Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng aspergillus niger tái tổ hợp​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Tuyên PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội – Năm 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin trân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tun, Trưởng phịng CNSH Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học định hướng ý tưởng nghiên cứu, lên kế hoạch, tận tình theo sát hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên dạy kiến thưc chuyên môn tạo điều kiện tốt để em học tập thực luận văn phịng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy Người thầy, bảo tận tình cho em mặt kiến thức, mà thầy cịn cho em lời khuyên bổ ích định hướng giúp đỡ cho em suốt trình làm luận văn Em xin chân thành cảm ơn anh chị phịng Cơng nghệ sinh học enzyme – Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi tận tình hướng dẫn em trình học tập, nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân gia đình, bạn bè bên cạnh, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em để em vững bước hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Kim Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược enzyme xylanase……………………………………………………………………3 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc 1.1.4 Đặc điểm chất, chế xúc tác 1.2 Ứng dụng enzyme xylanase 10 1.2.1 Các chế phẩm xylanase thị trường quốc tế 10 1.2.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 11 1.2.3 Trong công nghiệp thực phẩm 11 1.2.4 Trong công nghiệp giấy bột giấy 12 1.2.5 Các ứng dụng khác 13 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất xylanase 13 1.3.1 Trên giới 13 1.3.2 Tại Việt Nam 18 CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 20 2.1.1 Chủng giống 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Môi trường 22 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 23 2.2 Phương pháp 24 2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase 24 2.2.2 Xác định hoạt tính enzym xylanase 24 2.2.3 Xác định hàm lượng protein 26 2.2.4 Tinh xylanase 27 2.2.5 Điện di SDS-PAGE 30 2.2.6 Xác định tính chất lý hóa xylanase 31 2.2.7 Xử lý số liệu 34 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nuôi biểu tinh enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp xylanase 36 3.2 Đánh giá tính chất lý hóa enzyme xylanase tái tổ hợp 39 3.2.1 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt độ 39 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính độ bền pH 40 3.2.3 Dung môi hữu 41 3.2.4 Chất tẩy rửa 42 3.2.5 Ion kim loại 43 3.3 Khả thủy phân arabinoxylan enzyme tự nhiên tái tổ hợp 43 3.3.1 Tinh enzyme tự nhiên 44 3.3.2 Khả thủy phân arabinoxylan enzyme tự nhiên tái tổ hợp 45 3.3.3 Khả phân giải chất xylanase tự nhiên tái tổ hợp 46 KẾT LUẬN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 61 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase 14 Bảng 1.2: Đặc tính số xylanase từ vi sinh vật 15 Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng .20 Bảng 2.2: Thành phần loại đệm dung dịch 21 Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng 23 Bảng 2.4: Thành phần gel cô gel tách 31 Bảng 3.1: Bảng tóm tắt trình tinh enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng A niger VTCC017/ pANXlG2 39 Bảng 3.2: Ảnh hưởng chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp 42 Bảng 3.3: Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính xylanase 43 Bảng 3.4: Tóm tắt q trình tinh xylanase từ chủng gốc A oryzae VTCC-F-187 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí xúc tác xylanase enzym khác trình thủy phân xylan .3 Hình 1.2: Cấu trúc khơng gian chiều xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran Hình 1.3: Cấu trúc không gian chiều xylanase họ 11 .6 Hình 1.4: Dạng tồn xylan gỗ cứng