Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây gòn, họ gạo

Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây gòn, họ gạo

2.1 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

2.1.1 Thu hái và xử lý nguyên liệu

Lá gòn tươi sau khi thu hái tại xã An Bình – huyện Dĩ An – tỉnh Bình Dương (tháng 1/2008) và vỏ gòn tươi sau khi thu hái cùng địa điểm (tháng 5/2008), được định danh bởi dược sĩ Phan Đức Bình – phó tổng biên tập Bán nguyệt san “Thuốc

và Sức khỏe” Các bộ phận này được đem sấy khô ở nhiệt độ 60oC, xay nhuyễn

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định như sau:

2.1.2 Điều chế các loại cao từ lá gòn

Ngâm bột lá khô (1kg) nhiều lần với etanol 96o, lọc loại bỏ bã, đuổi dung môi, thu được 101,2g cao thô Cao thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi khác nhau, đuổi dung môi, thu được 51,8g cao eter dầu hỏa, 5,7g cao cloroform, 13,1g cao etyl acetat và 30,6g cao nước Qui trình điều chế các loại cao được trình bày theo sơ đồ 1

Sắc ký bản mỏng trên các cao thu được nhận thấy cao eter dầu hỏa có các vết đều kém phân cực nên được để lại và khảo sát sau Cao cloroform (hệ giải ly cloroform 100%) cho một vết vàng với Rf=0,50, cao etyl acetat cho thấy bốn vết rõ

vì vậy hai cao này được chọn để làm những nghiên cứu tiếp theo

2.1.3 Điều chế các loại cao từ vỏ gòn

Ngâm 1,5kg bột vỏ khô nhiều lần với etanol 96o, lọc loại bỏ bã, đuổi dung môi, thu được 62,0g cao thô Cao thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi khác nhau, đuổi dung môi, thu được 9,0g cao eter dầu hỏa, 7,1g cao cloroform,

Sơ đồ 1: Qui trình điều chế các loại cao từ lá gòn

Chiết với etanol 96oLọc, thu hồi dung môi

Chiết lỏng–lỏng với clororform Làm khan, lọc, thu hồi dung môi

Chiết lỏng–lỏng với etyl acetat Làm khan, lọc, thu hồi dung môi

Thu hồi dung môi

Chiết lỏng–lỏng với eter dầu hỏa Làm khan, lọc, thu hồi dung môi

Cao cloroform (5,7g)

Cao etanol (101,2g)

Còn lại

Cao eter dầu hoả

(58,1g)

Lá gòn khô (1kg)

Cao nước (30,6g)

Cao etyl acetat (13,1g)

Còn lại

Còn lại

Sơ đồ 2: Qui trình điều chế các loại cao từ vỏ gòn

Chiết với etanol 96oLọc, thu hồi dung môi

Vỏ gòn khô (1,5kg)

Cao etanol (62,0g)

Chi Làm

ết lỏng–lỏng với eter dầu hỏa khan, lọc, thu hồi dung môi

Chiết lỏng–lỏng với clororform Làm khan, lọc, thu hồi dung môi

Chiết lỏng–lỏng với etyl acetat Làm khan, lọc, thu hồi dung môi

Thu hồi dung môi

Cao etyl acetat (10,1g)

Còn lại

Cao nước (35g)

10,1g cao etyl acetat, 35g cao nước Qui trình điều chế các loại cao được trình bày theo sơ đồ 2

Sắc ký bản mỏng trên các cao thu được nhận thấy cao eter dầu hỏa, cao cloroform và cao etyl acetat đều cho nhiều vết Chính vì vậy các cao này được lựa chọn để sắc ký cột cô lập hợp chất

2.2 SẮC KÝ CỘT ĐỂ CÔ LẬP HỢP CHẤT

2.2.1 Sắc ký cột trên cao cloroform của lá gòn (sơ đồ 1)

Cao cloroform (5,7g) được sắc ký cột trên silica gel, hệ dung môi giải ly là hỗn hợp eter dầu hỏa và cloroform với độ phân cực tăng dần, thu được 9 phân đoạn Trong quá trình sắc ký, dung dịch giải ly ra khỏi cột được hứng trong các lọ Các lọ được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng silica gel, các lọ có kết quả sắc ký giống nhau được gom lại thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.1 (phần thực nghiệm)

Phân đoạn 7 của bảng 3.1, sau khi cô quay loại dung môi, kết tinh lại bằng aceton, thu được hợp chất LGON-CLO7 (20mg), màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 254oC Thực hiện sắc ký lớp mỏng silica gel với hệ dung môi giải ly là cloroform : metanol tỉ lệ 9:1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 đậm đặc, sấy ở nhiệt độ

120oC, kết quả cho một vết tròn màu vàng nhạt với Rf=0,60 (hình 2)

Phân đoạn 8 của bảng 3.1, sau khi cô quay loại dung môi, kết tinh lại bằng metanol, thu được hợp chất LGON-CLO8 (10mg), màu trắng, nhiệt độ nóng chảy

295oC Thực hiện sắc ký lớp mỏng silica gel với hệ dung môi giải ly là cloroform : metanol tỉ lệ 8:2, thuốc thử hiện vết là H2SO4 đậm đặc, sấy ở nhiệt độ 120oC, kết quả cho một vết tròn màu xanh tím với Rf=0,60 (hình 3)

2.2.2 Sắc ký cột trên cao etyl acetat của lá gòn (sơ đồ 1)

Cao etyl acetat (13,1g) cũng được phân tách bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel, hệ dung môi giải ly là hỗn hợp eter dầu hỏa : etyl acetat với độ phân cực tăng dần và hệ etyl acetat : metanol tỉ lệ 9:1, 8:2, thu được 8 phân đoạn Trong quá trình sắc ký, dung dịch giải ly ra khỏi cột được hứng trong các lọ Các lọ được theo

dõi bằng sắc ký lớp mỏng silica gel, các lọ có kết quả sắc ký giống nhau được gom lại thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.2 (phần thực nghiệm)

Phân đoạn 3 của bảng 3.2, sau khi loại dung môi, kết tinh lại bằng metanol, thu được hợp chất LGON-EA3 (15mg), màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 274o

C Thực hiện sắc ký lớp mỏng silica gel với hệ dung môi giải ly là cloroform : metanol

tỉ lệ 8:2 thuốc thử hiện vết là H2SO4 đậm đặc, sấy ở nhiệt độ 120oC, kết quả cho một vết tròn màu vàng nhạt với Rf=0,60 (hình 4)

2.2.3 Sắc ký cột trên cao eter dầu hỏa của vỏ gòn (sơ đồ 2)

Cao eter dầu hoả (9,0g) được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel, hệ dung môi giải ly là eter dầu hoả : etyl acetat với độ phân cực tăng dần và hệ etyl acetat : metanol tỉ lệ 9:1, 8:2, thu được 8 phân đoạn Trong quá trình sắc ký, dung dịch giải ly ra khỏi cột được hứng trong các lọ Các lọ được theo dõi bằng sắc

ký lớp mỏng silica gel, thuốc thử hiện vết là H2SO4 đậm đặc, các lọ có kết quả sắc

ký giống nhau được gom lại thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình

bày trong bảng 3.3 (phần thực nghiệm)

Phân đoạn 6 của bảng 3.3, sau khi loại dung môi, kết tinh lại bằng cloroform, thu được hợp chất VGON-ED6 (50mg), màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 101oC Thực hiện sắc ký lớp mỏng silica gel với hệ dung môi giải ly là eter dầu hỏa : etyl acetat tỉ

lệ 7:3, thuốc thử hiện vết là H2SO4 đậm đặc, sấy ở nhiệt độ 120oC, kết quả cho một vết tròn màu xanh tím với Rf=0,50 (hình 5)

2.2.4 Sắc ký cột trên cao cloroform của vỏ gòn (sơ đồ 2)

Cao cloroform (7,1g) được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel,

hệ dung môi giải ly là cloroform : metanol với độ phân cực tăng dần, thu được 9 phân đoạn Trong quá trình sắc ký, dung dịch giải ly ra khỏi cột được hứng trong các lọ Các lọ được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng silica gel, các lọ có kết quả sắc

ký giống nhau được gom lại thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình

bày trong bảng 3.4 (phần thực nghiệm)

Hình 2: Sắc ký bản mỏng hợp chất LGON-CLO7 trước và sau khi làm sạch

Hệ giải ly cloroform : metanol (9:1)

Hình 4: Sắc ký bản mỏng chất LGON-EA3 trước và sau khi làm sạch

Hệ giải ly cloroform : metanol (8:2)

Phân đoạn 3 của bảng 3.4 sau khi sắc ký cột nhanh trên silica gel với dung môi

giải ly là cloroform 100%, thu được 4 phân đoạn Từ phân đoạn 3’, thực hiện sắc ký bản mỏng điều chế hai lần với hệ dung môi giải ly cloroform : metanol tỉ lệ 96:4, thu được hợp chất VGON-CLO3 (6mg), bột màu đỏ cam, nhiệt độ nóng chảy

163oC

Sắc ký lớp mỏng silica gel của hợp chất VGON-CLO3 với hệ dung môi giải ly

là cloroform : metanol tỉ lệ 95:5, thuốc thử hiện vết là H2SO4 đậm đặc, sấy ở nhiệt

độ 120o

C, cho một vết tròn màu vàng cam với Rf=0,60 (hình 6)

2.3 KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP

2.3.1 Xác định cấu trúc hợp chất LGON–CLO7

Hợp chất LGON–CLO7 cô lập từ cao cloroform của sơ đồ 1, dạng bột màu vàng nhạt Nhiệt độ nóng chảy 254oC (kết tinh lại trong aceton)

™ Sắc ký lớp mỏng silica gel (hình 2) cho vết tròn màu vàng nhạt với Rf=0,60, hệ

dung ly là cloroform : metanol tỉ lệ 9:1

™ Phổ IR (phụ lục 1), ν cm-1

: 3156 (O–H), 2849 và 2917 (C–H), 1659 (C=O), 1607 (C=C), 1118 (C–O)

™ Phổ 1

H-NMR (phụ lục 2a, 2b), δppm: Số liệu trình bày ở bảng 2.2

™ Phổ 13

C-NMR (phụ lục 3a, 3b), δppm: Số liệu trình bày ở bảng 2.2

Biện luận cấu trúc

™ Phổ 1

H-NMR (δppm) của hợp chất LGON–CLO7 có các mũi ở vùng từ trường thấp khoảng 6-8 là các mũi của proton của vòng benzen Trong đó, ở δH = 6,29 và 6,46 có hai mũi đôi, J=2,0Hz tương ứng với hai proton của vòng benzen ở vị trí

meta đối với nhau Và ở δH =7,03 và δH = 7,86 có hai mũi đôi-đôi, mỗi mũi (2H, dd,

J=7,0 và 2,0Hz), tương ứng với bốn proton của vòng benzen thế para.

™ Phổ 13

C-NMR (δppm) của hợp chất LGON-CLO7 có các mũi chủ yếu ở vùng δC

≈ 90-130 là các carbon của vòng benzen, và ở khoảng δC ≈ 158-164 là các carbon của vòng benzen gắn nhóm –OH

Ngoài ra còn có mũi ở δC = 182,6 là mũi của carbon của nhóm >C=O và mũi ở δC = 55,6 tương ứng với carbon của nhóm –OCH3

Kết hợp với tài liệu [18], phổ 1H,13C và các phổ hai chiều HSQC, HBMC của hợp chất LGON-EA3 cho thấy hợp chất LGON-CLO7 là hợp chất 5,7-dihydroxy-4'-metoxyflavon hay 4’-metoxyapigenin Các giá trị phổ NMR của hợp chất LGON-CLO7 được trình bày trong bảng 2.2

8

7

4 10 5

2'

6'

4'

5' 3'

5,7-Dihydroxy-4'-metoxyflavon

2.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất LGON-CLO8

Hợp chất LGON–CLO8 cô lập từ cao cloroform của sơ đồ 1, dạng bột màu trắng Nhiệt độ nóng chảy 295oC (kết tinh lại trong metanol)

™ Sắc ký lớp mỏng silica gel (hình 3) cho vết tròn màu xanh tím với Rf=0,60, hệ

dung ly là cloroform : metanol tỉ lệ 8:2

™ Phổ 1

H-NMR (phụ lục 4a, 4b, 4c), δppm: Số liệu trình bày ở bảng 2.3

™ Phổ 13

C-NMR (phụ lục 5a, 5b, 5c), δppm: Số liệu trình bày ở bảng 2.3

Biện luận cấu trúc:

™ Nhiệt độ nóng chảy của hợp chất LGON–CLO8 là 295oC, hợp chất

3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol nóng chảy ở 295 o

C [4]

™ Phổ 1

H-NMR (δppm) của hợp chất LGON–CLO8 có các dạng mũi như phổ của

hợp chất 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol trong đó có mũi đơn bầu ở δH =5,32 tương ứng với proton của C-6

