NGHIÊN cứu tác DỤNG hạ ĐƯỜNG HUYẾT của hạt vải

Vỏ và hạt quả vải là một dược liệu đã được các tác giả nước ngoài nghiên cứu chứng minh có tác dụng ức chế u và hạ đường huyết trên thực nghiệm và trên người. Một số nghiên cứu mới đây cho thấy hạt vải có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống đông máu, chống virus 3. Năm 2010, từ dịch chiết hạt quả vải Xinya Xu và cộng sự cũng đã phân lập được pumilasid A, một eudesmane sesquiterpen glucosid có tác dụng ức chế 4 dòng tế bào ung thư A549, LAC, Hela, HepG2 với IC50 từ 0,0126,29 µM; và funingensin A có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư gan HepG2 với IC50 là 39,27 µM 15. Theo một tài liệu đã công bố từ lâu trong hạt của quả vải có chứa chất α(methylenecyclopropyl)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột

Vỏ và hạt quả vải là một dược liệu đã được các tác giả nước ngoài nghiên cứuchứng minh có tác dụng ức chế u và hạ đường huyết trên thực nghiệm và trên người.Một số nghiên cứu mới đây cho thấy hạt vải có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, hạđường huyết, hạ lipid máu, chống đông máu, chống virus [3] Năm 2010, từ dịch chiếthạt quả vải Xinya Xu và cộng sự cũng đã phân lập được pumilasid A, một eudesmanesesquiterpen glucosid có tác dụng ức chế 4 dòng tế bào ung thư A549, LAC, Hela,Hep-G2 với IC50 từ 0,012-6,29 µM; và funingensin A có hoạt tính ức chế dòng tế bàoung thư gan Hep-G2 với IC50 là 39,27 µM [15].

Theo một tài liệu đã công bố từ lâu trong hạt của quả vải có chứa chất cmethylenecyclopropyl)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [4]

Từ vỏ của quả vải cũng đã phân lập được các flavonoid có hoạt tính ức chếdòng tế bào ung thư vú MCF-7 như epicatechin, proanthocyanidin B2, B4 [11], [14]

Y học cổ truyền có sử dụng vỏ và hạt quả vải trong điều trị một số chứng nhưđau răng, đau tinh hoàn, đau bụng hành kinh hoặc sau đẻ… Ở Việt Nam chưa có côngtrình nghiên cứu đầy đủ nào về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của vỏ

và hạt quả vải Như vậy, việc tận thu vỏ và hạt của quả vải để làm thuốc và trị bệnh là

hết sức cần thiết Mặc dù trên thế giới đã có các nghiên cứu về tác dụng dược lý cũngnhư thành phần hóa học của chúng nhưng ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu đầy đủnào về vấn đề này Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứngminh được thành phần hoạt chất cụ thể của vỏ và hạt quả vải là một việc làm cần thiết,tạo cơ sở cho việc tận thu, ứng dụng một nguồn nguyên liệu rất sẵn có ở Việt Nam nàylàm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, điều trị tiểu đường Bước đầu, chúng tôi đề xuấtnghiên cứu chiết xuất phân đoạn nhóm hoạt chất có tác dụng ức chế một số dòng tế bàoung thư cHep-2, MCF-7, A549…)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [; nghiên cứu chiết xuất phân đoạn nhóm hoạt chất cótác dụng hạ đường huyết Kết quả nghiên cứu này sẽ là tiền đề cho những nghiên cứusâu hơn về thành phần hoạt chất cụ thể và tạo ra chế phẩm thuốc hoặc thực phẩm chứcnăng hỗ trợ điều trị ung thư, tiểu đường từ nguồn nguyên liệu tận thu sẵn có này.

