bài giảng thi công chức môn sinh học

bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học

Tiết 1: CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA KĨ THUẬT DI TRUYỀN

I Mục tiêu tiết học

Cung cấp cho sinh viên khái niệm và các thao tác cơ bản của kĩ thuật ditruyền (thu nhận gen, tạo vector tái tổ hợp, tạo plasmid, chọn lọc, tạo dòng và biểuhiện )

II Chuẩn bị phương tiện dạy học

Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,

III Các phương pháp dạy học chủ yếu

Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề

IV Nội dung

1 Khái niệm

Kĩ thuật di truyền là các thao tác tác động lên DNA để chuyển một đoạnDNA mang một hoặc một cụm gen từ tế bào của loài cho sang tế bào của loài nhậnnhờ thể truyền

Còn có các tên gọi khác như: Kĩ thuật tái tổ hợp DNA, kĩ thuật gen, thao tácgen, tạo dòng phân tử

2 Sơ đồ khái quát

Kĩ thuật di truyền được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp và tinh vi,bao gồm các bước chủ yếu sau:

- Bước 1: Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho cungcấp DNA

- Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho

- Bước 3: Cắt cả hai loại DNA bằng cùng một loại enzyme Restrictionendonuclesae EcoRI tạo các đầu so le cố kết (cohesive ends)

Bài giảng thi tuyển công chức

- Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với đoạn DNA tế bào cho(người) để chúng gắn vào nhau bằng bắt cặp bổ sung nhờ đầu so le cố kết

- Bước 5: Thêm enzyme nối ligase tạo liên kết hóa trị thành DNA tái tổ hợphoàn chỉnh

- Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp và tế bào nhận ( vi khuẩn E coli)

- Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng vi khuẩn mang gen lạ Sau khi có dòng sẽ tạo

điều kiện để gen biểu hiện tạo ra sản phẩm

Hình 1.1 Phương thức cơ bản để tạo dòng gen

RE RE

RE Cắt DNA ngoại lai và

plasmid vector bằng

một loại RE giống nhau Plasmid vector

DNA được tạo

Gắn

Plasmid tái tổ hợp Biến nạp

3 Các kĩ thuật và phương pháp căn bản

3.1 Lai nucleic acid

Công nghệ gen sử dụng các kĩ thuật hóa lí thông dụng như: tách chiết vàtinh sạch DNA, RNA, xác định số lượng và đánh dấu DNA, điện di trên gel, Sửdụng đặc tính biến chất rồi hồi tính, có thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA vớiRNA, RNA với RNA

- Lai trên pha rắn: Thấm Southern blot, thấm Northern blot, phươngpháp dot (điểm) và slot (khe) blot

- Lai tại chổ (in situ hybridisation): là kiểu lai phân tử, trong trình tựnucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô

3.2 Thu nhận gen

3.2.1 Thư viện DNA từ bộ gen

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của sự pháttriển kĩ thuật tái tổ hợp DNA Toàn bộ DNA của một sinh vật được cắt đoạn nhỏbằng lắc cơ học hay bởi các RE rồi gắn vào các vector tạo dòng, nên tiếng Anh gọi

là phương pháp Shotgun (bắn đạn chài).

Hình 1.2 Xây dựng thư viện genomic DNA

Bài giảng thi tuyển công chức

3.2.2 Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học

Năm 1977, K Itakura và Boyer đã thành công trong tổng hợp nhân tạo gen

mã hóa hormone somatostatin (chỉ có 14 amino acid) và biểu hiện trong tế bào E.

coli Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn

tổng hợp insulin

Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổnghợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ởprotein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp

3.2.3 Lập ngân hàng cDNA

Tạo gen từ các mRNA được sử dụng rộng rãi nhờ enzyme phiên mã ngược

(reverse transcriptase) Nó có khả năng tổng hợp nên DNA mạch đơn – cDNA từ

khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học

Sử dụng ngân hàng cDNA các các ưu thế sau:

- Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen

- Những tế bào chuyên hóa tạo một số lớn protein một loại và mRNAtương ứng của protein giàu có đó sẽ dể tách ra để tạo ngân hàng cDNA Nhờ vậygiảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen

3.3 Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp

Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là gắn các đoạn DNA hay các cDNAvào vector chuyển gen để tạo nên plasmid có mang gen lạ - plasmid tái tổ hợp

(recombinant plasmid) hay khảm (chimeric) Có nhiều phương pháp gắn các đoạn

DNA vào vector chuyển gen

3.3.1 Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết

Vector chuyển gen là DNA vòng tròn và phân tử DNA của bộ gen khácđược cắt bởi cùng một loại RE, tạo nhiều đoạn DNA thẳng có các đầu cố kết Sau

dính bởi enzyme ligase tạo ra plasmid tái tổ hợp Phương pháp này được sử dụngrộng rãi để lập ngân hàng gen của một sinh vật.

