, mà sự tăng trưởng hay tích lũy các

hydratcarbon tuỳ thuộc vào sự quang hợp và sự hấp thu khoáng vô cơ của thực vật được nuôi cấy

Nhược điểm của các phương pháp nuôi cấy mô

truyền thống

 - Hiệu suất quang hợp cây in vitro thấp Cây thiếu khả năng tự dưỡng Tỷ lệ

thoát hơi nước cao do lớp tế bào cutin mỏng cùng với hoạt động không bình thường của khí khổng.

 - Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn cao

 - Bình nuôi cấy thường quá nhỏ và kín

 - Không khí bên trong bị bão hoà hơi nước.

 - Chất điều hòa sinh trưởng thường xuyên được sử dụng.

 - Xảy ra các hiện tượng bất thường về sinh lý chẳng hạn sự hóa thuỷ tinh thể

(vitrification) hoặc phát sinh hình thái dẫn đến chậm phát triển hoặc biến dị (soma variation) của cây cấy mô.

 - Cây ra rễ không hoàn chỉnh Trong một số trường hợp còn có sự hình thành

mô sẹo ở gốc.

Kiểm soát các điều kiện môi trường nuôi cấy

invitro

suốt chu kỳ ánh sáng.

+Các bình nuôi cấy có các nắp đậy có khả năng trao đổi khí

+bình nuôi cấy có diện tích lớn

thực vật khoảng 0,1 %

 Kiểm soát chế độ chiếu sáng:

- Hướng chiếu sáng

 Nhiệt độ không khí

Ưu điểm của vi nhân giống quang tự dưỡng

nuôi cấy không có đường

giảm ở mức tối thiểu.

được nuôi cấy in vitro.

cấy lớn

Qui trình ra cây

Quy trình tái sinh cây nuôi cây

- Mở nút đậy bình bình nuôi cấy: 1 tuần

- Gắp cây khỏi giá thể

- Rửa sạch agar và dưỡng chất

- Để héo 1 -2 giờ

- Trồng vào khay ươm: 1 tháng

- Trồng vào bầu đất

Tách cây khỏi bình nuôi cấy, rửa sạch agar và

dinh dưỡng

Trồng

cây vào giá thể xốp,

giữa ẩm tốt

Đặc điểm của giá thể ươm cây

- Tỉ lệ giá thể: Đất (70%) + Phân chuồng ủ hoai (10%) + tro trấu (20%)

Điều kiện môi trường giâm cây

- Nhiệt độ 30 o C

- Ánh sáng:

+ Một tuần đầu: ½ ánh sáng tự nhiên (7000 lux)

+ Tuần thứ 2: 70% ánh sáng tự nhiên (10.000 – 12.000 lux) + Từ tuần thứ 3: 100% ánh sáng tự nhiên

- Độ ẩm:

+ Tuần đầu: phun sương ẩm 90%

+ Tuần 2: 70%

+ Từ tuần 3: 60%

Điều kiện phân bón

- Tuần đầu không bón phân

- Từ tuần thứ 2: phun NPK tỉ lệ 30:10:10, với nồng độ 3g/lít, một tuần một lần

- Từ tuần thứ 4: Tăng nồng độ phân 5-10g/lít, 5 ngày phun một lần

Hệ thống nhà thuần hoá tận dụng một phần ánh sáng tự nhiên, có khả năng giữ ẩm tốt

Tấm che nilon nhằm mục đích giữ ẩm

Hệ thống nhà lưới nhằm điều chỉnh ánh sáng tự nhiên

Hệ thống nhà ươm

Bét phun sương

Hệ thống kệ bố trí khay ươm

Hệ thống tưới sương tạo

ẩm 90%

Tưới phun sương tạo

ẩm 70% sau 1 tuần

Cây phát triển thuận lợi trên khay ươm sau một tháng

Cây phát triển hoàn chỉnh trên chậu ươm, có thể chuyển ra trồng bầu đất

Nhà

thuần

hoá đơn giản,

dùng lưới nilon

Quy trình thuần hoá

cây

Chuyển cây từ khay ươm vào bầu đất

ngoài vườn ươm