Lời Mở Đầu31.Tổng quan về enzyme pectinase41.1.Khái niệm41.2.Phân loại41.3.Cơ chế tác động 41.4.Nguồn thu nhận enzyme pectinase 61.5.Giới thiệu về cơ chất pectin61.6.Ứng dụng của enzyme pectinase 72.Tổng quan về chủng Aspergillus niger92.1.Giới thiệu chung92.2.Phân loại khoa học 92.3.Đặc điểm cấu tạo92.4.Đặc điểm sinh lý102.5.Đặc điểm sinh hóa 102.6.Đặc điểm sinh sản113.Thu nhận enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger123.1.Cơ chế sinh tổng hợp enzyme123.1.1.Các cơ chất thường hay sử dụng123.1.2.Các nghiên cứu trước đây liên quan tới việc tổng hợp enzyme pectinase từ Aspergillus niger 123.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme133.2.1.Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu133.2.2.Ảnh hưởng của thành phần đa lượng143.2.3.Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng143.2.4.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy143.2.5.Độ ẩm môi trường143.2.6.Thời gian nuôi143.2.7.pH154.Quy trình công nghệ sản xuất enzyme pectinase164.1.Các phương pháp sản xuất164.2.Nguyên liệu174.3.Quy trình sản xuất174.3.1.Nuôi cấy nấm mốc184.3.2.Môi trường nhân giống, lên men194.3.3.Thu nhận chế phẩm enzyme thô194.3.4.Quá trình kết tủa enzyme pectinase20Tài Liệu Tham Khảo22
Trang 1ĐỀ TÀI : CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PECTINASE
TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER
MỤC LỤC
Trang 2Lời Mở Đầu
Công nghệ enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ XX đếnnay, đem lại những thuận lợi lớn và mở ra sự phát triển mạnh mẽ hơnnữa cho ngành công nghệ thực phẩm
Enzyme pectinase thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm
và dược phẩm đặc biệt, nó có vai trò hết sức quan trọng trong quá trìnhbảo quản trái cây và rau quả
Pectinase có thể được sản xuất từ nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc,
nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu Sản phẩm từ Aspergillus niger cũng
được Cục quản lý thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận làsản phẩm an toàn Ngoài ra, Aspergillus niger còn là một nấm mốc cókhả năng phát triển nhanh chóng trên các cơ chất rẻ tiền và tiết raenzyme vào trong môi trường, dễ dàng thu hồi [2]
Trang 31. Tổng quan về enzyme pectinase
1.1. Khái niệm
Pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectinthành các hợp phần khác nhau như axit galacturonic, arabinose,galactose, methanol….[3]
1.2. Phân loại [5]
Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng kiểu phản ứng, pH tối ưu củaenzyme Năm 1966, Koller và Neukom phân loại chia pectinase thành hainhóm chính: hydrolase và transeliminase Cả hai nhóm này đều có đặcđiểm chung là gỉam độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm khối lượngphân tử của các sản phẩm tạo thành
Dựa vào cơ chế tác dụng của chúng gồm các loại như sau:
pectinesterase (PE), Polymethylgalacturonic (PMG), polygalacturonase
(PG), Pectate lyase (PEL) Ngoài ra còn có: pectin-transelimiase (còn gọi
là poly-α-1,4 galacturonite- methylesteglucanoliase) là enzyme tác dụngtrên pectin và trên pectinic acid Polygalacturonate-transelimiase (còn gọi
là poly-α-1,4 D-galacturonite- glucanoliase) là enzyme tác động trênpectic acid và pectinic acid Pectin lyase (PNL) xúc tác sự phân cách cácđơn vị galacturonate đã bị ester hoá Tất cả các PNL đều là endo –enzyme
1.3. Cơ chế tác động [4]
Pectinesterase ( PE ): Enzyme này xúc tác sự thuỷ phân liên
kết ester phức tạp của pectin và protopectin, sản phẩm tạo thành là rượumethylic và acid pectinic hay acid polygalalacturonic Người ta nhận thấyrằng PE chỉ phân cách liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và -COOH tựdo
PE tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhómcarboxyl rất linh động, dễ kết hợp với các ion kim loại như Ca2+ để tạothành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng
PE của nấm mốc sẽ thuỷ phân trước tiên là nhóm methylester nằmgiữa hai nhóm carboxyl tự do Và enzyme sẽ thuỷ phân lần lượt các liênkết ester dọc theo phân tử pectin Chẳng hạn đối với tác dụng của PE từ
nấm mốc Asp Niger cần thiết có pectin ester hoá ở mức độ cao từ 70 %
trở lên
Trang 4pH tối ưu của PE từ nấm mốc là 4.5 -5.5, còn của chế phẩm đã loại
bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2.0 – 6.5 Nhiệt độ tối ưucủa PE từ nấm mốc là 40 – 45 0C, từ 55- 62 0C thì vô hoạt Các ion kimloại đặc biệt là Na+ và Ca2+ và các muối clorua của chúng sẽ hoạt hoá PE
từ nấm mốc Asp.niger Trái lại , các cation hoá trị 3 và 4 ( thuỷ phân
nitrat, FeCl2, Al2(SO4)3 ) sẽ kìm hãm tác dụng của PE
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme PE có thể cóliên quan đến tương tác của nó với cơ chất Polygalacturonic acid là mộtchất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thuỷ phân nhờ sự xúc tác của PE
Sự liên kết của các ion kim loại và các nhóm carboxylate trong trườnghợp này có khuynh trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lênenzyme Tuy nhiên lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạtcủa PE vì các ion kim loại bị bao vây bởi các nhóm carboxylate nằm kếcận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thuỷ phân xảy ra
Polymethylgalacturonase ( PMG): Là enzyme tác động trên
acid polygalacturonic đã được metoxyl hoá ( tức là pectin) Enzyme này
có tên hệ thống là poly- α - 1,4 galacturonic –methylesterglucanohydrolase ( E.C.3.2.1.41), lại được chia thành hainhóm nhỏ:
Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase kiểu 1 (Endo PMG I) : Là enzyme dịch hoá, pectin có mức độ metoxyl càng cao thì bị thuỷ
phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả cao Trong dungdịch khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này
thường bị giảm Enzyme này phổ biến ở một số nấm mốc như: Asp.niger, Asp.awamori,Botrytis cinerea…
Exo – glucosidase – polymethylesterase kiểu III ( Exo- PMG-III): Là
enzyme đường hoá, enzyme này có thể cắt từng acid galacturonic ra khỏipectinic hay pectin Exo – PMG- III có ái lực với các gốc acid galacturonic
đã được metoxyl hoá nghĩa là phân cắt liên kết α - 1,4 glucoside ở đầumạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm -COOCH3
Polygalacturonase ( PG) : Là enzyme tác dụng trên acid pectinic hoặc pectic PG lại được chia thành hai nhóm nhỏ:
Endo – glocosidase – polygalacturonase kiểu II (Endo – PG II): Là enzyme dịch hoá, enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic
hay acid pectic và chỉ tác dụng khi có mặt nhóm _COOH tự do
Trang 5Hoạt độ của Endo-PG II sẽ tăng lên nhiều khi cơ chất được xử
lý sơ bộ bằng PE Đa số vi khuẩn và nấm mốc là những vi sinh vật tổnghợp được enzyme này
Exo – glucosidase – polygalacturonase kiểu IV ( PG-IV): Enzyme này thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside
Exo-ở cuối mạch phân tử acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đókhông có nhóm methyl
Có lẽ để tạo được phức enzyme - cơ chất thì trong phân tử cơchất phải có nhóm carboxyl tự do liền kề với liên kết bị đứt
Pectate lyase ( PEL): Năm 1960, P Abershim lần đầu tiên
đưa ra thông báo về phân huỷ phân tử pectin không bằng con đườngthuỷ phân Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase.Enzyme này xúc tác phá vỡ mối liên kết α - 1,4 glucoside, tiến tới làmmất hoạt tính nguyên tử hydro ở C5, tạo thành mối liên kết đôi giữa C4
và C5
Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó thànhhai nhóm:
Endo – pectatelyase: Tham gia thuỷ phân phân tử
polygalacturonic ở chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic
Exo – pectatelyase: Tham gia phân huỷ thành phần mạch
vòng của acid digalacturonic
Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào
1.4. Nguồn thu nhận enzyme pectinase [5]
Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong
chanh, cà chua, trong một số quả khác Thường là có nhiều enzymepectinesterase (PE ).[4