Hình 1.5: Dạng tồn xylan gỗ mềm Hình 1.6: Vị trí cơng enzyme vào xylan cỏ Hình 1.7: Mơ hình hoạt động xylanase .10 Hình 2.1: Đường chuẩn xylose 26 Hình 2.2: Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 27 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh xylanase tái tổ hợp từ chủng A niger tái tổ hợp 28 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh xylanase tái tổ hợp từ chủng A oryzae tự nhiên 28 Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số mẫu protein hoạt tính xylanase tái tổ hợp đĩa thạch có bổ sung chất xylan 0,5% 36 Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A oryzae VTCC-F187; (B) chủng A niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp 37 Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sau qua cột histag xylanase G2 38 Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) lên độ bền (B) xylanase tái tổ hợp .39 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH phản ứng lên hoạt tính (A) lên độ bền (B) xylanase tái tổ hợp .40 Hình 3.6: Ảnh hưởng dung mơi hữu hữu methanol (MtOH), ethanol (EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng) 41 Hình 3.7: (A) Sắc kí đồ cột Sephadex G200, (B) Điện di đồ SDS-PAGE A oryzae VTCC F187 sau qua cột sephadex G200, (C) Điện di đồ SDSPAGE A oryzae VTCC F187 sau qua cột sắc kí trao đổi ion DEAE Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Sắc ký mỏng khả thủy phân arabinoxylan thương mại hãng enzyme xylanase tự nhiên enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) 46 Hình 3.9: Sắc ký mỏng khả thủy phân chất enzyme xylanase tự nhiên enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2 O = (3:1:48)………………………………………………………………… ……49 BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APS Ammonium persulfate ARN Acid ribonucleic BLAST Basic local alignment search tool BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Bp Base pairs cDNA Complement DNA DNA Acid Deoxyribonucleic dNTP 2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kDa Kilo dalton M Marker (thang chuẩn) μg Microgam μl Microliter OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine TTH Tái tổ hợp VTCC Vietnam Type Culture Collection (Trung tâm bảo tàng giống VTCC) v/v Volume/ volume w/v Weight/ volume MỞ ĐẦU Xylan loại polysacharid chiếm phần lớn thành phần hemicellulose thành tế bào thực vật Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có phối hợp nhiều loại xylanase khác với chức khác (endo-β-1,4-Dxylanase, EC 3.2.1.8; β-D-xylosidase, EC3.2.1.37; α-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55; α-D-glucuronidase, EC 3.2.1.1; acetyl xylan esterase; EC 3.1.1.6) Endoxylanase có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Xylanase dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc (chlorine) thường dùng để tẩy lignin giấy [14], làm nước hoa quả, rượu vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67] Xylanase thủy phân hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn (arabinoxylanoligosaccharid-AXOS) Arabinoxylan (AX) thành phần chất xơ tìm thấy loạt loại ngũ cốc, dùng cho chế độ ăn kiêng có tác dụng tốt sức khỏe ngườ Nên arabinoxylan định hướng dùng làm phẩm chức [71, 61, 57] Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi cơng bố có khả sản xuất xylanase, nấm mốc sinh vật tiềm có khả tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38] Vì lý ứng dụng khác nhau, nhiều loại xylanase sản xuất từ chủng Bacillus [14] chủng nấm Aspergillus Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger Aspergillus sydowii tinh đánh giá số tính chất lý hóa xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85] Các nghiên cứu nước giới tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp xylanase E coli [88], Bacillus [85], Pichia pastoris [16] Chủng Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2 tạo từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase chèn vào vector biểu pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp đưa vào A niger VTCC F187, bước đầu thử nghiệm loại chất 0,8 % đệm potassium phosphate 20 mM pH 6,5 như: bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngơ, bột bã mía, bột gỗ, xylan pha đệm postadium phosphate 20 mM; pH 6,5 Trộn 1000 μl chất với 200 μl enzyme, ủ 55οC, thời điểm 15- 30- 60- 90 phút Dừng phản ứng đun cách thủy 10 phút, ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút thu dịch Mẫu chạy sắc ký mỏng với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) Sản phẩm thủy phân chất xylan enzyme tự nhiên tái tổ hợp kiểm tra sắc kí lớp mỏng TLC Sản phẩm trình thủy phân chất xylan cơng bố là: xylotriose (X3), xylotetraose (X4) xylopentose (X5) Kết phù hợp với nghiên cứu xylanase tái tổ hợp Anxyl 10A từ A usamii E001(Zhou et al 2008) AnxA từ A niger (Liu et al 2006) Điều chứng tỏ sản phẩm thủy phân xylan enzyme xylanase xylotriose (X3), xylotetraose (X4) xylopenose (X5) 98% (Wang et al 1998) Cơ chất đậu tƣơng Cơ chất cám gạo 47 Cơ chất lõi ngơ Cơ chất bã mía Cơ chất gỗ mục Cơ chất xylan nồng độ 0,5% Hình 3.9: Sắc ký mỏng khả thủy phân chất enzyme xylanase tự nhiên enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) Ghi chú: TN: Xylanase tự nhiên thủy phân chất; TTH: Xylanase tái tổ hợp; CX: chất chuẩn Dxylose; 15: dịch phản ứng lấy thời điểm thủy phân sau 15 phút; 30: dịch phản ứng lấy thời điểm thủy phân sau 30 phút; 60: Dịch phản ứng lấy thời điểm thủy phân sau 60 phút; 90: Dịch phản ứng lấy thời điểm thủy phân sau 90 phút Kết hình 3.9 cho thấy xynalase tự nhiên xylanase tái tổ hợp có khả phân giải chất khác tạo thành D-xylose nhiều chất 48 thủy phân mức độ khơng hồn tồn Tuy nhiên chất khảo sát khả thủy phân chất cám gạo hai enzyme tự nhiên tái tổ hợp tốt nhất, gợi ý cho việc sử dụng nguồn bột cám gạo nguồn chất để tạo sản phẩm arabinoxylan enzyme 49 KẾT LUẬN Từ số liệu thu thu số kết luận sau: Đã tinh thành công xylanase G2 tái tổ hợp Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2 Xylanase tái tổ hợp thể điện di SDS-PAGE với trọng lượng phân tử khoảng 23 kDa, với hoạt tính xylanase G2 đạt 1102,5 U/mg, hiệu suất đạt 52% với độ 2,2 lần Xylanase tái tổ hợp hoạt động tối ưu nhiệt độ 55oC, pH 6,5 Enzyme tái tổ hợp bền dải nhiệt độ pH; 25 - 40oC, pH 4-8 Hoạt tính xylanase bị ức chế kim loại nặng Ag2+, Hg2+ Chất tẩy rửa Triton X-100 Tween 80 làm tăng hoạt tính xylanase, SDS làm giảm hoạt tính Các dung mơi hữu làm giảm hoạt tính enzyme xylanase Đã tinh xylanse tự nhiên từ chủng tự nhiên Aspergillus oryzae VTCC F187 với trọng lượng phân tử 25 kDa qua hai bước tinh sắc ký lọc gel sắc ký trao đổi ion So sánh mức độ thủy phân arabinoxylan enzyme tự nhiên enzyme tái tổ hợp, số liệu cho thấy nồng độ enzyme mức độ thủy phân arabinoxylan enzyme khác Đồng thời bước đầu đánh giá khả thủy phân chất khác enzyme xylanase tự nhiên tái tổ hợp 50 KIẾN NGHỊ Tối ưu biểu nâng cao hoạt tính enzyme xylanase G2 tái tổ hợp làm nguyên liệu thủy phân cám gạo tạo sản phẩm arabinoxylan làm thực phẩm chức 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Phương Phú Công (2008), “Tuyển chọn nghiên cứu ứng dụng số chủng vi sinh vật có khả lên men xylan chế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi”, luận án tiến sĩ sinh học Đàm Thị Hồng, Đỗ Thị Tuyên (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng nấm Aspergilus awamori sinh tổng hợp xylanase đánh giá tính chất lý hóa xylanase tinh sạch, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Mở Hà Nội Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất giáo dục VIệt Nam, Hà Nội, tr 63-90 Nguyễn Thị Uyên Thảo, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng (2004), “Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì nhằm thu nhận enzyme cellulose, xylanase, pectinase bổ sung thức ăn gia súc từ vi nấm Trichoderma”, Báo cáo Khoa học Hội nghị khoa học lần thứ IV – ĐHKHTN-ĐHQGTPHCM Nguyễn Thị Thu Thùy, Nguyễn Văn Thuật, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Đình Thi (2009), “Biểu đánh giá tính chất hóa lý xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus oryzae VTCC – F187 Pichia pastoris GS115”, Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc 2009, tr 710-714 Lê Văn Trường, T Schweder, (2010), “Biểu cao gen mã hóa xylanase Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8, 3A, tr 827- 832 Đỗ Thị Tuyên, Đàm Thị Hồng, Quyền Đình Thi (2009), “Đánh giá số tính chất hóa lý xylanse chủng nấm Aspergillus niger DSM1957 dịch tinh sơ bộ”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, (6), tr 16-21 Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), “Biểu đánh giá tính chất hóa lý xynalase tái tổ hợp từ chủng Asprgillus niger DSM1957 52 Pichia pastoris GS115”, Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc 2009, tr 151-157 Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Văn Thuật, et al (2008b), “Đánh giá số tính chất hóa lý xylanase từ chủng nấm A oryzae DSM1863”, Tạp CNSH, 6(1), tr 721-728 Ting anh 10.Adigỹzel A.O., Tunỗer M (2016), “Production, characterization and application of a xylanase from Streptomyces sp AOA40 in fruit juice and bakery industries”, Food Biotechnol, 30, pp 189–218 11 Adiguzel G., Faiz O., et al (2019), “A novel endo-β-1,4-xylanase from Pediococcus acidilactici GC25; purification, characterization and application in clarification of fruit juices”, Int J Biol Macromol, 129, pp 571–578 12 Ahmad M., Hirz M., et al (2014), “Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production” Appl Microbiol Biotechnol, 98, pp 5301–5317 13 Ahmed S., Riaz S., et al (2009), “Molecular cloning of fungal xylanases: an overview”, Appl Microbiol Biotechnol, 84, pp 19–35 14 Ayyachamy M., Vatsala T.M (2007), “Production and partial characterization off cellulase free xylanase by Bacillus subtilis C01 using agriresidues and its application in biobleaching of nonwoody plant pulps”, Lett Appl Microbiol, 45, pp 467-472 15 Bajpai P (2012), “Biobleaching In Bajpai P (eds) Biotechnology for pulp and paper processing”, Springer, Berlin, pp 93–138 16 Basit A., Liu J., et al (2018), “Characterization of two endo-β-1,4-xylanases from Myceliophthora thermophila and their saccharification efficiencies, synergistic with commercial cellulase”, Front Microbiol, 9, pp 1–11 17 Beg K.Q., Kapoor M., et al (2001), “Microbial xylanase their industrial application: a review”, App Microbiol Biotechnology, 56, pp 326-338 53 18 Belancic A., Scarpa J., et al (1995), “Penicillium purpurogenum produces several xylanases: purification and properties of two of the enzymes”, J Biotechnol, 41, pp 71–79 19 Bissoon S., Christov L (2002), “Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp”, Process Biochem, 37, pp 567-572 20 Bradford M M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal Biochem, 72, pp 248-54 21 Bray M R., Clarke A.J (1995), “Identification of an essential tyrosyl residue in the binding site of Schizophyllum commune xylanase-A”, Biochemistry, 34, pp 2006-2014 22 Butt M.S., Tahir-Nadeem M., et al (2008), “Xylanases and their applications in baking industry” Food Technol Biotechnol, 46, pp 22–31 23 Collins T., Gerday C., et al (2005), "Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases", FEMS Microbiol Rev, 29(1), pp 3-23 24 Courtin C.M., Delcour J.A (2002), “Arabinoxylans and endoxylanases in wheat flour bread-making”, J Cereal Sci, 35, pp 225- 243 25 Cummins P M., Rochfort K D., et al (2017), "Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application", Methods Mol