TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT

TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BM CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỊT CÁ-THỦY SẢN

TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỊT

1 Thịt

1.1 Khái niệm về thịt

Thịt là một trong những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Từ thịt có thể chế biến ra nhiều món ăn thơm ngon và giàu chất bổ Lượng thịt và các loạithịt được sử dụng trong bữa ăn hàng ngày phản ánh mức sống của xã hội Hiện nay trên thị trường có nhiều loại thịt, nhưng phổ biến vẫn là thịt lợn, thịt gà

và thịt bò

Thịt gia súc, gia cầm là tổ hợp các loại mô khác nhau như mô cơ, mô mỡ,

mô sụn, mô xương … Giá trị của thịt phụ thuộc vào tỉ lệ giữa các mô và chất lượng của chúng Căn cứ váo cấu tạo thịt được phân thành các loại: bì(da), thịt nạc, thịt mỡ và xương

Về cấu tạo thịt gia súc, gia cầm là giống nhau, nhưng cấu trúc protein trong thịt gia cầm đơn giản hơn, các bó sợi cơ nhỏ ngắn hơn, mô liên kết trong thịt gia cầm ít hơn trong thịt gia súc Mô mỡ của gia cầm ít xen kẽ giữa các mô

cơ và trong thành phần của thịt nạc.[1]

1.1.1 Thành phần dinh dưỡng của thịt

Thịt động vật nuôi sau khi giết mổ gồm có các thành phần hóa học như: nước, protein, lipit, gluxit, muối khoáng và vitamin Protein có trong thịt tươi khoảng 15-20%, gồm chủ yếu là protein hoàn thiện Độ đồng hóa của protein thịt là 96-97% Do vậy thịt là nguồn cung cấp thức ăn protein quan trọng trong khẩu phần của con người

Lipit trong thịt thường ở dưới da, ở khoang bụng, bao quanh nội tạng và

có ở xương

Hàm lượng chất béo ở dạng là 0,5-50% (tùy thuộc vào từng loại thịt) Thành phần chất béo trong thịt khá phức tạp, chúng được cấu tạo từ các axit béo khác nhau Các axit béo này tạo nên giá trị chất béo của thịt, tạo nên màu sâu, nhiệt độ nóng chảy và độ đồng hóa khác nhau.Độ đồng hóa mớ động vật phụ thuộc vào độ nóng chảy của các axit béo tạo nên chúng

Thí dụ: Mỡ lợn có nhiệt độ nóng chảy là 34-440C và có độ đồng hóa là 97-98%;

mỡ bò nóng chảy ở nhiệt độ là 45-520C có độ đồng hóa là 90%

Gluxit có trong thịt một lượng rất nhỏ (khoảng 0,4-0,8 %) ở dạng

glycogen có chủ yếu trong gan Khi nấu chất này tan trong nước hết.

Muối khoáng khá phong phú trong thịt nói chung Thịt có nhiều mỡ

thì ít muối khoáng Các muối khoáng trong thịt có: Ca, P, Mg, Zn, Co, Cu, Fe,

Se … trong đó có nhiều là Ca, P, Mg Các chất này tập trung ở trong xương là

nhiều nhất

Vitamin có ở trong thịt như vitamin A, B1 , PP, C, B12… Lượng

vitamin có thể ở phụ tạng như gan, thận, tim ,não [1]

Giới thiệu khái quát thành phần hóa học của một số loại thịt

Loại thịt Nước (%) Protein (%) Lipit (%) Chất

khoáng (%)

Năng lượng (Kcal)

Phụ thuộc vào vai trò ,chức năng và thành phần hóa học ,người ta chia

thịt thành các loại mô như sau: mô cơ, mô liên kết , mô xương , mô mỡ, mô

máu

Mô cơ:

Đây là loại mô chiếm tỉ lệ cao nhất trong cấu tạo của thịt Nó bao gồm

nhiều sợi tơ cơ xếp thành bó, các sợi cơ được cấu tạo từ miozin hoặc actin

Chức năng chủ yếu của nó là thực hiện hoạt động co giản

Thành phần hoá học của mô cơ : nước chiếm tỉ lệ: 72%-75% , protein:

