Các quá trình lên men II pot

Con đường Embden-Meyerhof EM : Bước chuyển hóa chung cho các quá trình lên men Lên men là một quá trình oxi hóa-khử cân bằng nội sinh, trong đó một số nguyên tử của nguồn năng lượng c

Chương 8

Các quá trình lên men

I Con đường Embden-Meyerhof (EM) : Bước chuyển hóa

chung cho các quá trình lên men

Lên men là một quá trình oxi hóa-khử cân bằng nội sinh, trong đó

một số nguyên tử của nguồn năng lượng (chất cho điện tử) trở nên có tính khử hơn, trong khi một số nguyên tử khác trở nên oxi hóa hơn, còn năng

lượng thì được sinh ra nhờ sự phosphorin hóa cơ chất Con đường trao đồi

chất chung đối với sự lên men glucose là con đường đường phân, cũng còn được gọi là con đường Embden-Meyerhof Đường phân được chia thành ba bước chính, mỗi bước gồm một số phản ứng riêng biệt do enzyme xúc tác Bước một gồm các phản ứng chuẩn bị, không có các phản ứng oxi hóa và cũng không giải phóng năng lượng, song lại dẫn đến việc tạo ra hai phân tử trung gian quan trọng, glixeraldehit-3-phosphate (GAP) Trong bước hai, sự oxi hóa-khử xảy ra, năng lượng được dự trữ dưới dạng ATP và hai phân tử piruvat được tạo thành Trong bước ba, một phản ứng oxi hóa-khử thứ hai xảy ra và các sản phẩm lên men (chẳng hạn ethanol và

CO2, hoặc acid lactic), sẽ được tạo thành Trong sự tạo thành hai phân tử acid 1,3 điphosphoglixeric có hai phân tử NAD+ bị khử thành NADH Tuy nhiên, một tế bào chỉ chứa một lượng nhỏ NAD+, và nếu như toàn bộ NAD+ bị chuyển thành NADH thì phản ứng oxi hóa glucose sẽ bị đình chỉ; sự oxi hóa tiếp tục chỉ có thể xảy ra khi một phân tử NAD+ có mặt để tiếp nhận các điện tử vừa được giải phóng ra Sự "tắc đường" này có thể được khắc phục trong lên men bằng cách oxi hóa NADH trở lại thành NAD+ nhờ các phản ứng khử piruvat thành một trong hàng loạt các sản phẳm lên men khác nhau Trong trường hợp của nấm men, piruvat bị khử thành ethanol với sự giải phóng CO2 ở các vi khuẩn lactic, piruvat bị khử thành acid lactic

Nhiều con đường khử piruvat cũng gặp ở các vi sinh vật nhân sơ khác, song kết quả thật sự đều giống nhau, tức là NADH phải được hồi phục lại thành dạng oxi hóa, NAD+, để cho các phản ứng thu nhận năng lượng của lên men có thể tiếp tục Là một coenzyme dễ khuếch tán, NADH có thể tách khỏi GAP-dedihydrogenase, gắn vào một enzyme khác, (chẳng hạn lactat-dedihydrogenase, enzyme khử piruvat thành acid lactic), rồi lại lập tức khuếch tán trở lại sau khi NADH đã được oxi hóa thành NAD+ để lặp lại chu trình một lần nữa

Trong bất kỳ một phản ứng thu năng lượng nào, sự oxi hóa bao giờ cũng phải được cân bằng với sự khử và phải có một chất nhận nào đó đứng chờ sẵn để nhận một điện tử vừa được tách ra Trong trường hợp này, sự khử NAD+ tại một bước trong con đường đường phân sẽ được cân bằng bởi sự oxi hóa nó tại một bước khác (Các) sản phẫm cuối cùng cũng phải nằm trong trạng thái cân bằng oxi hóa-khử với cơ chất ban đầu, tức là glucose

