Thực nghiệm khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam

Trang 1

4 THỰC NGHIỆM

4.1 Điều kiện thực nghiệm

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây giảo cổ lam được thực hiện với các điều kiện sau:

Nguyên liệu: Mẫu cây giảo cổ lam khô thu hái ở vùng núi Phanxipang

(thuộc dãy núi Hoàng Liên Sơn) vào tháng 9 năm 2006 do công ty TNHH Tuệ Linh

(Cầu Giấy, Hà Nội) cung cấp Mẫu cây khô được xay thành bột mịn

Sắc ký cột:

- Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60)

- Silica gel pha đảo (RP C-18 silica gel, Merck)

Sắc ký lớp mỏng:

- Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60 F254, 250 µm)

- Silica gel pha đảo RP18 (Merck, RP C-18 F254)

Thuốc thử:

- Dung dịch acid sulfuric đậm đặc

Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

- Máy Bruker Avance 500 [500 MHz (1H) và 125 MHz (13C)]

Máy ghi phổ khối lượng:

- Bruker Micro OTOF-QII

Đèn UV dùng cho SKBM: Máy Spectroline MODEL ENF-240C/FE (USA)

hai bước sóng 254 nm và 365 nm

Dung môi sử dụng:

- Metanol chưng cất thu ở nhiệt độ 64oC

- Eter dầu hỏa chưng cất thu ở phân đoạn 60-90oC

- Cloroform chưng cất thu ở nhiệt độ 61-62oC

- n-Butanol chung cất thu ở nhiệt độ 118oC

Trang 2

4.2 Trích ly cao thô

Bột cây giảo cổ lam (2kg) được trích nóng với metanol bằng phương pháp đun hoàn lưu Toàn bộ dịch trích thu được đem cô quay áp suất kém, thu được cao metanol thô (270g)

Hòa tan cao metanol thô trong nước và lần lượt chiết với các dung môi eter

dầu hỏa, cloroform, n-butanol Sau khi thu hồi dung môi, thu được các loại cao

tương ứng: cao eter dầu, cao cloroform, cao butanol và dịch nước còn lại sau khi

chiết Quá trình trích ly các loại cao được trình bày trong Sơ đồ 1

Trang 3

4.3 Quá trình cô lập

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao butanol được trích từ phần trên mặt đất của cây giảo cổ lam

Sắc ký cột hấp phụ cao butanol (95g) trên silica gel pha thường với hệ dung

ly cloroform:metanol (9:1) rồi hệ dung ly cloroform:metanol:nước có độ phân cực tăng dần (9:1:0.1 → 8:2:0.2 → 20:6:1 → 14:6:1 → 10:5:1 → 6:4:1 → 100% metanol) Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric đặc

nóng, chúng tôi thu được chín phân đoạn (B1 → B9) Sau đó tiếp tục khảo sát các

phân đoạn B2, B4, B6, B8 Quá trình xử lý cao n-butanol được trình bày trong Sơ

đồ 2

Trang 4

4.3.1 Khảo sát phân đoạn B2

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn B2 (2.1g) với hệ dung ly

cloroform:metanol (9:1 → 8:2) rồi cloroform:metanol:nước có độ phân cực tăng dần (20:6:1 → 14:6:1 → 100% metanol), dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch acid sulfuricđặc nóng thu được tám phân đoạn (B2.1 → B2.8) Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn B2.7 (250mg) nhiều lần với hệ dung ly cloroform:metanol:nước, thu được kết tủa kết tủa vô định hình, ký hiệu là BM2

(15mg) Quá trình cô lập hợp chất BM2 được trình bày trong Sơ đồ 3

Sơ đồ 3: Quá trình cô lập hợp chất BM2

Phân đoạn B2

(2.1g)

Phân đoạn B2.7

(250mg)

B2.7.9

BM2

(15mg)

Sắc ký cột trên silica gel

* cloroform:metanol (9:1 8:2)

* cloroform:metanol:nước (20:6:1 14:6:1)

* metanol 100%

Thu được tám phân đoạn (B2.1 B2.8)

* metanol 100%

Thu được 12 phân đoạn (B2.7.1 B2.7.12)

Trang 5

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn B4 (3g) với hệ dung ly

cloroform:metanol:nước có độ phân cực tăng dần (cloroform:metanol:nước 9:1:0 →

20:6:1 → 14:6:1 → 6:4:1 → 100% metanol), dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch acid sulfuricđặc nóng thu được bốn phân đoạn (B4.1→B4.4) Sắc

ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn B4.3 (1.2 g) nhiều lần với hệ dung

ly cloroform:metanol:nước, thu được kết tủa kết tủa vô định hình, màu vàng, ký

hiệu là BM1 (50 mg) Quá trình cô lập hợp chất BM1 được trình bày trong Sơ đồ 4

Trang 6

20:6:1 → 14:6:1 → 6:4:1 → 100% metanol), dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch acid sulfuricđặc nóng thu được 12 phân đoạn (B6.1→B6.12) Sắc

ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn B6.11 (110mg) với hệ dung ly

metanol:nước (1:3 → 1:2 → 1:1 → 2:1 → 3:1), thu được sáu phân đoạn (B6.11.1

→ B6.11.6) Tiếp tục sắc ký cột hấp phụ nhiều lần trên silica gel pha đảo phân đoạn B6.11.4 (30mg) thu được kết tủa vô định hình màu vàng ký hiệu là BM3 (11mg)

Sắc ký cột hấp phụ nhiều lần trên silica gel pha đảo phân đoạn B6.11.5 (25mg) thu được kết tủa vô định hình không màu ký hiệu là BM6 (13mg) Quá trình cô lập hợp

chất BM3 và BM6 được trình bày trong Sơ đồ 5

Sơ đồ 5: Quá trình cô lập hợp chất BM3 và BM6

Phân đoạn B6.11

(110mg)

B6.11.5

(25mg)

Sắc ký cột trên RP-18

* metanol:nước (1:3 1:2 1:1 2:1 3:1) Thu được sáu phân đoạn (B6.11.1 B6.11.6)

B6.11.4

(30mg)

(2.5g)

Thu được 12 phân đoạn (B6.1 B6.12)

BM6 (13mg)

BM3 (11mg)

Sắc ký cột nhiều lần trên RP-18

* metanol:nước (1:2 1:1 2:1 3:1)

Trang 7

20:6:1 → 14:6:1 → 6:4:1 → 100% metanol), dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch acid sulfuricđặc nóng thu được 11 phân đoạn (B8.1→B8.11)

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn B8.6 (400mg)

với hệ dung ly metanol:nước (1:2→1:1→2:1→3:1), thu được bốn phân đoạn

(B8.6.1→B8.6.4) Sắc ký cột hấp phụ nhiều lần trên silica gel pha đảo phân đoạn B8.6.4 (70mg) thu được kết tủa vô định hình không màu ký hiệu là BM4 (30mg)

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn B8.9 (480mg)

với hệ dung ly metanol:nước (1:3→1:2→1:1→2:1), thu được tám phân đoạn

(B8.9.1→B8.9.8) Sắc ký cột hấp phụ nhiều lần trên silica gel pha đảo phân đoạn B8.9.6 (60mg) thu được kết tủa vô định hình không màu ký hiệu là BM5 (12mg)

Quá trình cô lập hợp chất BM4 và BM5 được trình bày trong Sơ đồ 6

Trang 8

Sơ đồ 6: Quá trình cô lập hợp chất BM4 và BM5

B8.9.6

(60mg)

* metanol:nước (1:3 1:2 1:1 2:1) Thu được tám phân đoạn

(B8.9.1 B8.9.8)

B8.6.4

(70mg)

(2.5g)

Thu được 11 phân đoạn (B8.1 B8.11)

BM5 (12mg)

BM4

(30mg)

Sắc ký cột nhiều lần trên RP-18

* metanol:nước (1:2 1:1 2:1 3:1)

B8.6

(400mg)

B8.9

(480mg)

* metanol:nước (1:2 1:1 2:1 3:1)

Thu được 4 phân đoạn (B8.6.1 B8.6.4)

Trang 9

4.4 Thử nghiệm độc tính tế bào bằng phương pháp SRB

4.4.1 Nguyên tắc

Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau

đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay

số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

4.4.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB

- Giải đông tế bào ung thư bảo quản trong nitrogen lỏng, nuôi cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4)

- Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70 – 80 %

- Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào/giếng ban đầu là 104 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa) và 7.5×103 tế bào/giếng (đối với dòng NCI-H460)

- Ủ ở 37 oC, 5 % CO2 trong 24 giờ

- Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử (không loại bỏ môi trường cũ đã có sẵn trong giếng)

- Ủ ở 37 oC, 5 % CO2 trong 48 giờ

- Cố định tế bào trong giếng với acid tricloroacetic (TCA) :

- Nhuộm SRB:

+ Cho dung dịch SRB 0,2 % vào mỗi giếng

+ Ủ ở nhiệt độ phòng, 5-20 phút

+ Loại bỏ dung dịch SRB

Trang 10

+ Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ

- Đọc kết quả

+ Cho 200 µl Tris-base 10 mM vào mỗi giếng

+ Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hoàn toàn

+ Đo mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm

Thiết kế khảo sát, gồm:

- 1 mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0.01 µg/mL

- 1 mẫu chứng âm: tế bào với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0.25

%)

- Thiết kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm:

+ 2 giếng tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát

+ 2 giếng không có tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (2 giếng blank)

Xử lý kết quả

Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620):

- Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb− ODblank (1)

- Tính giá trị OD = OD492− OD620 (2)

- Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức:

% 100 ) OD

OD 1 ( I

%

C

TN ×

−

= Với:

- ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào

- ODblank: giá trị OD của giếng blank

- ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)

- ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tình từ công thức (1) và (2)

Định dạng
Số trang	10
Dung lượng	163,13 KB