Biol, 1485, pp 209-223 26 Danalache F., Mata P., et al (2018), “Enzyme-assisted extraction of fruit juices” Elsevier Inc., New York 27 De Faria F.P., Te’o V.S.J., et al (2002), “Expression and processing of a major xylanase (XYN2) from the thermophilic fungus Humicola grisea var thermoidea in Trichoderma reesei”, Lett Appl Microbiol, 34, pp 119–123 28 Dhiman S.S., Sharma J., et al (2008a), “Industrial applications and future prospects of microbial xylanases: a Review”, BioResources, 3(4), pp 1377–1402 29 Do T.T., Quyen D.T., et al (2009), "Optimiation of some culture conditions for Aspergillus niger VTCC-F-017 and Aspergillus oryzae VTCC-F-187 producing xylanase", The analytica Vietnam conference 2009, pp 294-301 54 30 Do TT., Quyen DT., et al (2010), "Purification and properties of a thermoactive xylanase from Aspergillus oryzae DSM1863", Middle–East Journal of Scientific Research, 6(4), pp 392-397 31 Duong-Ly K C., Gabelli S B (2014), "Gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) of proteins", Methods Enzymol, 541, pp 105-14 32 Facchini F.D.A., Vici A.C., et al (2011), “Production of fibrolytic enzymes by Aspergillus japonicus C03 using agro-industrial residues with potential application as additives in animal feed”, Bioprocess Biosyst Eng, 34, pp 347–355 33 Fernandez-Espinar, M et al (1994), “Purification, characterization and regulation of the synthesis of an Aspergillus nidulans acidic xylanase” Appl Microbiol Biotechnol, 42, pp 555-562 34 Fialho, M B and E C C (2004), “Purification and characterization of xylanases from Aspergillus giganteus”, Folia Microbiol, 49(1), pp 13-18 35 Garg N., Kumar A., et al (2010), “Xylanase: applications and biotechnological aspects: biotechnological aspects of xylanase”, LAP LAMBERT Academic Publ, Lambert 36 Ghoshal G., Shivhare U.S., et al (2013), “Effect of xylanase on quality attributes of whole-wheat bread” J Food Qual, 36, pp 172-180 37 Goswami G.K., Krishnamohan M., et al (2014), “Cloning and heterologous expression of cellulose free thermostable xylanase from Bacillus brevis”, Springerplus, 3, pp 1–6 38 Haltrich, D., Nidetzky B., et al (1996), “Production of fungal xylanases”, Bioresour Technol, 58, pp 137-161 39 Hazlewood G.P., Gilbert H.J (1993), “Molecular biology of hemicellulases, in Hemicelluloses and Hemicellulases”, Coughlan, M P and Hazlewood, G P Eds., Portland Press, London, pp.103-126 40 He Fanglian (2011), "Laemmli-SDS-PAGE", Bio-protocol, 1(11), pp e80 55 41 Jeffries T.W (1996), “Biochemistry and genetics of microbial xylanases”, Curr Opin Biotechnol., 7, pp 337-342 42 Jhamb K., Sahoo D.K (2012), “Production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli: effects of process conditions and chaperone co-expression on cell growth and production of xylanase”, Bioresour Technol,123, pp 135–143 43 Joshi C., Khare S.K (2011), “Utilization of deoiled Jatropha curcas seed cake for production of xylanase from thermophilic Scytalidium thermophilum”, Bioresour Technol, 102, pp 1722–1726 44 Juturu V., Wu J.C (2012), “Microbial xylanases: engineering, production and industrial applications”, Biotechnol Adv, 30, pp 1219–1227 45 Kimura T., Suzuki H., et al (2000), "Molecular cloning, overexpression, and purification of a major xylanse from Aspergillus oryzae”, Biosci Biotechnol Biochem, 64(12), pp 2734-2738 46 Kimura T., Suzuki H., et al (2002), “Molecular cloning, charaterization, and expression analysis of the xynF3 gene from Aspergillus oryzae”, Biosci Biotechnol Biochem, 66(2), pp 285-292 47 Ko C-H., Lin Z-P., et al (2010) “Xylanase production by Paenibacillus campinasensis BL11 and its pretreatment of hardwood kraft pulp bleaching" Int Biodeterior Biodegrad, 64, pp 13–19 48 Krengel U., Dijkstra B.W (1996), "Three-dimensional structure of Endo-1,4-beta xylanase I from