Đặc điểm của pectinesterase thực vật: Enzyme này thường tồn tạidưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào PE ở thực vậtnói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kimloại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăngnồng độ hoạt động của enzyme Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứngtheo kiểu làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọctheo mạch pectin
Vi sinh vật: Nhiều vi sinh vật trong đất, trong nước có khả năng
phân giải pectin Chúng có ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng
Trang 6tuần hoàn carbon trong tự nhiên mà còn đối với một số ngành sản xuấtcông nghiệp (ngâm đay, gai, làm bia, làm giấy…) Một số vi sinh vật có
khả năng phân giải pectin mạnh mẽ: Aspergillus ficcum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Clostridium roserum…
Đặc điểm của E pectinase ở vi sinh vật: Tất cả các vi sinh vật đểthu nhận enzyme pectinase đều là hiếu khí Sự phân bố các kiểu enzymepectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo được mộtenzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzymepectinase khác nhau, tuỳ theo loài
Ví dụ: Sac Fragilis chỉ tạo ra duy nhất một loại enzyme phân giải pectin là endopolygalaturonase Còn ở nấm mốc Aspergillus niger thường
tạo được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau
Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng hoặcenzyme bản thể Ngoài ra enzyme pectinase ở vi sinh vật còn khác nhau
ở một số tính chất
1.5. Giới thiệu về cơ chất pectin
Pectin là polysaccarit của thực vật, tồn tại dưới 2 dạng : Protopectinkhông tan (tồn tại chủ yếu dưới dạng liên kết ở thành tế bào) và dạngPectin hòa tan (tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào).Pectin hòa tan làpolysaccarit, cấu tạo từ các gốc α-D-galacturonic, các đơn vị này nối vớinhau nhờ liên kết 1-4 glucozit [11], trong đó, một số gốc axit có chứanhóm thế metoxy (-OCH3) [8]
Trong pectin tự nhiên có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa
Trang 7Khối lượng phân tử pectin trong khoảng 3.000 – 280.000, từ nguồngốc thực vật Dung dịch pectin có độ nhớt cao.
Độ hòa tan của pectin trong nước phụ thuộc vào mức độ ester hóanhóm cacbonyl Mức ester hóa càng cao độ hòa tan càng cao Pectin hòatan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzym pectase sẽ giống nhómmetoxyl tạo rượu metylic và axit pectic tự do
1.6. Ứng dụng của enzyme pectinase [1]
- Trong công nghiệp thực phẩm, pectinase được sử dụng rộng rãi
để tăng tốc độ lọc, tăng hiệu suất ép nước quả, giúp nước quả trongtrong quá trình tồn trữ không có hiện tượng đục do pectin bị lắngtrở lại, trong sản xuất nước quả, enzyme pectinase được sử dụngcho mục đích bẻ gãy liên kết C-C hay –C-O- trùng hợp như pectin,hemixenlulo, tinh bột Vì vậy làm tăng hàm lượng nước ép trái cây,cải tiến những chất trong nước quả như hàm lượng acid, chất thơmchất màu, giảm độ nhớt và tăng độ trong đến hiệu suất cao nhất
- Enzym pectinase được dùng trong công nghệ y dược với mụcđích trích ly dược liệu Khắc phục được nhược điểm của phươngpháp trích ly thông thường tốn nguyên liệu, thời gian, tách khôngkiệt được chất trong bã thuốc, dược liệu bị keo nhầy không chiếtđược, hoặc bị đục trở lại sau thời gian tồn trữ
- Pectinase còn được sử dụng trong quá trình ngâm đay, gai để táchsợi cellulose nhưng không phá hủy sợi, ứng dụng trong chế biến trà,
ca cao, nước táo và các loại nước giải khát
2. Tổng quan về chủng Aspergillus niger
2.1. Giới thiệu chung
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố
rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp
và ở nhiều vùng địa lư khác nhau trên thế giới Hiện nay, A niger được sử
dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong côngnghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất
-một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic,…(Pansear et al., 2010).
2.2. Phân loại khoa học [6, 10]
Sinh giới: Eukaryot
Trang 82.3. Đặc điểm cấu tạo [6]
Tên nấm mốc Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm vi thể
A.niger
[6]
Khóm nấm mốc cóđường kính 4 ¸ 5 cmtrên thạch Czapek sau
5 ngày Khóm nấmmốc màu đen hoặcnâu đen lấm tấm như
bã cafe
Bông hình cầu có màuđen Bọng hình cầu.Thể bình 1 hoặc 2tầng, ở đa số loài thểbình 2 tầng, Metulaedài gấp đôi tầngPhialides Vách cuốngconidi trơn Hạt đínhhình cầu đến gần cầu,
có gai rõ
Trụ nấm tách biệt và có hyalin Các bào tử có nguồn gốc xuất phát
từ các tế bào chân đáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu
Túi này là một sự hình thành đặc trưng cho giống nấm Aspergillus Hình thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa các loài Aspergillus
có bào tử màu đen
Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi(lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium)
Khuẩn ty của nấm mốc A.niger tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra vừa
ngăn vách tạo thành nhánh Khuẩn ty có 2 loại:
Trang 9Khuẩn ty cơ chất (hay khuẩn ty dinh dưỡng) có kích thước nhỏ, màutrắng, bám chặt vào cơ chất môi trường và hấp thu các chất dinh dưỡng.Các khuẩn ty này bện thành khối Khi già hệ sợi nấm mốc ngả sang màuvàng.
Khuẩn ty khí sinh (hay khuẩn ty sinh sản) có kích thước lớn hơnkhuẩn ty cơ chất nhiều lần, trong suốt trên bề mặt cơ chất và từ khuẩn tykhí sinh sẽ có 1 sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt, mang bàotử
Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học chính làchitin và glucan
2.4. Đặc điểm sinh lý [6]
Loại Aspergillus niger phân bố nhiều trong tự nhiên, trong đất, ở xác
bã thực vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp
Chúng là những cơ thể hiếu khí sống hoại sinh hoặc kí sinh, không cókhả năng quang hợp tạo chất hưu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ cácloại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty
2.5. Đặc điểm sinh hóa [6]
Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau : A.niger đồng hóa tốt
các loại đường như glucose, fructose, saccharose, mannose Đối vớiđường sorbose, galactose, A.niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn đườnglactose thì đồng hóa ở mức trung bình
Nguồn dinh dưỡng nitơ : A.niger có khả năng sử dụng ure làm nguồn
N và chất điều chỉnh pH, dưới tác dụng của enzyme urease, ure phân hủythành CO2 và NH3 A.niger đồng hóa các muối amon Việc sử dụng nguồn
N hữu cơ, urease và các muói amon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồihấp thụ vào cơ thể Như vậy NH3 là trung tâm của con đường dinh dưỡngnitơ của vi sinh vật
Nguồn dinh dưỡng khoáng phospho : Sự có mặt của các hợp chấtphospho và nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớnđến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật Thay đổi nồng độ cáchợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trìnhtổng hợp hàng loạt các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tếbào và chất nhân Ngoài ra, phospho có trong môi trường còn có tácdụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzyme đồng hóa các loại thức ăn cacbon