3.3.2 Phương pháp dùng các đoạn nối (linkers)

Các đoạn oligonucleotide (10-20 nucleotide), được tổng hợp sao cho ở giữa

có trình tự palindrom đặc hiệu đối với một RE, để làm các đoạn nối (linkers).Ligase DNA của phage T4 sẽ nối các đoạn DNA đó lại với nhau Phương pháp nàyđược sử dụng để gắn các cDNA và các đoạn DNA có đầu mút tà vào plasmid

3.3.3 Phương pháp dùng enzyme terminal transferase

Phương pháp thứ ba này dựa vào khả năng đặc biệt của enzyme terminal

transferase, có thể gắn cùng một loại nucleitide thành chuỗi (homopolymer) vào đầu

mút 3’OH của mạch DNA

3.4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào

Sau khi tạo DNA tái tổ hợp, việc tiếp theo là biến nạp đưa nó vào lại tế bàochưa mang plasmid Biến nạp được thực hiện với nhiều cách khác nhau

3.4.1 Hóa biến nạp

DNA tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid, có

khả năng dung nạp (competent) Xử lí CaCl2 lạnh, kèm sốc nhiệt (420C trong 2

phút) thì hiệu quả tạo các thể biến nạp (transformants) cao (105-106 thể biếnnạp/1mg của DNA siêu xoắn)

3.4.2 Điện biến nạp

Phương pháp này sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung (pulse) làm tế

bào hấp thụ DNA Hiệu quả biến nạp cao, có thể đến 109-1010 thể biến nạp/1mgDNA Tuy nhiên tỉ lệ tế bào chết đáng kể

3.4.3 Vi tiêm (micro-injection)

Đối với các tế bào động vật có vú, thường là các hợp tử có thể tiêm thẳngDNA tái tổ hợp vào tế bào Đây là phương pháp thông dụng có hiệu quả trong

Bài giảng thi tuyển công chức

chuyển gen ở tế bào động vật có vú, tạo các động vật chuyển gen (transgenic

animals).

3.4.4 Bắn DNA vào tế bào

Sử dụng súng bắn DNA, đạn là các hạt kim loại tungsteng hay vàng mang

DNA hoặc RNA, được bắn với tốc độ nhanh và xuyên thủng vách tế bào để đưaDNA hoặc RNA vào trong Phương pháp này có nhiều ưu thế và được dùng nhiều

trong tạo các thực vật nhiễm gen (transgenic plants).

Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào như:

dùng màng lipid (lipidsome) bao DNA để đưa vào tế bào, các vector virus tự động thực hiện tải nạp (transduction) đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao.

3.5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gen

Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn, chon lọcđúng dòng tế bào như Khi xác nhận DNA tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào vàmang đúng gen cần thiết thì cho chúng sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện chogen biểu hiện

3.5.1 Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

Trong thí nghiệm tạo plasmid tái tổ hợp, các dòng vi khuẩn mọc lên baogồm:

- Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid

- Tế bào nhận được plasmid không có gen lạ vào

- Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp

Việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa Plasmid tái tổ hợp phải mấtnhiều công sức Có 3 hướng chính trong thử nghiệm tách dòng từ thư viện DNA là:lai nucleic acid, phát hiện kiểu hình và phản ứng miễn nhiễm Ngoài ra, có phươngpháp mất hoạt tính do xen đoạn chỉ có thể sử dụng đối với các vector có mang 2

3.5.2 Tạo dòng

Sau khi đã chọn lọc xong, tế bào được sinh sản để tạo dòng và cho gen biểuhiện

3.5.3 Sự biểu hiện của gen được tạo dòng

Muốn gen tạo dòng có biểu hiện ra protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu

tố phiên mã và dịch mã Các vector này gọi là vector biểu hiện

Vector biểu hiện phải đảm bảo các yếu cầu:

- Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào

- Promotor biểu hiện

- Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt

- Sự ổn định lâu dài

- Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào.

Kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải qua nhiều bước phức tạp mới tạo được dòng tếbào như mong muốn và nó giúp giải quyết có hệ thống nhiều vấn đề từ gen đến sựbiểu hiện của chúng thành các phân tử protein

Bài giảng thi tuyển công chức

I Mục tiêu tiết học

Cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản của kĩ thuật PCR (khái niệm,nguyên tắc, thành phần, ứng dụng, )

II Chuẩn bị phương tiện dạy học

Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,

III Các phương pháp dạy học chủ yếu

Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề

IV Nội dung

Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro, không cần đến sự hiện diện

của tế bào và dựa trên nguyên tắc sau

2 Nguyên tắc thực hiện

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từDNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổsung

Quá trình này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại gồm: đun nóng(950C), làm nguội (37-650C) và ủ dài ở 720C Trong dung dịch có các primer (đoạnmồi) P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với một mạch đơn tương ứng Từ 1

mạch kép DNA sau phản ứng sẽ thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chutrình khuếch đại mới theo cấp số nhân.

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ, có mẫu DNA, primer

và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống nung nóng có điều chỉnh theo chu kì nung nóng và làm nguội theo chương tình định sẵn gọi là thermocycler, đây chính làmáy PCR

3 Các cấu phần của phản ứng

Trong các ống plastid nhỏ có các thành phần chủ yếu sau:

3.1 DNA mẫu (DNA template)

Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại Phản ứng PCRtối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt vớiDNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynhhướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao Lượng

Bài giảng thi tuyển công chức

DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra PCR còn cho phép khuyếchđại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủytừng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của ngườichết

3.2 Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phảnứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắtcặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các mồi này

có chiều ngược nhau,bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer) Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu

quả của phản ứng Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắcnhất định:

- Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm)gần như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ

- Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base)

- để quá trình lai xảy ra tốt hơn.Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặctrưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhấtđịnh trên gen

- Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn

định do đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu

- Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt

độ cao Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 liên kếthydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn

Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưngđối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán,tốt nhất khoảng cách giữa hai mồikhi đã bám vào DNA khuôn là150-500 base.

3.3 Enzyme polymerase chịu nhiệt

Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viênQuốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệtsống trong suối nước nóng 80-950C Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triểnmạnh ở nhiệt độ cao, có tên là Thermus aquaticus Hai mươi năm sau, các nhà khoahọc của tập đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấyrằng DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Tagpolymerase) có khả năng giảiquyết vấn đề của enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ DNA polymerase chịu nhiệt sửdụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase

Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đãtách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứngPCR như Vent- polymerase (Tlipolymerase), Pfu- polymerase, rTth,

3.4 Các loại nucleotid

Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạngdeoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phảnứng (200μM/loại nucleotid).M/loại nucleotid)

3.5 Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào,không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế Nói cách khác là không chứabất kỳ một thành phần nào khác

3.6 Dung dịch đệm

Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 200mM Tris-HCl pH8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)

Bài giảng thi tuyển công chức

3.7 Ion Mg 2+

Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và

nó tuỳ thuộc vào từng phản ứng Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 μM/loại nucleotid).M Người tathấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗihơn

4 Giá trị sử dụng

So sánh giữa phương pháp PCR và phương pháp tạo dòng của kĩ thuật tái tổhợp DNA để thấy được ưu thế của kĩ thuật này

Thời gian để khuếch

đại một trình tự DNA

được quan tâm

Chỉ mất 3 giờ Cả tuần hoặc lâu hơn

Bảng 2.1 So sánh giữa phương pháp PCR và phương pháp tạo dòng của kĩ

thuật tái tổ hợp DNA

5 Sự hoàn thiện nhanh và mở rộng ứng dụng của PCR

Từ khi ra đời đến nay, PCR có vai trò cách mạng trong nhiều lĩnh vực nghiêncứu và ứng dụng khác nhau như chẩn đoán nhanh giải kí tự chuỗi bộ gen, gây độtbiến điểm định hướng,

Do dể thực hiện, đơn giản và có nhiều ứng dụng rộng rãi, nên PCR đượchoàn thiện không ngừng Trong một thời gian ngắn, nhiều biến dạng PCR mới rađời

- RT-PCR (reverse transcriptase PCR) là kĩ thuật là RNA có thể được dùnglàm khuôn mẫu cho sự khuếch đại PCR sau khi chuyển đổi thành c-DNA, còn gọiRNA-PCR hay RT-PCR RT-PCR nhạy hơn các phương pháp khác dùng cho sựphân tích RNA.

- PT-PCR cạnh tranh (Competitive RT-PCR) là kĩ thuật thường được dùngtrong định lượng các loại mRNA chuyên biệt

- Real-Time PCR là phương pháp có thể giúp phát hiện những sản phẩm PCRtích luỹ được tại thời điểm thực tế trong quá trình khuếch đại gen Nhờ vậy, giúpđánh giá sự tích luỹ sản phẩm và định hướng qPCR (quantitative PCR – là PCRđịnh lượng)

- PCR-ELISA (enzyme linked immunoassay) là sự kết hợp với miễn dicjk

trong chẩn đoán

Bài giảng thi tuyển công chức

I Mục tiêu tiết học

Cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản về đặc điểm, kĩ thuật, môitrường nuôi cấy và ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật

II Chuẩn bị phương tiện dạy học

Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,

III Các phương pháp dạy học chủ yếu

Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề

IV Nội dung

1 Những khó khăn trong nuôi cấy tế bào động vật có vú

Nuôi cấy tế bào động vật có vú và người khó khăn rất nhiều so với nuôi tếbào vi sinh vật

Xét về gốc độ kinh tế, sự hoàn thiện kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật và chủđộng sử dụng chúng trong công nghiệp là vấn đề không đơn giản

2 Phương pháp xác định các tế bào để nuôi

Mô được tách trong điều kiện vô trùng đem xử lí với enzyme protease,thường là trypsin, để cắt mô tách các tế bào rời nhau ra, dịch tế bào được cấy vàobình thủy tinh hay bình nhựa có đáy phẳng rộng chứa môi trường dinh dưỡng lỏngthích hợp cho sự phát triển của tế bào Các tế bào sau khi trải qua pha lag sẽ bámvào đấy bình chứa và bắt đầu nguyên phân

- Dòng sơ cấp (primary culture) là dòng tế bào nuôi được bắt nguồn trực tiếp

từ mô đã biệt hóa Các dòng nuôi sơ cấp có thể tách khỏi bình bằng xử lí với trypsin

hay EDTA Chúng có thể được dùng để tạo dòng nuôi thứ cấp (secondary cultures)

bằng cách đưa vào môi trường dinh dưỡng với nồng độ cao Các dòng tế bào khôngphải tồn tại vô hạn mà chúng phân chia chỉ một số lần nhất định trước khi tốc độtăng trưởng của chúng giảm và chết Ví dụ, các tế bào người chỉ phân chia 50-100lần trước khi chết

- Lớp đơn (monolayer) là các tế bào phân chia nhanh chóng lấp kín đáy

bình Việc tạo thành lớp đơn là biểu hiện đặc biệt của các tế bào bình thường do

tính kiềm hãm tiếp xúc (contact inhibition).

Ngoài phương pháp thông dụng trên có thể nuôi các mãnh của các cơ quan

cơ thể, các phôi nguyên vẹn, các mô được cắt mãnh hoặc nghiền nhỏ

Để nhân các dòng tế bào sơ cấp là sử dụng các mô của phôi như mô cơ- da,thận, phổi, vì chúng có hoạt tính hấp thu dinh dưỡng mạnh khi tách khỏi cơ thể và

bộ gen của chúng tương đối ổn định trong quá trình nuôi

3 Các dòng tế bào liên tục (continuous cell lines)

Không phải tất cả các tế bào cơ thể động vật đều cho các dòng sơ cấp mà cácthế hệ thứ cấp của chúng đều chết Phần lớn các tế bào chuột đều chết sau khi phânchia 30 – 50 lần, nhưng một số ít tế bào đã biến đổi hình thái, tăng trưởng nhanh