Aspergillus niger: molecular basis for its low pH optimum", J Mol Biol, 263(1), pp 70-8 49 Krisana, A et al (2005), “Endo-1,4-β-xylanase B from Aspergillus cf niger BCC14405 isolated in Thailand: Purification, characterization and gene isolation” J Biochem Mol Biol, 38(1), pp 17-23 50 Kulkarni N., Shendye A., et al (1999), "Molecular and biotechnological aspects of xylanases", FEMS Microbiol Rev, 23(4), pp 411-56 56 51 Kumar V., Shukla P (2018), “Extracellular xylanase production from T lanuginosus VAPS24 at pilot scale and thermostability enhancement by immobilization”, Process Biochem, 71, pp 53–60 52 Kuno, A., Kaneko, S., et al (2000), “Novel sugar- binding specificity of the type XIII xylan-binding domain of a family F/10 xylanase from Streptomyces olivaceoviridis E-86”, FEBS Letts, 482, pp 231-236 53 Leggio L L., Jenkins J., et al (2000), "X-ray crystallographic study of xylopentaose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A", Proteins, 41(3), pp 362-73 54 Li J., Wang J., et al (2012), “Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters”, Microb Cell Fact, 11, pp 84 55 Lin X., Wu Z., et al (2018), “Enzymatic pulping of lignocellulosic biomass”, Ind crop prod, 120, pp 16–24 56 Liu M.Q., Weng X.Y., et al (2006), “Expression of recombinant Aspergillus niger xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan”, Protein Expr Purif, 48, pp 292-299 57 Lu F., et al (2008), “Purification and characterization of xylanase from Aspergillus ficuum AF-98”, Bioresour Technol, 99, pp 5938-5941 58 Lu Z.X., et al (2004), “Arabinoxylan fibre improves metabolic control in people with Type II diabetes”, European Journal of Clinical Nutrition, 58, pp 621-628 59 Meagher M.M., Tao, B.Y., et al (1988), “Kinetics and subsite mapping of β-D- xylobiose and D-xylose producing Aspergillus endoxylanase”, Carbohydr Res., 173, pp 273-283 60 Miller G L (1959), "Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar", Analytical Chemistry, 31(3), pp 426-428 57 61 Möhlig M, K C., Weickert M.O., et al (2005), “Arabinoxylan-enriched meal increases serum ghrelin levels in healthy humans” Horm Metab Res, 37(5), pp 303308 62 Nair, S., Sindhu R., et al (2008), “Purification and biochemical characterization of two xylanases from Aspergillus sydowii SBS 45”, Appl Biochem Biotechnol, 149, pp 229-243 63 Nevalainen H., Peterson R (2014), “Making recombinant proteins in filamentous fungi-are we expecting too much”, Front Microbiol, 5, pp 1-10 64 Nevalainen H., Peterson R., et al (2018), “Overview of gene expression using filamentous fungi”, Curr Protoc Protein Sci, 92, pp e55 65 Pérez J., Munoz-Dorado J., et al (2002), “Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview”, Int Microbiol, 5, pp 53–63 66 Pirgozliev V., Whiting I., et al (2016), “Variability between wheat dry distillers grains with solubles samples influence the effectiveness of exogenous enzymes when fed to broiler chickens”, Vet Med Anim Stud, 6, pp 61–69 67 Polizeli M.L., Rizzatti A.C., et al (2005), “Xylanase from fungi: properties and industrial application” Appl Microbiol Biotechnol, 67, pp 577-591 68 Poutanen K (1998), “Characterisation of xylanolytic enzyms for potential applications Ph.D Thesis”, Technical Research Centre of Finland, Publications, 47, Espoo 69 Qiu Z., Shi P., et al (2010), “A xylanase with broad pH and temperature adaptability from Streptomyces megasporus DSM 41476, and its potential application in brewing industry”, Enzyme Microb Technol, 46, pp 506–512 70 Ramón Gerardo Guevara-González and lrineo Torres-Pacheco (2006), “Xylanase Advances in Agricultural and Food Biotechnology”, 305-322 ISBN: 81-7736-269 71 Rao R.S., Muralikrishna G (2006), “Water soluble feruloyl arabinoxylans from rice and ragi: changes upon malting and their consequence on antioxidant