18%-21% Còn lại là các thành phần khác: glucid, lipit, khoáng, vitamin…

mô liên kết:

Đây là loại mô được phân bố rộng rãi có vai trò liên kết các sợi tơ cơ ,các

bó cơ lại với nhau ,tạo cấu trúc chặt chẽ cho thịt

mô mỡ:

Mô mỡ được tạo thành từ các tế bào mỡliên kết với nhau dưới dạng lưới

xốp Lượng mô mỡ trong cấu trúc thịt nhiều hay ít phụ thuộc vào giống loài, giới tính và điều kiện nuôi dưỡng.

1.2Các kiểu hư hỏng của thịt trong giai đoạn trước và sau thu hoạch 1.2.1 giai đoạn của thịt trước và sau thu hoạch

Động vật sau khi chết, các tính chất quan trọng của thịt đều thay đổi căn bản.Sự trao đổi chất trong các mô chết ngừng lại và những quá trình hóa sinh thuận nghịch bởi enzyme chuyển thành những quá trình không thuận nghịch Các quá trình tổng hợp bị đình chỉ và hoạt động phá hủy của các enzyme nổi lênhang đầu

Dựa vào những biểu hiện bên ngoài, ta có thể chia sự biến đổi của thịt sau khi chết thành ba thời kỳ chính: quá trình tê cứng, quá trình tự phân và quá trình phân hủy thối rữa

Quá trình tê cứng:

Ngay sau khi chết, mô cơ thịt tươi nóng bị suy yếu, có độ ẩm nhỏ, môi trường pH gần 6,8 mùi thơm và vị thể hiện không rõ ràng Sau khi động vật đìnhchỉ sự sống trong mô cơ sự tê cóng sẽ bắt đầu

Biểu hiện bên ngoài cứng và có sự co ngắn của mô cơ Thời gian tê cứng diễn ra phụ thuộc vào đặc tính con vật và nhiệt độ môi trường Thịt bò ở nhiệt

độ 15 - 18o C sự tê cóng hoàn toàn bắt đầu xảy đến sau 10 - 12 giờ, ở nhiệt độ gần 0oC diễn ra sau 18 - 24 giờ Vào lúc này độ rắn của thịt tăng khoảng 25%, thịt như thế có độ rắn lớn kể cả sau khi nấu

Tê cóng sau khi chết của bắp cơ là kết quả của sự phát triển các quá trình hóa sinh phức tạp do enzyme mà đặc trưng của nó khác với các quá trình khi sống

Đó chủ yếu là các quá trình phân giải: glycogen, creatinphosphat,

adenosintriphosphat, sự tạo thành phức actomyosin …

Quá trình tự phân (chín tới) của thịt

Chín tới đó là tập hợp những biến đổi về tính chất của thịt, gây nên bởi sựtựphân sâu sắc, kết quả là thịt có được những biểu hiện tốt về hương thơm và vị,trở nên mềm mại tươi ngon, so với thịt ở trạng thái tê cứng, có độ ẩm lớn hơnvà dễ bị tác dụng của enzyme tiêu hóa hơn

Tốc độ phát triển quá trình tự phân trong thịt không những phụ thuộc vào nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào loài, tuổi, bộ phận trên súc thịt và trạng thái động vật trước khi giết Quá trình tự phân có thể điều chỉnh được bằng cách thayđổi nhiệt độ bảo quản Nhiệt độ 1 - 2oC thời gian chín tới hoàn toàn khoảng 10 -

14 ngày ; nhiệt độ 10 - 15oC khoảng 4 - 5 ngày ; nhiệt độ 18 - 20oC khoảng 3

Quá trình phân hủy thối rữa:

Sau quá trình tự chín nếu bảo quản không tốt thì đi đến quá trình thối hỏng Giai đoạn thối rữa do vi sinh vật gây nên, các vi sinh vật hoạt động tạo ra các men phân hủy protein, lipid thành các hợp chất Indol, NH3 , H2S …

Sự nhiễm vi sinh vật ở thịt khi động vật còn sống không đáng kể, chủ yếu

là do sự nhiễm vi sinh vật trên bề mặt sau khi giết mổ Mức độ nhiễm vi sinh vậttùy thuộc vào điều kiện vệ sinh khi giết mổ và bảo quản

Vận tốc xâm nhập của vi khuẩn hiếu khí vào lớp sâu 2 ÷ 10cm trong thịt dao động vào khoảng 1 ÷ 2 ngày ở nhiệt độ phòng ; vào lớp sâu 1cm sau 20 ngày ở nhiệt độ 0oC Sự phân hủy thịt diễn ra theo hai hướng: từ ngoài vào do các vi sinh vật hiếu khí và từ trong ra do các vi sinh vật kỵ khí

Sự phân hủy protein là nguyên nhân làm ẩm ướt bề mặt và xuất hiện chất nhầy,đồng thời với sự tiết chất nhầy trên bề mặt thịt phân hủy, màu sắc, mùi, độ chắc và các chỉ tiêu khác của thịt cũng bị biến đổi Thịt màu đỏ đầu tiên chuyển sang màu nhợt nhạt rồi sang màu xanh nhạt

Các dấu hiệu phân hủy thối rữa ở các mô khác nhau xuất hiện vào các thời kỳ khác nhau Độ bền vững đối với sự phân hủy thối rữa của các mô tăng lên theo thứ tự như sau: mô máu, mô cơ, mô mỡ, mô liên kết [1]

tương đối của không khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu Sự hư hỏng thịt thường thể hiện qua các dạng thối rữa, hóa nhầy, lên men mốc, đổi màu …

Sự thối rữa thịt:

Phân hủy thối rữa là sự biến đổi phức tạp đặc trưng nhất xảy ra trong thịt.Trong đó sự phân giải protein đóng vai trò quan trọng trong sự phân hủy thối rữa do hoạt động của các vi sinh vật trên bề mặt thịt gây ra và được chia làm 3 giai đoạn:

-Quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme protease do visinh vật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là các acid amin

-Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic,

butyric),rượu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol

-Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếptục chuyển hóa Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện môi trường mà các

hợp chất đó có thể bị oxy hóa hoàn toàn cho ra các hợp chất vô cơ như

CO2 , H2O, NH3 , H2S Trong điều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu

cơ, rượu, amin, trong đó có nhiều chất độc và mùi hôi thối

Quá trình thối rữa càng sâu, thì vi khuẩn yếm khí càng nhiều Khi đó mô thịt cómàu xám hoặc xám xanh, mềm nhũn, mất tính đàn hồi, cuối cùng nát vữa, pHcũng chuyển từ môi trường acid yếu đến môi trường kiềm Các chất khí có mùikhó chịu cũng thoát ra và tăng lên dần

Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh như là Bacterium Vulgaris, Bacterium

Paecalis … vi khuẩn yếm khí Bacillus Spectogennes, Bacillus Putripicus, Baccillus Putripiciens, Bacillus Postamus

Sự hóa nhầy bề mặt:

Đây là dạng hư hỏng thường gặp ở thịt bảo quản lạnh, nhất là độ ẩm của không khí cao ( trên 90%) sự hóa nhầy gây ra bởi các giống trực khuẩn chịu

lạnh, hiếu khí, không nha bào thuộc giống Achromobacter và Pseudomonas.

Nhiệt độ tối ưu cho sự hóa nhầy khoảng 2 ÷ 10oC, ẩm độ thấp thì thịt chóngmất nước Vì vậy nhiệt độ bảo quản thích hợp là từ 0 ÷ 2oC, ẩm độ tương đốicủa không khí tương ứng là 85 ÷ 90%

Sự lên men chua:

Hiện tượng này thường gặp ở thịt không được làm sạch hết máu khi giết

mổ và trong nhiều trường hợp không làm lạnh Vi khuẩn gây ra quá trình này

thường trực khuẩn yếm khí Bacillus Putripacens Sự lên men chua biểu thị bằng

sự xuất là hiện mùi chua khó chịu, thịt bị xám và mềm nhũn

Sự mốc thịt:

Sự mốc thịt gây ra do sự phát triển của các loài nấm mốc trên bề mặt thịt Quá trình mốc thường bắt đầu bằng sự xuất hiện trên bề mặt thịt những vết chấmhoặc những mạng tơ có màu trắng, về sau những vết đó lây lan dần và có màu đậm hơn

Nấm mốc thuộc họ Mucoreadae tạo thành những vệt trắng xám,

Clasosporium Herbarium tạo thành những vết đen Nấm Penicillinium tạo thành vết xanh Nhiều nấm mốc phát triển ngay cả nhiệt độ - 8oC Nấm mốc phát triểntrên bề mặt thịt không làm cho thịt bị biến đổi sâu sắc, tức thời nhưng nó chuẩn

bị cho các vi khuẩn thối rữa hoạt động sau này

Sự biến màu:

Màu sắc thịt phụ thuộc vào lượng và dạng của myoglobin, một chất màu vớinhiều dạng tồn tại khác nhau Myoglobin có liên quan với việc lưu trữ và vậnchuyển oxy trong mô cơ Nồng độ myoglobin thay đổi giữa các loài và giữa cácloại cơ bắp.[3]

Khi oxy được đưa vào hoặc khi thịt được tiếp xúc với không khí, myoglobin bịoxy hóa trở thành oxymyoglobin có màu đỏ hồng đào, màu mà người tiêu dùngmong đợi khi mua sản phẩm Nếu oxy bị khử, oxymyoglobin phục hồi màumyoglobin sẫm trở lại Trong một khoảng thời gian và dưới điều kiện không khí

có thể thay đổi từ vài giờ đến vài ngày, oxymyoglobin tiếp tục bị oxy hóa mạnhhơn tạo thành metmyoglobin Đây là sắc tố chịu trách nhiệm về sự biến màu nâu

của sản phẩm đồng nghĩa với thịt phi thương phẩm (Kerry et al., 2000).

Myoglobin và oxymyoglobin là những protein chứa heme trong đó có mặt Fe2+,trong khi metmyoglobin chứa Fe3+ [16]

Hình: Màu sắc của thịt ở các dạng khác nhau của myoglobin

1.3 Các phương pháp bảo quản thịt

1.3.1 Phương pháp xử lý lạnh

Là phương pháp tốt để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự hư hỏng của sảnphẩm và duy trì đầy đủ các tính chất tự nhiên ban đầu của thịt Thường sử dụnghai phương pháp xử lý lạnh sau :

-Phương pháp làm lạnh thịt : là quá trình hạ thấp nhiệt độ của thịt xuống nhưng nhiệt độ đó lớn hơn nhiệt độ đóng băng của dịch mô Nhiệt độ làm lạnh thường dùng là từ 0 - 40C

-Phương pháp lạnh đông thịt : là quá trình hạ thấp nhiệt độ của thịt xuống thấp hơn điểm đóng băng của dịch mô Nhiệt độ tốt nhất để lạnh đông thịt

bò từ -15 - -200C thịt heo, bê, cừu từ -12 - -150C với độ ẩm từ 80 - 85%

Phương pháp lạnh đông thường ít được sử dụng vì làm giảm chất lượng thực phẩm, không hiệu quả kinh tế Tuy nhiên, do tính chất thời vụ của dự trữ vàgiết mổ gia súc, buộc phải làm lạnh đông thịt để bảo quản lâu dài

Khi bảo quản lạnh trong súc thịt diễn ra các biến đổi vật lý và hóa học của mô cơ cũng như các quá trình vi sinh vật Thịt trở nên chắc, mùi vị phát triển dần qua giai đoạn chín tới Màu sắc súc thịt tiếp tục biến đổi do sự oxy hóa hemoglobin và mioglobin

Bảo quản lạnh lâu sẽ diễn ra sự biến đổi hóa học ở mô mỡ do sự thủyphân và sự oxy hóa chất béo Bên cạnh đó cũng có thể diễn ra hiện tượng ôi thịt

do vi sinh vật, dấu hiệu phát triển vi sinh vật trên súc thịt là sự xuất hiện dịchnhầy, nấm mốc …

Để kéo dài thời gian bảo quản thịt lạnh, có thể phối hợp với các biện phápnhư :dùng khí cacbonic, khí ozon, tia tử ngoại và chất kháng sinh Thời gianbảoquản thịt lạnh ở nhiệt độ 00C với nồng độ khí CO2 từ 10 - 20% đạt khoảng 50ngày, tăng gần 2 lần so với bảo quản trong không khí Thời gian bảo quản thịtlạnh phối hợp với sử dụng khí ozon đã tăng lên gấp rưỡi so với bảo quản thường

1.3.2 Phương pháp ướp muối:

Ướp muối thịt để bảo quản là phương pháp cổ truyền được sử dụng nhiềutrong nhân dân Có thể ướp kéo dài từ vài ngày đến vài tuần hoặc ướp thời gianngắn(vài giờ) Có thể ướp muối khô hoặc ướp muối ướt hoặc phối hợp cả haicách.Có thể kết hợp ướp muối với bảo quản lạnh để kéo dài thời gian bảo

quản.natrinitrit, kalinitrit), các chất gia vị như hồi quế, gừng, tỏi, đường, …

Nguyên liệu dùng để ướp muối là NaCl, các chất phụ gia (natrinitrat,kalinitrat,natrinitrit, kalinitrit), các chất gia vị như hồi quế, gừng, tỏi, đường, …

Tác dụng của muối ăn là làm cho thịt mặn, nâng cao tính chất bền vữngcủa sản phẩm khi bảo quản, xúc tiến các quá trình oxy hóa các thành phần trongthịt làm cho sản phẩm thay đổi màu Ngoài ra còn tạo áp suất thẩm thấu và giảm

độ ẩm của sản phẩm, giảm tỷ lệ oxy hòa tan trong môi trường làm ức chế các visinh vật hiếu khí

Trong quá trình ướp muối thường xảy ra một số hiện tượng làm giảmchất lượng sản phẩm như sự mất nước và mất một số thành phần protid tan củathịt Mức độ ngấm muối phụ thuộc vào tính chất của thịt, nồng độ muối, nhiệt

độ và thời gian ướp muối Thịt nạc thường ngấm muối nhanh hơn thịt mỡ

1.3.3 Phương pháp xông khói:

Xông khói thịt có thể tiến hành ở các khoảng nhiệt độ : từ 18 ÷ 200C gọi

là xông khói lạnh ; từ 35 ÷ 500C gọi là xông khói ấm ; từ 70 ÷ 1200C gọi là xôngkhói nóng Các chế độ nhiệt của quá trình xông khói có ảnh hưởng đến chấtlượng sản phẩm do có nhiều biến đổi sâu sắc trong thịt

Nhiên liệu để tạo khói là gỗ, mùn cưa, vỏ bào của các loại gỗ có hươngthơm như sồi, trầm, ổi, mít, …không dùng gổ có nhựa như thông vì trong khói

có nhiều bồ hóng làm cho sản phẩm có màu sẫm và vị đắng Độ ẩm nhiên liệukhoảng 30%, nhiệt độ lò đốt 300 ÷ 3500C thì cho khói tốt nhất (khói có màuvàng sẫm)

Tác dụng bảo quản của khói chủ yếu là do các hợp chất phenol Nó đượchấp thu chọn lọc và thấm sâu vào súc thịt Mô mỡ hấp thu nhiều hơn mô cơ Thịt

có độ ẩm cao hấp thu nhiều hơn thịt có độ ẩm thấp Khói có tác dụng ức chế vàtiêu diệt vi khuẩn làm hỏng thịt, chống oxy hóa thành phần chất béo không notrong thịt, cải thiện mùi, vị, màu sắc của thịt

1.4 hệ vi sinh vật trên thịt

1.4.1 nguồn lây nhiễm

Sản phẩm thịt tươi lấy từ mô khoẻ được coi là vô trùng và sự lây nhiễm

vi sinh vật có hai nguồn chính:

- Do bản thân vật: do vật bị ốm, bị bệnh… vi sinh vật gây bệnh và vi sinhvật kí sinh phát triển trên vật đó nên khi mổ xẻ thì lây sang mô thịt Thức ăn màcác gia súc ăn trước khi giết mổ cũng là nguồn lây nhiễm vi sinh vật từ bêntrong cho thịt

- Do môi trường bên ngoài: trong quá trình giết mổ, pha chế, vận chuyển,chế biến Da và lông có lượng vi sinh vật lớn, ngoài ra có hệ vi sinh vật đườngruột (106-108 tb/kg), khi giết mổ thì vi sinh vật lây nhiễm vào cơ thịt Trong quátrình vận chuyển vi sinh vật trong đất, không khí, nước, dụng cụ, áo quần côngnhân lây nhiễm sang thịt Trong quá trình sơ chế, chế biến nếu thanh trùngkhông kỹ thì dạng bào tử vi sinh vật vẫn còn trong sản phẩm thịt, nếu môitrường tốt và có đủ điều kiện bào tử sẽ phát triển thành sợi dinh dưỡng vì vậythịt cũng bị lây nhiễm Hay do nguyên liệu ban đầu đã bị nhiễm vi sinh vật.

1.4.2 hệ vi sinh vật trên thịt

Vi sinh thấy ở thịt chủ yếu trên bề mặt miếng (hoặc xúc thịt) và dần phát triển tăng số lượng đặc biệt là những miếng thịt giữ ở điều kiện nóng ẩm làm cho số lượng tăng lên nhanh, làm cho thịt chóng bị hư hỏng Ở đây thường gặp

các loại mốc thuộc các giống Cladosporium, Sporotrichum, Oospora

(Geotrichum), Thamnidium, Mucor, Penicillium, Antrnaria, Monilia… các

giống vi khuẩn Bacillus subtilis, B.mesentericus, B mycoides, B megatherium,

Clostririum sporogenes, Cl Putrificus, các dạng khác nhau của cầu khuẩn, các

dạng Coliform, Bacterium faecalis ancaligenes, Proteus vulagaris,

Pseudomonas liquefaciens, Micrococcus anaerobis… trong các số vi khuẩn phát

triển ở nhiệt độ thấp có Achromobacter, Pseudomonas Một số nấm men cũng thấy ở thịt Các vi khuẩn gây bênh cho người có thể thấy ở đây như Brucella,

1.4.3 bệnh liên quan tới vi sinh vật trên thịt

Một số bênh của gia súc có thể chuyển qua người như bênh thương hàn, phó thương hàn, bệnh lỵ trực trùng, bệnh tả, bệnh lở mồm long móng, bệnh tai xanh ở lợn, bệnh lao bò, bệnh nhiệt thán (bệnh than), bệnh bò điên, bệnh cúm gia cầm …

Các bện này do tác nhân là vi sinh vật có thể truyền từ vật sang người thành bệnh hoặc thành dịch bệnh [3]

1.4.4 vi sinh vật gây thối

1.4.4.1 Các vi sinh vật tham gia vào quá trình gây thối [2]

Các loài vi sinh vật gây thối có enzyme hỗn hợp

Loài vi sinh vật thuộc nhóm này có khả năng phân hủy không chỉ protit

mà còn phân hủy cả gluxit và lipit Thông thường các loài vi sinh vật có enzymehỗn hợp thường phát triển và phân hủy các thành phần dinh dưỡng trên thịttrước sau đó là sự phát triển của các vi sinh vật khác

các loài vi sinh vật gây thối có enzyme đơn

Loài vi sinh vật thuộc nhóm này chỉ có khả năng sinh tổng hợp một vàiloại enzyme riêng biệt và chỉ có thể thực hiện một vài phản ứng riêng rẽ chúngthường phát triển và thực hiện các phản ứng gây thối sau khi nhóm các loài visinh vật có enzyme hỗn hợp phát triển.

Bảng vi sinh vật gây thối

Bacillus pyocyaneum Bacillus mensenterucus

Phân hủy peptit

Bacillus Ventriculosus Bacillus orbiculus

Phân hủy axit amin

Bacillus faccalis Alcaligenes Proteus zenkirii

Phân hủy peptit

B bifidus

B acidophilus

B butyricus

B lactic aerogenes

Phân hủy axit amin B aminophilus

DiplococcusStreptococcusStaphylococcusColi

Gluxit bị phân hủy nen môitrường trở nên axit

Hình thành nhiều amoniac, pHđược chuyển sang trung tính

Cuối giái đoạn này lại thấy sựphát triển của nhiều vi sinh

Bắt đầu giai đoạn hóa peptone.Thịt mềm, nhớt, pH trở về trung

vật,xuất hiện khuẩn lạc vikhuẩn rất rõ

tính và kiềm, bắt đầu có mùi thối

5

(tuần lễ

thứ 2)

Vi sinh vật phát triển mạnh là

B putrificus, Proteus vulgari

Bắt đầu quá trình thối rữa Hàmlượng peptone và axit amin đềutăng Ngoài ra còn thấy có NH3,axit béo tự do, phenol, indol,skatol mercaptan

Hiện thượng thịt thối ở mức độcao nhất Amoniac tạo thành ứcchế nhiều loài vi sinh vật Khốithịt trở nên nhão

2 Chitosan

2.1 Khái niệm và lịch sử phát hiện

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821,trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” đểghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánhcứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưngông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier vàBraconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏmột số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giuntròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếutrong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thựcvật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một

số loại tảo Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ởdạng rắn.Do đó, các phương pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, vàphương pháp hoá học để biến tính chitin cũng như việc sử dụng và lựa chọn cácứng dụng của chitin gặp nhiều khó khăn.[6]

Còn chitosan chính là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn,xốp,nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau Chitosan được xem

là polymer tự nhiên quan trọng nhất Với đặc tính có thể hoà tan tốt trong môi

trường acid, chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹphẩm, dược phẩm

Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, không giống chất xơ thực

vật, chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất của cấu trúc quang

học…Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp

với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật

Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và cótính tương thích về mặt sinh học Trong nhiều năm qua, các polymer có

nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan đã được chú ý đặc biệt như là một

loại vật liệu mới có ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dược ,y học, xử lýnước thải và trong công nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa,hay tác nhân ổn định…

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm

lượng,chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng

lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuấtchitin - chitosan.[5]

Hình: 1)Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose

Như hình vẽ trên, thì sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và cellulose

là nhóm amin (-NH2) ở vị trí C2 của tritosan thay thế nhóm hydroxyl (-OH)

họcvới những chất tích điện âm như chất béo, lipid, cholesterol, protein vàcác đại phân tử Chitin và chitosan rất có lợi ích về mặt thương mại cũng như

là một nguồn vật chất tự nhiên do tính chất đặc biệt của chúng như tính tươngthích về mặt sinh học, khả năng hấp thụ, khả năng tạo màng và giữ các ionkim loại

2.2 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitosan

2.2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫnxuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực

tế Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độchại, đắt tiền Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi

nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2.

Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu

độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD

< 50% gọi là chitin [10]

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit

2-amino-2-deoxy-β-D-Công thức cấu tạo của chitosan

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose

poly(1-4)-2-Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Qua cấu trúc của chitin và chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chứchoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxylbậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2,

do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin Trong thực tế cácmạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời,việc tách và phân tích chúng rất phức tạp.[10]

2.2.2 Tính chất lý hoá của chitosan

Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặcdạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoàtan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axitlactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt Chitosan hoà tan trong dungdịch axit acetic 1 - 1.5% Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng lienquan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng làtính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) Chitosan kết hợp với aldehittrong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme

Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan Chitosan tác dụng vớiiod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím [9]

2.2.3 khả năng chống oxi hóa của chitosan

Các sản phảm thực phẩm chứa một hàm lượng cao các chất béo chưa bão hòa, dễ bị mất hương vị, tạo mùi ôi Darmadji và Izumimoto (1994) nhận thấy rằng 1% chitosan thêm vào thịt dẫn đến một sự suy giảm 70% trong 2-

thiobarbituric acid (TBA) giá trị sau 3 ngày kể từ ngày lưu trữ ở 4 0C.[15] Thịt

bò băm được xử lý với 5000 ppm of N-carboxymethylchitosan thì làm giảm 93% giá trị TBA St Angelo và Vercellotti (1989) Shahidi et al (1999) nhận thấy cơ chế của quá trình này liên quan tới sự chelation các ion sắt tự do

2.3 Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế chính xác của hoạt động kháng VSV của chitosan, chitin và các dẫnxuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chếđược quan tâm:[11]

Cơ chế thứ nhất

Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa

số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật

bị hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuấthiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phầncấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài  tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, vàJeon, 1999)

Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm

chống lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm

tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vikhuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ionkim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Khi bổsung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sangtích điện dương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan

không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli do mà là do sự kết lại của các

tế bào và sự tích điện dương ở màng của vi khuẩn Chitosan N-carboxybutyl,một polycation tự nhiên, có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte vớipolymer acid tính có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vikhuẩn với nhau

Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại cóthể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+,Mg2+ vàCa2+ Nồng độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ

ảnh hưởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus Người ta

cũng thấy rằng chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bàonhiều vi khuẩn Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị

rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm candida albicans Cả chitosan

phân tử lượng 50kDa và 5kDa đều kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân

tử lượng 50kDa làm mất nhiều gấp 2-4 lần ion K+ với ATP chitosan 5kDa Điềunày thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp

và cao Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã đượcnghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn.Và cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minhđựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹncủa tế bào Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tửtăng Và nó tăng cao ở nồng pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+ Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0.03-0.25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn

và khối lượng phân tử của chitosan Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát cácchất trong tế bào và phá hủy thành tế bào.Tính kháng khuẩn này phụ thuộc vàokhối lượng phân tử và loại vi khuẩn Đối với vi khuẩn Gram dương, chitosan

470 KDalton có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus sp , trong khivới vi khuẩn Gram âm chitosan có khối lượng 1106 KDalton mới có ảnh hưởng.Hoạt tính kháng khuẩn tăng khi gia tăng nồng độ chitosan [18]

Tóm lại khả năng kháng khuẩn của chitosan đối vi khuẩn Gram âm mạnhhơn so với vi khuẩn Gram dương (Chung et al 2004; No et al., 2002) Trong khi

đó vi khuẩn Gram dương lại nhạy cảm hơn, có thể do vi khuẩn Gram âm có lớpmàng chắn bên ngoài (Zhong et al., 2008) [13]

Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên E.coli (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan.

Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên S.aureus (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan

Hình: E coli xử lý với 300 mg/l OCNP(hạt nano chitosan) trong 30 min.

A 0 phút, B 5 phút, C 15 phút, D 30 phút (Xing et al., 2009b)

Theo Ming Kong và các cộng sự (2008) tất cả các vi khuẩn gram âm cómột màng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS) trong đóđóng góp vào sự ổn định của lớp LPS thông qua tương tác tĩnh điện với cáccation hóa trị hai như vậy như Mg2+ (Hình).Giống như EDTA, chitosan loại bỏcác cation Việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài.[12]

Cơ chế của hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩnGram dương và Gram âm (Zheng & Zhu, 2003) Trong nghiên cứu này, họ phân

biệt tác động của chitosan trên S aureus (Gram dương) và Escherichia coli (Gram âm) Đối với S aureus Gram dương, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử của chitosan Bên cạnh đó, với Gram âm E coli, hoạt

động kháng khuẩn tăng lên khi giảm trọng lượng phân tử Các tác giả gợi ý hai

cơ chế khác nhau cho hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trường hợp của S.

aureus, các chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng

polymer, ức chế các chất dinh dưỡng đi vào tế bào và, (2) Đối với, E coli,

chitosan trọng lượng phân tử thấp sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa [14]

Hình : Cấu tạo màng ngoài của vi khuẩn Gram âm

Ảnh hưởng của chitosan đối với E.coli sau 30 phút (kong và các cộng sự

2008)

Cơ chế thứ hai

Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo racác tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thôngtin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất,hấp thu các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự,1992).[11]