Bảng 6.1: Các quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật

Zymomonas

Lên men lactic

Một số Lactobacillus

Lên men lactic dị

CO 2 + H+

Leuconostoc Một số Lactobacillus

Acid propionic Lactat → Propionat + Acetate

+ CO2

Propionibacterium Clostridium propionicum

2,3-Butandiol + Xucxinat + Lactat + Acetate + Focmat + H2 +

CO2

Các vi khuẩn đường ruột

Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter

Caproat + Butirat + H2

Clostridium kluyveri

4 H2+ 2 CO2 + H + → Acetate + 2 H2O

Clostridium aceticum Acetobacterium

HCO −3

Methanothrix Methanosarcina

II Tính đa dạng của lên men

Bảng 6.1 trình bày một số kiểu lên men chính được phân loại dựa trên các sản phẩm được tạo thành Đó là các quá trình lên men rượu, acid lactic, acid propionic, acid hỗn hợp, acid butiric và acid homoacetic Có

nhiều quá trình lên men được phân loại dựa trên cơ chất được lên men

thay vì các sản phẩm Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kị khí tạo thành bào tử

(chi Clostridium) lên men các amino acidvới sự sản sinh acetate, amoniac

và H2 Các loài Clostridium khác, như C acidiurici và C purinolyticum

lên men các purin như xantin hoặc ađenin với sự tạo thành acetate, focmat,

CO2, và amoniac Còn những bọn kị khí khác thì lên men các hợp chất

thơm Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm

phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C6H6O3) theo con đường sau :

Phloroglucinol (C6H6O3) +3 H2O → 3 acetate- + 3H+, ΔGo' = -142,5 kJ/phản ứng

Nhiều quá trình lên men không thông thường chỉ được thực hiện bởi một nhóm rất hạn chế các vi khuẩn kị khí, và trong một sồ trường hợp chỉ bởi một vi khuẩn duy nhất Một số ví dụ được nêu trên bảng 6.2 Nhiều trong số các vi khuẩn này có thể được xem như các chuyên gia về trao đổi chất vì chúng có khả năng phân giải một hoặc nhiều cơ chất mà các vi khuẩn khác không phân giải được

Bảng 6 2: Một số quá trình lên men không thông thường

III Lên men không có sự phosphorin hóa cơ chất

Với một số cơ chất, năng lượng sinh ra không đủ để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên các hợp chất này vẫn trợ giúp sinh trưởng lên men của một cơ thể nào đó Trong những trường hợp này sự phân giải cơ chất được gắn liền với những bơm ion được dùng để tạo nên một građien proton hoặc natri qua màng Ví dụ

về kiểu này có các quá trình lên men của Propionigenium modestum hoặc Oxalobacter formigenes, cả hai đều gắn sự lên men các acid đicacboxilic với các bơm ion sinh năng lượng liên kết với màng Propionigenium modestum thực hiện phản ứng sau đây :

Xucxinat2- + H2O → Propionat- + HCO3- , ΔGo' = -20,5 kJ/phản ứng Phương trình tổng thể này thu không đủ năng lượng tự do để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên

nó lại được dùng làm phản ứng thu năng lượng duy nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn Sở dĩ như vậy là vì sự loại CO2 khỏi xucxinat

Hình 6.1: Lên men liên kết với bơm ion ở vi khuẩn

(năng lượng thu được không qua phosphorin hóa cơ chất)

(qua metilmalonil-CoA và đecacboxilase liên kết với màng bởi

Propionigenium modestum đã được ghép đôi với sự xuất Na+ qua màng tế bào chất Một ATPse chuyển vị Na+ nằm trên màng của P modestum sử

dụng građien này để hoạt hóa sự tổng hợp ATP

Oxalobacter formigenes thực hiện sự lên men oxalat :