activity Ph” 58 72 Rychen G., Aquilina G., et al (2018), “Safety and efficacy of ECONASE®XT (endo-1,4-β-xylanase) as a feed additive for pigs for fattening”, EFSA J, 16, pp e05217 73 Sapag A., Wouters J., et al (2002), “The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships”, J Biotechnol, pp 109-131 74 Su X., Schmitz G., et al (2012), “Heterologous gene expression in filamentous fungi In: Gadd GM, Sariaslani S (eds) Advances in applied microbiology”, Academic Press, Cambridge, pp 1–61 75 Subramaniyan S., Prema P (2002), "Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application", Crit Rev Biotechnol, 22(1), pp 3364 76 Subramaniyan S., Prema P (2003), “Biotechnology of Microbial Xylanases: Enzymology, Molecular Biology and Application”, Critical Reviews in Biotechnology, Kerala, India, pp 1030-1045 77 Thomas L., Sindhu R., et al (2015), “Production of an alkaline xylanase from recombinant Kluyveromyces lactis (KY1) by submerged fermentation and its application in bio-bleaching”, Biochem Eng J, 102, pp 24–30 78 Van Dorn R., Shanahan D., et al (2018), “Safety evaluation of xylanase 50316 enzyme preparation (also known as VR007), expressed in Pseudomonas fluorescens, intended for use in animal feed”, Regul Toxicol Pharmacol, 97, pp 48–56 79 Verma D., Kawarabayasi Y., et al (2013), “Cloning, expression and characteristics of a novel alkalistable and thermostable xylanase encoding gene (Mxyl) retrieved from compost-soil metagenome”, PLoS ONE, 8, pp e52459 80 Wakarchuk W.W., Campbell R.L., et al (1994), “Mutational and crystallographic analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase”, Prot.Sci., 3, pp 467-475 59 81 Wakiyama M., Tanaka H., et al (2008), “Purification and properties of family-10 endo-1,4-β-xylanase from Penicillium citrinum and structural organization of encoding gene”, J Biosci Bioeng, 105, pp 367–374 82 Walia A., Guleria S., et al (2017), “Microbial xylanases and their industrial application in pulp and paper biobleaching: a review”, Biotech, 7, pp 1–12 83 Whiting I.M., Rose S.P., et al (2019), “Effect of wheat distillers dried grains with solubles and exogenous xylanase on laying hen performance and egg quality”, Poult Sci, 98, pp 3756–3762 84 Wong K.K.Y., Tan, L.U.L., et al (1988), “Multiplicity of β-1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications”, Microbiol Rev, 52, pp 305-317 85 Yang, Y., Zhang W, et al (2010), “Purification and characterization of an extracellular xylanase from Aspergillus niger C3486”, Afr J Microbiol Res, 4, pp 2249–2256 86 Zhang M., Jiang Z., et al (2010a), “Cloning and expression of a Paecilomyces thermophila xylanase gene in E coli and characterization of the recombinant xylanase”, Bioresour Technol, 101, pp 688–695 87 Zhang W., Lou K., et al (2010b), “Expression and characterization of the Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 xylanase gene (xynB) in Bacillus subtilis”, Appl Biochem Biotechnol, 160, pp 1484–1495 88 Zhou C., et al (2008), “Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli”, Bioresour Technol, 99, pp 831-838 60 CÁC BÀI BÁO ĐÃ CƠNG BỐ Hồng Thu Huyền, Nguyễn Thị Kim Thu, Lê Thanh Hoàng, Đào Thị Mai Anh, Đỗ Thị Tuyên (2019), “Nghiên cứu điều kiện tinh enzyme xylanase tự nhiên từ chủng Aspergillus oryzae” Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc 2019: 36-37 61 ... sau: Tinh enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp Đánh giá tính chất lý hóa xylanase tái tổ hợp Thử nghiệm khả thủy phân enzyme xylanase tái tổ hợp enzyme xylanase tự nhiên CHƢƠNG TỔNG... xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả thủy phân arabinoxylan chế phụ phẩm nông nghiệp thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tinh đánh giá tính chất xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14