Trang 10Khả năng sinh tổng hợp enzyme : A.niger có khả năng sinh các
enzyme như amylase, protease, peptinase, và đặc biệt là hệ enzymecellulase
2.6. Đặc điểm sinh sản [6]
A.niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính:
- Sinh sản sinh dưỡng: từ một đoạn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát
triển thành một hệ sợi nấm Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi,không khí bay đi khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh chóng pháttriển thành khuẩn lạc mới
- Sinh sản vô tính: Reaper và thơm (1968) cho rằng A.niger sinh
sản vô tính bằng bào tử trần (conidium) Hầu như các bào tử trần là cácbào tử ngoại sinh, nghĩa là được hình thành ở bên ngoài tế bào sinh bào
tử trần (conidiogenóu cell) Các bào tử này sinh ra trực tiếp trên khuẩn tyhoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone)
Trang 113. Thu nhận enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
3.1. Cơ chế sinh tổng hợp enzyme
( 2 enzyme tiêu biểu : PE, PG)
Tùy theo nguồn cơ chất sử dụng mà chủng A niger sinh ra các loại
enzyme khác nhau trong hệ pectinase như PE, PG V.vv
3.1.1.Các cơ chất thường hay sử dụng
Cơ chất pectin từ nguồn phụ phẩm nông nghiệp được ưa chuộngnhất (Patil và Dayanand, 2006) Hàm lượng pectin cao (15 - 25%) trongcác phụ phẩm nông nghiệp như cám mì , bã mía, bã củ cải đường, xácđậu cô ve, vỏ chanh và bã táo là những nguồn cơ chất thích hợp cho việcsản xuất enzyme pectinase nguồn gốc vi sinh Ngoài ra, độ methoxyl hóacao (65 ÷ 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông nghiệp chính là điềukiện thuận lợi cho hoạt động sinh tổng hợp PME (PE) 10]
3.1.2.Các nghiên cứu trước đây liên quan tới việc tổng hợp
enzyme pectinase từ Aspergillus niger
• Maria A Martos và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các
điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme PE và PG của chủng A.Niger
N0300 trên môi trường tổng hợp có chứa pectin Kết quả tối ưu hóa bằngquy hoạch thực nghiệm cho thấy điều kiện nuôi cấy tối ưu để tổng hợp
PG cao ( đạt 1032U/l) là pH = 4,1, hàm lượng pectin : 20g/l, thời gian lênmen là 74h trên môi trường lỏng Tại điều kiện này, quá trình tổng hợp PE
là thấp.[13]
• Năm 2010, Vivek Rangrajan và cộng sự, tiến hành nghiên cứu tổng hợppectinase từ cơ chất là bột vỏ cam sấy khô và chiết xuất vỏ cam có bổ
sung nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ, sử dụng chủng A Niger Kết quả cho
thấy hàm lượng pectinase tổng hợp được cao nhất trong môi trường chiếtxuất vỏ cam bổ sung peptone và môi trường vỏ cam bổ sung sữa đậunành Hoạt độ endopectinase lớn nhất ( 6800U/g) đạt được khi nuôi cấychìm trong môi trường chiết xuất vỏ cam có bổ sung nguồn nito hữu cơ làpeptone Hàm lượng pectinase tổng hợp trong môi trường bổ sung nguồnnitơ vô cơ bằng phương pháp chìm và nuôi cấy trên môi trường rắn đềuthấp.[14]
• R.R.Siva Kiran và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp
endo-polygalacturonase bởi chủng A.niger đột biến trên môi trường rắn.
Nghiên cứu đã sử dụng mô hình Plackett –Burman và tối ưu hóa bằng