Oxalat2- + H2O → Focmat- + HCO3- , ΔGo' = -26,7 kJ/phản ứng

ở pH trung tính, oxalat tồn tại dưới dạng ion hóa oxalat-, và sự loại cacboxil thành focmat- tiêu thụ một proton Sau đó sự xuất focmat- khỏi tế bào sẽ tạo nên một động lực nhờ proton (proton motive force = PMF) có khả năng ghép đôi với sự tổng hợp ATP nhờ một ATPase chuyển vị proton nằm trên màng

Điều thú vị và độc đáo trong trao đỗi chất của cả Propionigenium modestum lẫn Oxalobacter formigenes nằm ở chỗ sự tổng hợp ATP xảy ra

không cần cả phosphoril hóa cơ chất lẫn chuỗi vận chuyển điện tử; tuy nhiên, sự tạo thành ATP theo cơ chế hóa thẩm vẫn xảy ra dựa vào một bơm Na+/H+ kết hợp với sự loại CO2 khỏi các acid hữu cơ Điều cần rút ra

từ những sự lên men này là : các phản ứng, dù chỉ thu được dưới 31,8 kJ, con số cần thiết để tạo thành một ATP, hoặc không có khả năng ghép đôi với sự phosphorin hóa cơ chất, cũng không thể lập tức bị coi là không có khả năng trợ giúp sinh trưởng cho một vi khuẩn Nếu như phản ứng có thể ghép đôi được với một građien ion thì sự sản sinh ATP vẫn có khả năng xảy ra và do vậy vẫn có sinh trưởng (Hình 6.1)

IV Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy)

Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng,

một hiện tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một chất nào đó - và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức

không cơ thể nào trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được

Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có liên quan tới khí dihydro (H2) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được tiêu thụ bởi đối tác kia

Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển

H 2 liên loài Kẻ tiêu thụ H2 có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi khuẩn khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane Hãy xem xét trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol thành acetate và sự sản sinh methane sau đó Như có thể thấy trên hình 2, bọn lên men ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng lượng tự do (ΔGo' dương) Tuy nhiên, H2 được sinh ra bởi đối tác lên men rượu lại là một chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành methane do một vi khuẩn sinh methane thực hiện Và khi cộng hai phản ứng lại thì phản ứng tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ giúp sinh trưởng của cả hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng

Lên men ethanol

2CH3CH2OH + 2H2O → 4H2 + 2CH3COO- +2H+ +19,4 kJ /phản ứng Sinh methane

4H2+ CO2 → CH4 + 2H2O - 130,7 kJ/phản ứng Phản ứng cộng dưỡng

2CH3CH2OH + CO2 → CH4 + 2CH3COO- - 111,3 kJ/phản ứng

Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat thành acetate cộng với H2 bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo

Syntrophomonas:

Butirat- + 2H2O → 2acetate- + H+ + 2H2 , ΔGo' = +48,2 kJ/phản ứng

Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi

và trong ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên

butirat Song nếu H2 vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi

một cơ thể đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas

lại sinh trưởng rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H2

V Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn

Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở

vi sinh vật Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới các điều kiện kị khí Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc

biệt là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae Giống như đa số

nấm, nấm men là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt không khí chúng sẽ lên men hiđrat cacbon thành ethanol và CO2 Nhiều vi khuẩn kị khí và hiếu khí cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ khi lên men các hexose hoặc pentose

1 Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men

Sự lên men glucose thành ethanol và CO2 nhờ Saccharomyces cerevisiae diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof Sự chuyển hóa

piruvat thành ethanol gồm hai bước Trong bước một, piruvat được loại

CO2 thành acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của

tiaminpirophosphate Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol nhờ alcohol-đedihydrogenase chứa NADH

2CO 2

2 Piruvat

2 Acetaldehyt Glucose

2Ethanol

Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ được cân bằng

CH3-CHO + NaHSO3 → CH3- CHOH -SO3Na

Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng thời hiệu suất ethanol và CO2 sẽ giảm xuống

Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất glycerin Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt giữ, và do vậy không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa Lúc này, thay cho acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng làm chất nhận điện tử và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị loại phosphate để trở thành glycerin Phương trình phản ứng diễn ra như sau :

Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO2

Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men

Neuberg 2

Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO3, Na2HPO4) thì glycerin cũng được tạo thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản ứng hóa hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một

chất nhận điện tử Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3

và được viết như sau :

Glucose + 2H2O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO2

Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1

3 Hiệu ứng Pasteur

Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường

phân) bởi oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí) Sự chuyển sang hô hấp không những làm giảm sự tạo thành ethanol và CO2 mà còn làm giảm sự hấp thụ đường Có hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này

Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá trình phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất Sự loại dihydro xảy ra trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và phosphate vô cơ (Pvc) :

Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + Pvc → 3-phosphoglicerate + NADH + ATP

Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc vào sự có mặt của ADP và phosphate Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí,

sự phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để phát sinh ATP Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và hậu quả là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ giảm Khi dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa chuỗi hô hấp, ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong điều kiện thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng

Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế điều hoà bằng enzyme dị lập thể Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa chủ chốt trong hiệu ứng này Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu chỉ tạo thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose Để duy trì sự cung cấp năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose Tỉ lệ của ATP/AMP trong trường hợp này rất thấp Trái lại, khi oxi xâm nhập vào môi trường, ATP được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp

Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm

men lên men rượu là phosphofructokinase Đó là enzyme không thuận

nghịch đầu tiên của con đường EM Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa fructose-6-phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm hãm dị lập thể bởi ATP Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm tăng nồng độ glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của phản ứng enzyme trước đó Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể hexokinase, kìm hãm cả sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ đường này

Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại hoạt hóa nó Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích thích sự hấp thu và sự trao đổi glucose

Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat Nhờ

chất hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được tăng cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này

Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người

ta đo nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate,

fructose-6-phosphate, fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau

khi chuyển từ điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí Ngay sau khi được thông khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế bào tăng nhanh, còn nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose-

phosphate lại giảm mạnh ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như

một cái van được điều chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi trung gian khác Nếu van bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ

bị ứ đọng, còn các chất nằm bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do vậy, nồng độ giảm đi

Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E coli) và ở

mô động vật Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt

về loại chất hiệu ứng Chẳng hạn, ở E coli, không phải AMP mà ADP

mới là chất hiệu ứng dương Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất giống nhau, còn các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và đặc hiệu chủng

4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men

Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển Các loài được quan tâm trước hết

trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và Kluyveromyces

sp Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men này đã được tạo

ra nhờ kỹ thuật di truyền

Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên men Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị

cơ chất được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả năng sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính chịu pH thấp

Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài Nói chung, các cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu quả ở các giá trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35oC Hiện nay người

ta quan tâm nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm men nhờ việc sử dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc các hợp chất làm biến tính protein Các biến chủng này chứa ADN ti thể

đã bị biến đổi theo hướng ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự trao đổi chất hiếu khí và do vậy thích hợp với sự tổng hợp rượu

5 Hiệu suất lên men

Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol trước hết bằng con đường Embden-Meyerhof Phản ứng thật sứ bao gồm

sự tạo thành 2 mol ethanol, 2 mol CO2 và 2 mol ATP trên mỗi mol glucose được lên men Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên men thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết Sở dĩ như vậy là vì một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới 4-5% cơ chất tổng số Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng ethanol có thể tăng thêm được 2,7%

Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men

vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và các lipit Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05-0,1 mm Hg tính theo áp suất oxi Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó đều sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol (hiệu ứng Pasteur)

Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự tổng hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men Chúng bao gồm C, O, N, và H Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng

để tổng hợp các thành phần thứ yếu Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các vitamin) được yêu cấu dưới dạng vết

Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ đường mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men Trong một số trường hợp, người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung như các muối amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền