Sản xuất phân bón VI SINH từ nấm TRICHODERMA

Trong tự nhiên, đất chứa nhiều vi sinh vật sống chung với nhau. Trong thời gian gần đây, người ta thường bàn nhiều đến Trichoderma và các công dụng của nó trong lĩnh vực phân bón vi sinh. Tuy nhiên Trichoderma không phải mới được phát hiện và ứng dụng gần đây mà khoảng 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: Trichoderma caesium Pers. T.nigrescens Pers, T.viride var. viride Pers. Cho đến năm 1801 Persoon và Gray đã mô tả chi tiết thêm 4 loài nấm Trichoderma đó là: T. aureum Pers (1796), T. laeve Pers (1796), T. dubium Pers (1801), T. fuliginoides Pers (1801). Trong suốt 2 thế kỹ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến hiện nay (2013) đã có trên 150 loài nấm Trichoderma được mô tả.

SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH TỪ NẤM TRICHODERMA

1 Giới thiệu

1.1 Lịch sử ra đời của sản phẩm:

Trong tự nhiên, đất chứa nhiều vi sinh vật sống chung với nhau Trong thời gian gần đây,

người ta thường bàn nhiều đến Trichoderma và các công dụng của nó trong lĩnh vực phân bón vi sinh Tuy nhiên Trichoderma không phải mới được phát hiện và ứng dụng gần đây

mà khoảng 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm

1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: Trichoderma caesium Pers T.nigrescens Pers, T.viride var viride Pers Cho đến năm 1801 Persoon và Gray đã mô tả chi tiết thêm 4 loài nấm Trichoderma đó là: T aureum Pers (1796), T laeve Pers (1796),

T dubium Pers (1801), T fuliginoides Pers (1801) Trong suốt 2 thế kỹ tiếp theo đến năm

1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới Cho đến hiện nay (2013) đã có trên 150

loài nấm Trichoderma được mô tả

Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã nghiên cứu và

khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma Và những ứng dụng về phân

giải cellulose của chúng Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm

bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp

Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế

được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái Điều không may là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng

may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ.

Trong các hệ sinh thái tự nhiên như trong rừng, các loài nấm thường kết hợp với các vi khuẩn phân hủy cellulose thành các đơn phân (monomer) rất dể hấp thu đối với các sinh vật khác Tuy nhiên trong các hệ sinh thái nhân tạo như các vườn, trang trại, đồn điền, ruộng lúa, các sinh vật phân hủy cellulose trên không tồn tại hoặc rất ít, do đó sẽ không diễn ra quá trình phân hủy cellulose (cũng như các chất cao phân tử khác) một cách dể dàng và nhanh chóng như trong các hệ sinh thái rừng tự nhiên Vì vậy, chúng ta cần phải

bổ sung thêm các loài có khả năng phân hủy cellulose mạnh như Trichoderma, xạ khuẩn

vào trong các nguyên liệu chứa cellulose để việc phân hủy được nhanh chóng và triệt để hơn Vì việc phân hủy cellulose diễn ra chậm sẽ dẫn đến cây trồng bị ngộ độc nếu không

"xử lý" các chất hữu cơ này Tập quán canh tác hiện nay thường đốt bỏ các chất cellulose này đi và dùng phân hóa học để "bổ sung" cho những thứ lấy từ đất vừa bị đốt đi, cả 2 việc trên đều có ảnh hưởng xấu đến môi trường sống của chúng ta Nếu đốt bỏ rơm rạ trên mỗi ha ruộng lúa đồng nghĩa với việc đốt bỏ hơn 28 triệu đồng cho mỗi ha cho mỗi

vụ Nếu tận dụng phế liệu rơm rạ làm phân bón, chúng ta không những có thể tiết kiệm

26 triệu đồng cho mỗi ha/vụ mà còn giúp bảo vệ môi trường sống xung quanh ta và cho thế hệ mai sau

Ngoài việc giải quyết bài toán kinh tế cũng như ô nhiễm môi trường, Trichoderma còn có

đặc tính kháng các loại nấm, có thể điều trị các bệnh do nấm gây ra ở rể cây như

Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthor,…

Vì vậy sử dụng phân bón chứa Trichoderma sẽ có những lợi ích sau:

• Tận dụng được phế liệu thực vật làm nguyên liệu sản xuất (phân bón) Bảo vệ rễ cây khỏi các tác nhân gây bệnh

• Giảm thiểu việc dùng thuốc trừ sâu hóa học để tiêu diệt các nấm gây bệnh Giảm thiểu dùng phân bón hóa học

• Giảm thiểu ô nhiễm môi trường

• Đẩy nhanh quá trình hấp thu chất dinh dưỡng và kích thích tăng trưởng cây trồng

• Không gây hại cho người và vật nuôi

• Có phổ đối kháng rộng trên các loài nấm gây bệnh trên cây trồng

• Sử dụng nhiều cơ chế để kháng lại các vi sinh vật gây bệnh

• Tồn tại lâu dài trong đất nhờ khả năng tự sản sinh ra bào tử [3]

2 Nội dung:

2.1 Tìm hiểu về chủng nấm Trichoderma:

2.1.1 Giới thiệu về chủng nấm Trichoderma:

Trichoderma có những loài như T harzianum, T viride, T koningii, T hamatum … Nấm Trichoderma hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống

khác Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất Chúng hiện diện với mật độ cao

và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất

sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và

chúng có thể tồn tại, còn hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, ví dụ như các loài T viren , T flavofuscum, T harzianum, T viride, T koningii, T.hamatum,… Tuy nhiên,

không có nhiều giống có khả năng này.[4]

Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi

có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài

nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ; làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh [4]

Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh

giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát sinh học Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái, chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính Gần đây, nhiều phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng

Bộ gen của nhiều loài Trichoderma đã được giải mã và được công bố công khai từ JGI

Bộ gen của nấm Trichoderma có khoảng 30-40 Mb, với khoảng 12.000 gen được định

danh

Nấm Trichoderma phát triển nhanh ở 25-30°C, có một số ít loài Trichoderma tăng trưởng

được ở 45°C

Khuẩn lạc của nấm Trichoderma có màu trong suốt trên môi trường thạch đường bột ngô

(CMD) Trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) khuẩn lạc có màu trắng, đôi khi

có màu vàng nhạt và có mùi thạch dừa đặc trưng

Sợi nấm Trichoderma phân nhánh mạnh, thường được hình thành ở dạng gần như vòng

tròn đồng tâm ở phần trục chính gần cực Các nhánh sợi nấm thường mọc tạo gốc với trục chính khoảng 90 độ Phần ngọn sợi nấm thường có dạng như ngọn cây thông hay

kim tự tháp (ví dụ với T conidiophore) [4, 10]

Hình 2.1: Khuẩn ty và bào tử của nấm Trichoderma

2.2.2 Cơ chế hoạt động của Trichoderma:

Cơ chế phân giải Cellulose

Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzyme khác nhau có khả năng phối hợp để phân hủy tinh thể cellulose T reesei sản sinh ra 5 loại enzyme endoglucanase, 2 exoglucanase

và 1 cellobiase (β- glucosidase)

Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước:

Cellulase liên kết với cellulose thông qua trung tâm liên kết với cellulose trên enzyme (giai đoạn 1) Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất (giai đoạn 2) Hình thành phức hệ enzyme - cơ chất ( giai đoạn 3 ) Thủy phân liên kết β-

glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei

tiết ra β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả nghiên cứu Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ) Giải hấp của cellulase từ các chất nền hoặc lặp lại bước

4 hoặc 2/3 các bước nếu chỉ có lĩnh vực xúc tác tách ra từ dây chuyền (giai đoạn 5) [5]Thủy phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase Ngoài ra, sản phẩm ức chế và

sự biến đối cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên (giai đoạn 6) [5]

2.2.3 Những cải tiến của chủng Trichoderma:

2.2.3.1 Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei

2.2.3.1.1 Khuếch đại biểu hiện cbhl bằng cách tăng số bản sao gen cbhl:

Plasmid pALK496 đã được xây dựng và chuyển vào nấm T reesei ALK02221 để tăng số lượng bản sao của gen cbhl.

Hình 2.2 Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [Kelly và Hynes, 1985].

Các chủng biến đối được khảo sát khả năng tống hợp cellulase bằng phương pháp filter paper-hydrolyzing activity (FPU) So với chủng chủ ALK02221, lượng CBHI tăng 1.5 lần ở chủng ALK03760, 1.4 lần ở chủng ALK03862 và 1.3 lần ở chủng ALK03761 (bảng 2.1) Ngoài ra, những thay đối trong số lượng của CBHII và EGI đã được tìm hiếu, số lượng CBHII giảm 25% ở chủng ALK03760 và chủng ALK03862, nhưng ở chủng ALK03761 lượng CBHII đã tăng 15% so với chủng chủ ALK02221 Đáng ngạc nhiên, số lượng EGI giảm 30% và 40% trong ALK03760 và chủng ALK03862 so với chủng chủ

ALK02221, mặc dù các gen egll được giữ nguyên vẹn trong bộ gen Mức độ tiết ra các

protein tăng lên so với chủng chủ.[5]

Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ẢLK02221 và bởi chủng đã biến đồi

ALK03760, ALK03862, ALK03761.

2.2.3.1.2 Khuếch đại biếu hiện cbh2 bằng cách sử dụng promoter mạnh cbhl:

Casset của pALK546 (hình 23) chứa promoter mạnh cbhl biến nạp vào chủng ALK02221

nhằm điều khiển biểu hiện cbh2 bằng promoter cbhl Chủng biến đổi được phân tích bằng

phương pháp Southern Blot nhằm khắng định sự tồn tại của đoạn promoter.[5]

ADN toàn phần được phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn Xhol Sản phẩm của quá trình này được lai với đoạn ADN của pALK 546 được phân cắt bởi EcoRI và BamHI.

Giếng 1 và 6: khối lượng phân tử marker, giếng 2: ALK02221, giếng 3:ALK03798, giếng 4: ALK03799, giếng 5: ALK03873.[5]

Locus của cbhl và cbh2 có kích thước 9.1 kb và 9.8 kb nằm trên cùng một vị trí kích thước được tìm thấy ở mọi chủng Vạch có kích thước 4.9 kb tương ứng đoạn gen ble liên kết với promoter cbhl( ble-cbhl promoter), vạch có kích thước 3.4 kb tương ứng đoạn cbh2 và đầu 3’ của gen egỉ2, vạch có kích thước 2.3 kb là đoạn 5’ của gen egl2 liên kết với ble Kết quả cho thấy chủng ALK03898 và ALK03899 chứa 1 bản sao có nguồn gốc

từ plasmide pALK546 tuy nhiên vị trí chèn của bản sao này chưa được xác định Một số

nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng ALK03873 chứa 1 bản sao chèn vào vị trí egl2.[4] Lượng CBHII tăng từ 3- 4 lần khi ta tăng thêm số lượng bản sao gen cbh2 dưới sự điều khiển của promoter mạnh cbhl Chủng ALK03798 (chứa EGII) sản xuất lượng lớn CBHII

(gấp 4 lần so với chủng chủ ALK02221) ALK03873 (không chứa EGII) và ALK03799 (chứa EGII) sản xuất lượng CBHII lớn gấp 3 lần so với chủng chủ Chủng ALK03798 và ALK03799 sản xuất lượng CBHI khoảng 20% và ALK03873 khoảng 10% so với chủng chủ Lượng endoglucanase giảm 20% ở chủng ALK03798 và ALK03799 Như vậy thiếu

gen egl2 trong chủng ALK03873 là nguyên nhân làm giảm lượng endoglucanase.[5]

2.2.3.2 Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG) ở chủng T.reesei bằng cách sử dụng promoter mạnh:

T.reesei VTT-D-79125 là chủng đột biến sản xuất lượng lớn cellulase gồm EGI/II, CBHI/II ALK02698 là chủng sản xuất lượng lớn EGI không chứa gen cbhl- được thay thế bởi casset biểu hiện egl1 Vì vậy, hai chủng này được sử dụng như thể nhận plasmid

nhằm tạo chủng biến đổi có khả năng sản xuất lượng lớn EGII Endoglucanase sản xuất

bởi chủng biến đổi EGII liên quan đến số lượng bản sao của casset biểu hiện egl2 Chủng T.reesei sản xuất lượng lớn EGI/II và không tổng hợp CBHI/II được xây dựng bằng cách thay cbh2 bằng gen egl2.[5]

Các chủng được biến đổi nhờ vào pALK537 và pALK540 pALK537 gồm promoter cbhl kich thước 2.2 kb và đoạn Avall của vùng kết thúc cbhl có kích thước 0.7 kb pALK540 chứa promoter cbhl, nhân tố kết thúc và egl2 như trong pALK537.[5]

Hình 2.5: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537 egl2 được nối với promoter cbhl Đoạn Notl 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi.

Hình 2.6: Giới hạn của plasmid pALK540 Đoạn Clal-Pvul 11.6 kb thì được tách ra từ plasmid đế thực hiện biến đối.

Biến đối chủng T.reesei: đế gen egl2 biếu hiện cho lượng lớn EG, promoter mạnh của gen cbhl được dùng nhằm điều khiển biểu hiện gen egl2 Tương tự như nghiên cứu trình bày

phần trên, các chủng biến đối được phân tích bằng Southern Blot nhằm xác định số lượng

bản sao của egl2.[5]

Hình 2.7 Southern blotting của chủng ALK03530 và ALK03574.

Chủng ALK03574 chứa 1 bản sao egll trong pALK537 tại locus cbhl trong khi chủng ALK03530 chứa 2 bản sao egll tại cùng vị trí Hơn nữa, lượng EGI, CBHI/II cũng được

phân tích cụ thể.[5]

2.2.3.3 Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG) ở chủng T.reesei bằng

cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài:

Nhân bản gen cellulase từ Melanocarpus albomyces và biểu hiện chúng ở T.reesei do nhiều nghiên cứu tìm thấy ở M albomyces có 3 gen hiệu quả sản xuất cellulase đó là

:Cel7A, Cel45A, Cel7B Nếu những gen này hoạt động dưới sự điều khiển của promoter

mạnh cbhl ở T.reesei biến đổi gen có thể sẽ cho sản lượng endoglucanase cao ở chủng

biến đối [5]

M.albomyces (ALK0237, CBS685.95) sử dụng như là chủng cho gen cellulase Chủng E.coliXL 1-Blue MRA sử dụng như chủng chủ tạo thư viện gen cho M.albomyces T.reesei ALK03620 (gen egl2 xóa bỏ) là chủng để biến đổi T.reesei ALK04072 là chủng không chứa gen cbhl, egl2 dùng như chủng đối chứng ADN nhiễm sắc thể của M.albomyces thì được phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Sau3A Đoạn ADN 5- 15 kb liên kết Lambda DASHRII và được biến nạp vào trong tế bào E.coli XL-Blue MRA Các

gen cel45A, cel7A, cel7B được khuếch đại bằng PCR Các primer sử dụng để khuếch đại gen.[5]

Hình 2.8: Các plasmid được sử dụng cho biến đối T.reesei ALK3620 biểu hiện gen cel45A, cel7A, cel7B ở M.albomyces

2.3 Môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma

Nitrat là nguồn nitơ thích hợp đối với việc tổng hợp cellulase Tuy nhiên muối Amon có thể làm ức chế sự tổng hợp của cellulase (nguyên nhân do làm giảm pH của môi trường dẫn đến việc làm bất hoạt cellulase hoặc làm cố định enzym lại trong sợi nấm)

T viride có thể tổng hợp cellulase rất tốt khi nuôi cấy trên hổn hợp cám tiểu mạch: mùn

cưa (tỷ lệ 2:1) đã được axit hóa và làm ẩm

-Môi trường nuôi nấm Trichoderma thông dụng là: KH2PO4: 0,2%, (NH4)2SO4: 0,14%, URE: 0,03%, MgSO4.7H2O: 0,03%, CaCl2: 0,03%, FeSO4.7H2O: 5mg/l, MnSO4.H2O: 1,56 mg/l, ZnSO4.7H2O: 1,4 mg/l, CoCl2: 2mg/l,0020, Pepton: 0,1% [2]

2.3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái của Trichoderma và khả năng sản xuất enzyme cellulase:

Qua việc nghiên cứu chủng T reesei đã xác định hình thái của nấm ảnh hưởng đến khả năng sản xuất cellulase ở T reesei nuôi cấy trong môi trường lactose và lactobionic acid

kiểu fed-batch trong bồn bioreactor 7 lít Khi cho cellulose vào dịch chiết nấm men từ môi trường nuôi cấy đã cho hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất với thế tích enzyme có hoạt tính 69.8U/L.h, và sinh khối nấm men cực đại là 14.7g/l Những phát hiện này kèm theo đặc điểm hình thái của nấm: tổng sợi nấm là 98% tổng diện tích ước lượng, với chiều dài sợi nấm 10mm, thể tích 45.1 mm3, đường kính 7.9mm, số lượng nhánh 9, và số lượng đỉnh mỗi sợi nấm là 29 Một sự tương quan rõ ràng đã được tìm thấy giữa các sợi nấm, số lượng đỉnh và khả năng sản xuất enzyme cellulase.[5]

2.2.3 Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trưòng nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase.

Nghiên cứu được thực hiện trên chủng T.reesei:

Mỗi cơ chất và mỗi vi sinh vật nhất định thích hợp ở 1 pH khác nhau và ảnh hưởng tới sản lượng của sản phẩm Theo báo cáo của Andreotti et al thì T.reesei sinh trưởng tốt nhất trong môi trường nuôi cấy ở pH =5 và hơi chậm ở pH 4.5 và 4 Tuy nhiên, Chahal et ai

cho thấy rằng T.reesei sản xuất cellulase tối ưu ở pH=6.0.[5]

Với cơ chất là α -cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu tại pH 5.0 Sản lượng cellulase thấp ở pH 3.0 và 7.0 Tuy nhiên, trong các tài liệu công bố trước

thì pH 3.0, pH 4,0; và pH 5,0 cho sản lượng cellulase cao của nấm T reesei Trong một

thử nghiệm khác , khi pH 5,0 ± 0.05, lượng cellulase đạt 4 IU / ml trong vòng 91h [4]Với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose, và phần còn lại là hemicelluloses và lignin)

thì hoạt tính của T.reesei tối ưu ở pH 6.0

Ta nhận thấy rằng nếu cơ chất cảm ứng chứa nhiều cellulose thì sản lượng đạt tối ưu ở thời gian ngắn hơn Và pH tối ưu cũng phụ thuộc cơ chất Nếu cơ chất alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì pH tối ưu ở 5 Nếu cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose ) thì

pH tối ưu ở 6.[5]