Bảng 2.2: Các giá trị phổ NMR của hợp chất LGON-CLO7 và tài liệu[18]

Vị trí

Hợp chất LGON-CLO7 (CDCl3+MeOD)

Một mũi đôi ở δH = 4,22 với J=7,5Hz tương ứng với proton anomer có cấu hình β và

ở vùng từ trường δH ≈3-5 là các mũi của các proton của đường glucose

™ Phổ 13

C-NMR (δppm) của hợp chất LGON–CLO8 có hai mũi ở δC = 138,9 và 121,0 tương ứng với C-5 và C-6 Một mũi ở δC = 100,8 tương ứng với C-1’ Vùng

từ trường δC ≈ 60-80 là các mũi của carbon của đường glucose

Từ các số liệu nêu trên, kết hợp với tài liệu [11] đề nghị cấu trúc hoá học của hợp

6

11

8 7

19

15

12 13 18 21

4 3 2

17

20 22

16 14

25 23

27 24

29 28

26

1' 2' 3'

4' 5' 6'

O HO

HO HO HOCH2

H

2.3.3 Xác định cấu trúc hợp chất LGON–EA3

Hợp chất LGON–EA3 cô lập từ cao etyl acetat của sơ đồ 1, dạng bột màu vàng nhạt Nhiệt độ nóng chảy 274oC (kết tinh lại trong metanol)

™ Sắc ký lớp mỏng silica gel (hình 4) cho vết tròn màu vàng nhạt với Rf=0,60, hệ

dung ly là cloroform : metanol tỉ lệ 8:2

™ Phổ IR (phụ lục 6), ν cm-1

: 3471 (O–H), 2928 (C–H), 1660 (C=O), 1610 (C=C), 1071–1245 (C–O)

Bảng 2.3: Các giá trị phổ NMR của hợp chất LGON–CLO8 và tài liệu [11]

H (δ ppm, J Hz)

13

C (δ ppm)

1

H (δ ppm, J Hz)

Trong đó: ở δH = 6,45 và δH = 6,79 có hai mũi đôi, J=2Hz tương ứng với hai proton

của vòng benzen ở vị trí meta đối với nhau.Và ở δH = 7,16 và δH = 8,06 có hai mũi đôi-đôi, mỗi mũi (2H, dd, J=7 và 2Hz), tương ứng với bốn proton của vòng benzen

thế para

Ở δH = 12,90 có mũi đơn đặc trưng của proton trong nối hydrogen nội phân tử của một nhóm –OH gần một nhóm >C=O của khung flavon

Hai mũi ở vùng δH từ 4,5-5 tương ứng với hai proton anomer của hai đường Trong

đó ở δH = 5,06 có một mũi đôi, J=7,5Hz tương ứng với một proton anomer có cấu hình β và ở 4,56 có một mũi đơn tương ứng với một proton anomer có cấu hình α

Ở vùng từ trường cao δH ≈ 3-4 là các mũi tương ứng với các proton của đường Ngoài ra còn có một mũi đơn ở δH = 3,87 tương ứng với ba proton của một nhóm –OCH3 và ở δH = 1,08 có một mũi đôi, J=6,0Hz tương ứng với ba proton của nhóm –CH3 của đường rhamnose

™ Phổ 13

C-NMR (δppm) của hợp chất LGON–EA3 có các mũi chủ yếu ở vùng δC ≈ 90-130 tương ứng với các carbon của vòng benzen và ở vùng δC ≈ 156-164 tương ứng với các carbon của vòng benzen gắn nhóm –OH Ngoài ra còn có các mũi ở δC

= 182,0 là mũi của carbon >C=O, ở δC = 55,5 là mũi của carbon nhóm –OCH3 và ở

δC = 17,8 là mũi của carbon nhóm –CH3 của đường rhamnose

Kết hợp số liệu phổ của hợp chất apigenin 7-O-(6’’-malonylglucosid) [18], số liệu phổ của đường rhamnose [12] và các phổ HSQC, HBMC đề nghị cấu trúc của hợp

6'' 1'''

2''' 3''' 4'''

5''' 6'''

CH2

1' 1 2 9 8

7

4 10 5

2'

6'

4' 5' 3'

Bảng 2.4: Các giá trị phổ NMR của hợp chất LGON-EA3 và tài liệu [12,18]

Hợp chất LGON-EA3 (DMSO)

2.3.4 Xác định cấu trúc hợp chất VGON–ED6

Hợp chất VGON–ED6 được cô lập từ cao eter dầu hỏa của sơ đồ 2, dạng bột màu trắng Nhiệt độ nóng chảy 101oC (kết tinh lại trong cloroform)

™ Sắc ký lớp mỏng silica gel (hình 5) cho vết tròn màu xanh tím với Rf = 0,50, hệ

dung ly là eter dầu hỏa : etyl acetat tỉ lệ 7:3

™ Phổ 1

H-NMR (phụ lục 11a, 11b, 11c), δppm: Số liệu trình bày ở bảng 2.5

Biện luận cấu trúc:

™ Phổ 1

H-NMR (δppm) của hợp chất VGON–ED6 có mũi ba ở δH = 5,35 tương ứng với proton ở C-6 và C-6’của hai hợp chất stigmasterol và β-sitosterol Hai mũi đôi-đôi ở δH = 5,16 (J=15,8 và 8,8Hz) và ở δH = 5,02 (J=15,2 và 8,8Hz) tương ứng với hai proton ở C-22 và C-23 của hợp chất stigmasterol

Ngoài ra còn có một mũi bảy ở δH = 3,52 tương ứng với proton ở vị trí C-3 và C-3’ Dựa vào tỉ lệ tích phân của các mũi trên thấy tích phân mũi ba ở δH = 5,35 gấp đôi các mũi đôi-đôi ở δH = 5,16 và 5,02 cho thấy đây là hỗn hợp stigmasterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1

Như vậy kết hợp với tài liệu [5] đề nghị hợp chất VGON–ED6 là hỗn hợp hai chất stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1:1

™ Sắc ký lớp mỏng silica gel (hình 6) cho vết tròn màu vàng cam với Rf=0,60, hệ

dung ly là cloroform : metanol tỉ lệ 95:5

™ Phổ MS-ESI (phụ lục 12): cho mũi ion phân tử với m/z = 369,1 [M+H]+

H O

5 6

11

7

19

1 2 13 18 21

4

17 20 22

16

25 23

27 24

2 9 28

26

HO

1' 9'

5' 10

6'

11'

8' 7'

19

15'

12' 13' 18' 21'

4' 3' 2'

17' 20' 22'

16' 14'

25' 23'

27' 24

29' 28'

Biện luận cấu trúc:

™ Phổ 1

H-NMR (δppm) của hợp chất VGON–CLO3 có các mũi chủ yếu ở vùng từ trường thấp δH ≈ 6-8 Ở δH = 6,47 có một mũi đôi, J=15,5Hz và ở δH = 7,59 có một

mũi đôi, J=16,0Hz tương ứng với hai proton của một nối đôi với cấu hình trans

Các mũi đôi-đôi ở δH = 7,12, J=8,2 và 1,8Hz; mũi đôi ở δH = 7,05, J=1,5Hz và mũi đôi ở δH = 6,93, J=8,0Hz là ba proton của vòng benzen có mang ba nhóm thế ở vị trí

H H 7,05 d J=1,5Hz

7,12 dd J=8,25; 1,75Hz 6,93 d J=8

1 2

3

4 5

Một mũi đơn ở δH = 3,95 tương ứng với ba proton của nhóm –OCH3 Ngoài ra còn

có một mũi đơn ở δH = 5,80 tương ứng với proton của nhóm –CH=C< Đặc biệt tỉ lệ tích phân của proton này chỉ bằng 0,5 tỉ lệ tích phân của các proton khác điều này cho thấy hợp chất này có tính đối xứng

Dựa vào các phổ MS-ESI, HSQC, HMBC và tài liệu [17] đề nghị hợp chất VGON–

CLO3 là (1E,6E)-1,7-bis-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)hepta-1,6-dien-3,5-dion, tên

thông thường là curcumin Cấu trúc này có công thức phân tử C21H20O6 (M = 368)

phù hợp với giá trị của khối phổ MS-ESI cho mũi ion phân tử với m/z = 369,1

[M+H]+ Hợp chất này thường tồn tại với hai dạng hỗ biến ceton và enol, trong đó dạng enol bền hơn về mặt năng lượng ở trạng thái rắn và cả khi ở trong dung dịch

Curcumin

C C

CH2C

OCH3

H

H H

2 3 4 5

6 7

OH

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

O

1 23 4 5

6 7 1'

2' 3' 4'

5' 6'

OH

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

C

H H

O H