bài giảng thi công chức môn sinh học

bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học bài giảng thi công chức môn sinh học

Bài giảng thi tuyển công chức Tiết 1: CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA KĨ THUẬT DI TRUYỀN I. Mục tiêu tiết học Cung cấp cho sinh viên khái niệm và các thao tác cơ bản của kĩ thuật di truyền (thu nhận gen, tạo vector tái tổ hợp, tạo plasmid, chọn lọc, tạo dòng và biểu hiện ). II. Chuẩn bị phương tiện dạy học Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint, III. Các phương pháp dạy học chủ yếu Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề. IV. Nội dung 1. Khái niệm Kĩ thuật di truyền là các thao tác tác động lên DNA để chuyển một đoạn DNA mang một hoặc một cụm gen từ tế bào của loài cho sang tế bào của loài nhận nhờ thể truyền. Còn có các tên gọi khác như: Kĩ thuật tái tổ hợp DNA, kĩ thuật gen, thao tác gen, tạo dòng phân tử. 2. Sơ đồ khái quát Kĩ thuật di truyền được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp và tinh vi, bao gồm các bước chủ yếu sau: - Bước 1: Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho cung cấp DNA. - Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho. - Bước 3: Cắt cả hai loại DNA bằng cùng một loại enzyme Restriction endonuclesae EcoRI tạo các đầu so le cố kết (cohesive ends). Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức - Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với đoạn DNA tế bào cho (người) để chúng gắn vào nhau bằng bắt cặp bổ sung nhờ đầu so le cố kết. - Bước 5: Thêm enzyme nối ligase tạo liên kết hóa trị thành DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh. - Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp và tế bào nhận ( vi khuẩn E. coli). - Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng vi khuẩn mang gen lạ. Sau khi có dòng sẽ tạo điều kiện để gen biểu hiện tạo ra sản phẩm. Hình 1.1. Phương thức cơ bản để tạo dòng gen Đoàn Thị Tám RE RE RE Cắt DNA ngoại lai và plasmid vector bằng một loại RE giống nhau Plasmid vector DNA được tạo dòng Gắn DNA Plasmid tái tổ hợp Biến nạp Tế bào vi khuẩn Sao chép vi khuẩn Sao chép vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn chứa một lượng lớn tế bào, sinh trưởng qua đêm ở 37 o C sẽ sản xuất khoảng 10 9 tế bào/mL Bài giảng thi tuyển công chức 3. Các kĩ thuật và phương pháp căn bản 3.1. Lai nucleic acid Công nghệ gen sử dụng các kĩ thuật hóa lí thông dụng như: tách chiết và tinh sạch DNA, RNA, xác định số lượng và đánh dấu DNA, điện di trên gel, Sử dụng đặc tính biến chất rồi hồi tính, có thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA với RNA, RNA với RNA. - Lai trên pha rắn: Thấm Southern blot, thấm Northern blot, phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot. - Lai tại chổ (in situ hybridisation): là kiểu lai phân tử, trong trình tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. 3.2. Thu nhận gen 3.2.1. Thư viện DNA từ bộ gen Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của sự phát triển kĩ thuật tái tổ hợp DNA. Toàn bộ DNA của một sinh vật được cắt đoạn nhỏ bằng lắc cơ học hay bởi các RE rồi gắn vào các vector tạo dòng, nên tiếng Anh gọi là phương pháp Shotgun (bắn đạn chài). Hình 1.2. Xây dựng thư viện genomic DNA Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức 3.2.2. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học Năm 1977, K. Itakura và Boyer đã thành công trong tổng hợp nhân tạo gen mã hóa hormone somatostatin (chỉ có 14 amino acid) và biểu hiện trong tế bào E. coli. Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn tổng hợp insulin. Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp. 3.2.3. Lập ngân hàng cDNA Tạo gen từ các mRNA được sử dụng rộng rãi nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Nó có khả năng tổng hợp nên DNA mạch đơn – cDNA từ khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học. Sử dụng ngân hàng cDNA các các ưu thế sau: - Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen. - Những tế bào chuyên hóa tạo một số lớn protein một loại và mRNA tương ứng của protein giàu có đó sẽ dể tách ra để tạo ngân hàng cDNA. Nhờ vậy giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen. 3.3. Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là gắn các đoạn DNA hay các cDNA vào vector chuyển gen để tạo nên plasmid có mang gen lạ - plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid) hay khảm (chimeric). Có nhiều phương pháp gắn các đoạn DNA vào vector chuyển gen. 3.3.1. Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết Vector chuyển gen là DNA vòng tròn và phân tử DNA của bộ gen khác được cắt bởi cùng một loại RE, tạo nhiều đoạn DNA thẳng có các đầu cố kết. Sau đó trộn lẫn, các đầu cố kết của 2 loại DNA bổ sung sẽ bắt cặp với nhau và được hàn Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức dính bởi enzyme ligase tạo ra plasmid tái tổ hợp. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để lập ngân hàng gen của một sinh vật. 3.3.2. Phương pháp dùng các đoạn nối (linkers) Các đoạn oligonucleotide (10-20 nucleotide), được tổng hợp sao cho ở giữa có trình tự palindrom đặc hiệu đối với một RE, để làm các đoạn nối (linkers). Ligase DNA của phage T4 sẽ nối các đoạn DNA đó lại với nhau. Phương pháp này được sử dụng để gắn các cDNA và các đoạn DNA có đầu mút tà vào plasmid. 3.3.3. Phương pháp dùng enzyme terminal transferase Phương pháp thứ ba này dựa vào khả năng đặc biệt của enzyme terminal transferase, có thể gắn cùng một loại nucleitide thành chuỗi (homopolymer) vào đầu mút 3’OH của mạch DNA. 3.4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào Sau khi tạo DNA tái tổ hợp, việc tiếp theo là biến nạp đưa nó vào lại tế bào chưa mang plasmid. Biến nạp được thực hiện với nhiều cách khác nhau. 3.4.1. Hóa biến nạp DNA tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid, có khả năng dung nạp (competent). Xử lí CaCl 2 lạnh, kèm sốc nhiệt (42 0 C trong 2 phút) thì hiệu quả tạo các thể biến nạp (transformants) cao (10 5 -10 6 thể biến nạp/1mg của DNA siêu xoắn). 3.4.2. Điện biến nạp Phương pháp này sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung (pulse) làm tế bào hấp thụ DNA. Hiệu quả biến nạp cao, có thể đến 10 9 -10 10 thể biến nạp/1mg DNA. Tuy nhiên tỉ lệ tế bào chết đáng kể. 3.4.3. Vi tiêm (micro-injection) Đối với các tế bào động vật có vú, thường là các hợp tử có thể tiêm thẳng DNA tái tổ hợp vào tế bào. Đây là phương pháp thông dụng có hiệu quả trong Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức chuyển gen ở tế bào động vật có vú, tạo các động vật chuyển gen (transgenic animals). 3.4.4. Bắn DNA vào tế bào Sử dụng súng bắn DNA, đạn là các hạt kim loại tungsteng hay vàng mang DNA hoặc RNA, được bắn với tốc độ nhanh và xuyên thủng vách tế bào để đưa DNA hoặc RNA vào trong. Phương pháp này có nhiều ưu thế và được dùng nhiều trong tạo các thực vật nhiễm gen (transgenic plants). Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào như: dùng màng lipid (lipidsome) bao DNA để đưa vào tế bào, các vector virus tự động thực hiện tải nạp (transduction) đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao. 3.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gen Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn, chon lọc đúng dòng tế bào như . Khi xác nhận DNA tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và mang đúng gen cần thiết thì cho chúng sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho gen biểu hiện. 3.5.1. Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp Trong thí nghiệm tạo plasmid tái tổ hợp, các dòng vi khuẩn mọc lên bao gồm: - Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid. - Tế bào nhận được plasmid không có gen lạ vào. - Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp. Việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa Plasmid tái tổ hợp phải mất nhiều công sức. Có 3 hướng chính trong thử nghiệm tách dòng từ thư viện DNA là: lai nucleic acid, phát hiện kiểu hình và phản ứng miễn nhiễm. Ngoài ra, có phương pháp mất hoạt tính do xen đoạn chỉ có thể sử dụng đối với các vector có mang 2 hoặc nhiều hơn các gen kháng thuốc. Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức 3.5.2. Tạo dòng Sau khi đã chọn lọc xong, tế bào được sinh sản để tạo dòng và cho gen biểu hiện. 3.5.3. Sự biểu hiện của gen được tạo dòng Muốn gen tạo dòng có biểu hiện ra protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã. Các vector này gọi là vector biểu hiện Vector biểu hiện phải đảm bảo các yếu cầu: - Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào. - Promotor biểu hiện. - Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt. - Sự ổn định lâu dài. - Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào. Kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải qua nhiều bước phức tạp mới tạo được dòng tế bào như mong muốn và nó giúp giải quyết có hệ thống nhiều vấn đề từ gen đến sự biểu hiện của chúng thành các phân tử protein. Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức Tiết 2: KỸ THUẬT PCR I. Mục tiêu tiết học Cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản của kĩ thuật PCR (khái niệm, nguyên tắc, thành phần, ứng dụng, ). II. Chuẩn bị phương tiện dạy học Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint, III. Các phương pháp dạy học chủ yếu Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề. IV. Nội dung 1. Khái niệm PCR (polymerase chain reaction) là kĩ thuật khuếch một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Được Kary Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro, không cần đến sự hiện diện của tế bào và dựa trên nguyên tắc sau. 2. Nguyên tắc thực hiện Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Quá trình này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại gồm: đun nóng (95 0 C), làm nguội (37-65 0 C) và ủ dài ở 72 0 C. Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi) P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với một mạch đơn tương ứng. Từ 1 Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức mạch kép DNA sau phản ứng sẽ thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuếch đại mới theo cấp số nhân. Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ, có mẫu DNA, primer và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống nung nóng có điều chỉnh theo chu kì nung nóng và làm nguội theo chương tình định sẵn gọi là thermocycler, đây chính là máy PCR. 3. Các cấu phần của phản ứng Trong các ống plastid nhỏ có các thành phần chủ yếu sau: 3.1. DNA mẫu (DNA template) Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao. Lượng Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho phép khuyếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của người chết 3.2. Mồi (primer) Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau,bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer). Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: - Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ. - Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) - để quá trình lai xảy ra tốt hơn.Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen. - Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định do đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu. - Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 liên kết hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn. Đoàn Thị Tám [...]... thế cho tế bào bệnh Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức Tiết 4 NHÂN BẢN VÔ TÍNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I Mục tiêu tiết học Cung cấp cho sinh viên khái niệm, kỹ thuật, ứng dụng của nhân bản vô tính tế bào động vật II Chuẩn bị phương tiện dạy học Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint, III Các phương pháp dạy học chủ yếu Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề, Tổ chức học tập theo nhóm IV Nội dung 1... tồn nguồn gen và những động vật quý hiếm Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức Tiết 5 TẾ BÀO GỐC I Mục tiêu tiết học Cung cấp cho sinh viên khái niệm cơ bản và các ứng dụng của tế bào gốc II Chuẩn bị phương tiện dạy học Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint, III Các phương pháp dạy học chủ yếu Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề, tổ chức học tập theo nhóm IV Nội dung 1 Tế bào gốc (stem cell)... dicjk trong chẩn đoán Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức Tiết 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I Mục tiêu tiết học Cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản về đặc điểm, kĩ thuật, môi trường nuôi cấy và ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật II Chuẩn bị phương tiện dạy học Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint, III Các phương pháp dạy học chủ yếu Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề IV Nội dung... 6 tuổi, như vậy khi được sinh ra, bộ gen của cừu Dolly đã không đặt lại đồng hồ sinh học về 0 mà vẫn ghi nhớ tuổi của nó trước đây Như vậy về gen, cừu Dolly là một chú cừu 6 tuổi được sinh ra Hiện tại nhân bản vô tính đang phải đối mặt với vấn đề lão hóa Trong khi đó nhân bản từ phôi không gặp phải vấn đề này Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức 4 Các ứng dụng Thành công của tạo dòng vô tính.. .Bài giảng thi tuyển công chức Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán,tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi khi đã bám vào DNA khuôn là150-500 base 3.3 Enzyme polymerase chịu nhiệt Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật... Tám Bài giảng thi tuyển công chức Nguồn lấy tế bào mầm phôi và tế bào gốc thai là thai động vật hoặc thai thai nhi nạo bỏ Với thai người nạo bỏ, thường chỉ lấy ở thai nhi dưới 6 tuần tuổi (thai sớm, mức độ biệt hóa chưa cao) Tổ chức mầm sinh dục thai là nơi lấy tế bào mầm phôi, các tổ chức khác của thai (não, gan) là nơi lấy tế bào gốc thai 3.3 Nguồn lấy tế bào gốc trưởng thành: Thường lấy từ các tổ chức. .. (không có kích thích Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức nào khác) 5-6 giờ để cho phép chấp nhận nhận mới và có thời gian tái lập trình nhân tế bào Hoạt hóa tế bào phân chia phát Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển triển thành phôi bằng shock điện thành phôi bằng ủ trong môi trường hóa học có chứa cytochalasin B Tỷ lệ nhân bản thành công cừu Tỷ lệ nhân bản thành công trên Dolly thấp (1 trong số... huyết thanh bò con Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức - Duy trì nồng độ CO2 (5%) ở một áp suất hợp lí - Thêm chất kháng vi khuẩn và nấm 4.5 Thi t bị nuôi: - Ở quy mô nhỏ dùng bình Roux và bình trụ - Quy mô công nghiệp dùng bi trong bioreactor, bioreactor túi plastic dùng nuôi tế bào côn trùng 5 Quy trình khái quát và cách xử lí thu các loại sản phẩm Quá trình sản xuất công nghiệp gồm: Dòng sơ cấp→Nhân... ứng chính xác đặc hiệu miễn dịch của từng các thể Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức - Dể dàng tạo kháng thể đơn dòng - Dể dàng nhân bản vô tính - Kĩ thuật thay thế và ghép mô hay cơ qua ở người sẽ thực hiện dể dàng hơn Có thể nói, sự kết hợp kĩ thuật tế bào gốc với các lĩnh vực khác sẽ tạo nhiều bước đột phá trong công nghệ sinh học động vật 6 Một số ứng dụng điển hình - Ghép các tế bào gốc... tinh trong ống nghiệm 1968 - Edwards và Bavister thụ tinh trứng người trên in vitro 1979 - Karl Illmensee công bố nhân bản được ba con chuột từ một phôi ban đầu 1984 - Steen Willadsen nhân bản thành công cừu từ các tế bào phôi bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào phôi Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức 1986 - Steen Willadsen nhân bản một con bò từ các tế bào phôi một tuần tuổi đã biệt hóa 1993 - Bò . Bài giảng thi tuyển công chức Tiết 1: CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA KĨ THUẬT DI TRUYỀN I. Mục tiêu tiết học Cung cấp cho sinh viên khái niệm và các thao tác cơ bản. lượng lớn tế bào, sinh trưởng qua đêm ở 37 o C sẽ sản xuất khoảng 10 9 tế bào/mL Bài giảng thi tuyển công chức 3. Các kĩ thuật và phương pháp căn bản 3.1. Lai nucleic acid Công nghệ gen sử dụng. dựng thư viện genomic DNA Đoàn Thị Tám Bài giảng thi tuyển công chức 3.2.2. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học Năm 1977, K. Itakura và Boyer đã thành công trong tổng hợp nhân tạo gen mã hóa