Mục tiêu của đề tài:

- Xác định được phân đoạn hoạt chất có tác dụng độc tế bào đối với một sốdòng tế bào ung thư

- Xác định được phân đoạn hoạt chất có tác dụng hạ đường huyết in vivo từ

vỏ và hạt quả vải

- Đào tạo cán bộ nghiên cứu mới

Nội dung nghiên cứu:

a, Nghiên cứu các phân đoạn chiết từ dược liệu về tác dụng độc tế bào trên một

số dòng tế bào ung thư:

+ Điều chế cao chiết toàn phần và các phân đoạn chiết

+ Thử tác dụng độc tế bào của các mẫu cao chiết trên dòng 3 dòng tế bào ung thư Hep-G2, MCF-7, A549

b, Đánh giá tác dụng hạ đường huyết in vivo của dịch chiết hạt và vỏ quả vải

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thực vật học [1]

Vải cLitchi chinensis Sonn.)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ thuộc họ Bồ hòn cSapindaceae)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [

Cây nhỡ hay cây to, cao 7-10m Cành hình trụ, vỏ màu nâu sẫm, có những chấmnhỏ Lá kép lông chim sẻ, mọc so le, gồm 7-9 lá chét cứng và dai, rất đa dạng, hìnhmác hoặc thuôn, gốc tròn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm có lông, màu nâu; hoa màu xanh vàngnhạt; đài hình đấu có lông; tràng 0; nhị 7-10, chỉ nhị có lông; bầu 2 thùy

Quả hình trứng, vỏ quả mỏng, sần sùi, màu đỏ nhạt; hạt có áo dày bao quanh,màu nâu Mùa hoa: tháng 3-4; mùa quả: tháng 5-6

1.2 Thành phần hóa học của quả vải

Quả vải chiếm 8-15% vỏ, 70-86% cùi và 4-18% hạt

Cùi vải chứa đường cchủ yếu là glucose và sacharose)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [, đường khử, acid citric,acid ascorbic, protein, chất béo, acid nicotic riboflavin, caroten và các nguyên tố đa vilượng như calci, phosphor, sắt

Hạt vải chứa Saponin, Tanin, Leucocyanidin cFlavonoid)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [, Anthocyanin,proanthocyanidin, steroid và sesquiterpene [13], [5], [18]

Các cyclopropyl- fatty acid glycoside như litchioside C [16]

Ngoài ra hạt vải còn chứa 8% dầu bao gồm dihydrosterculic acid, oleic acid,linoleic acid, palmitic acid và stearic acid với hơn 40 % acid béo không bão hòa [6]

1.3 Tác dụng sinh học

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Bốn hợp chất 3,12-Dihydroxy-cis-3,4-methylenedodecanoic acid glucopyranosid hay có tên gọi khác là litchiosid C c1)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [, c2S)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [-1-O-c9Z,12Z

3-O-β-D-octadecadienoyl)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol c2)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [, c2S)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [α-Dgalactopyranosylc1→6)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [-β-D-galactopyranosyl]glycerol c3)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ và gingerglycolipid Cc4)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ được phân lập từ hạt vải đã được chứng minh tác dụng chống oxy hóa trong thửnghiệm FRAP với các giá trị FRAP tương ứng là 21.5±2.6, 104.9±3.2, 69.9±5.7 và88.6±5.2 μmol Fe (II)/g.[16]mol Fe cII)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [/g.[16]

[-1-O-hexadecanoyl-3-O-Dịch chiết cồn nước 50% từ hạt vải thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh quétgốc DPPH và ức chế sự peroxi hóa lipid, tác dụng chống oxy hóa này được so sánh vớimột hợp chất chống oxy hóa tổng hợp là butylated hydroxyl toluene, nó còn có tácdụng chống lại quá trình sản xuất hắc tố melanin thông qua ức chế enzym Tyrosinase.[7]

Bốn hợp chất được phân lập từ dịch chiết cồn 95% hạt vải là protocatechuicacid, 2a,3a-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-c4b-8-catechin, 2a,3a-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan- c4b-8)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ -epicatechin, 2b, 3b-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan -c4a-8)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [- epicatechin cũng thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong thử nghiệm quét gốc tự

do DPPH và thử nghiệm Trolox [9] Tác dụng này cũng được thể hiện ở polysacharid

có trong dịch chiết nước hạt vải bằng phương pháp siêu âm [20]

Không chỉ ở hạt vải, các hợp chất có trong vỏ quả vải cũng thể hiện khả năngchống oxy hóa thông qua cơ chế quét gốc tự do và giảm sự oxy hóa lipid nhưanthocyanidin [19]

1.3.2 Tác dụng chống ung thư

Các sesquiterpene glucosides pumilaside A và funingensin A đã thể hiện tácdụng độc tế bào trên các dòng tế bào A549, LAC, Hela, Hep-G2 bởi thử nghiệm MTT,trong đó giá trị IC50 của pumilaside A nằm trong khoảng 0,012-6,29 μmol Fe (II)/g.[16]M cònfuningensin A chống lại các tế bào Hep-G2 với IC50 = 39,27 Μm [15].m [15]

Dịch chiết cồn nước vỏ quả vải thể hiện tác dụng chông lại ung thư vú MCF-7với IC = 80 μmol Fe (II)/g.[16]g/ml)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ [17], các flavonoid được phân lập từ vỏ quả vải có hoạt tính ức

chế dòng tế bào ung thư vú MCF-7 như epicatechin, proanthocyanidin B2, B4 Ngoài

ra các hợp chất epicatechin, proanthocyanidin B2, B4 và phần chiết ethyl acetat cũng

đã được chứng minh tác dụng kích thích miễn dịch, epicatechin và phần chiết ethylacetat thể hiện tác dụng này ở nồng độ lên tới 12.5 μmol Fe (II)/g.[16]g/ml cP<0.05)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ [11], [14]

1.3.3 Hạ đường huyết

Hai flavanon được phân lập từ hạt vải là c2R)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [naringenin7Oc3OaL rhamnopyranosyl-b-D-glucopyranosid)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ và c2S)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [-pinocembrin-7-O-c6-O-a-L-rhamnopyranosyl-b-D-glucopyranosid)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ thể hiện hoạt động ức chế α-glucosidase ở cácnồng độ 1, 0,1, 0,01 mg/ml [12]

-Dịch chiết nước hạt vải có thể ngăn ngừa các biến chứng có thể xảy ra trongbệnh tiểu đường thông qua sự ức chế aldose reductase Theo Kuang dịch chiết nướccủa hạt vải với liều c5 g/kg)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ có tác dụng giảm lượng đường trong máu của chuột bìnhthường và chuột mắc tiểu đường gây bởi alloxan, tác dụng hạ đường huyết này được sosánh gần bằng glibenclamid và phenformin [8] Ở Trung Quốc hạt vải đã được pháttriển thành thuốc để điều trị bệnh tiểu đường trên lâm sàng, đặc biệt là với người bệnhmang thai bị mắc tiểu đường [11] Hợp chất α-cmethylenecyclopropyl)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [glycin một acidamin có tác dụng hạ đường huyết chuột cũng đã được phân lập từ hạt vải [4]

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hạt và vỏ quả vải thiều được thu mua tại Hưng Yên tháng 7/2011

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều chế các phân đoạn chiết.

a, Nguyên vật liệu

- Dược liệu: Vỏ và hạt quả vải được phơi sấy khô ở 50ºC

-Dung môi và hóa chất: Các dung môi: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, cồn,nước; và các hoá chất phục vụ cho việc định tính các lớp chất.

b, Phương pháp

-Dùng các kỹ thuật , phương pháp chiết, chưng cất, chiết tách bằng dung môi, lọc, sấy,làm khô… ở các điều kiện về nhiệt độ, áp suất… thích hợp để thu được các cặn chiết đạttiêu chuẩn yêu cầu

-Khảo sát định tính các lớp chất có trong các phần cặn chiết được điều chế bằng sắc kýlớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp, dùng UV hoặc thuốc thử thích hợp để quan sátcác chất

- Dòng tế bào MCF-7 ctế bào ung thư vú)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [

- Dòng tế bào Hep-G2 ctế bào ung thư gan)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [

- Dòng tế bào A549 ctế bào ung thư phổi)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [

Hóa chất:

- MTT c3-c4,5-Dimethylthiazol-2-yl)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [-2,5- diphenyltetrazolium bromide)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ của hãng

in vitrogen

- Ellepticine của hãng Sigma

- DMSO của hãng sigma

- Và các hóa chất khác

Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính hiển vi soi ngược, và các máy móc khác

b Nguyên tắc:

- Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann c1983)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ để

đánh giá độc tính trên tế bào [10] Nguyên tắc của phương pháp như sau: MTT là thử

nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào Tế bào được nuôi cấy trong

một đĩa 96 giếng, đáy bằng Hợp chất MTT 3-c4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột diphenyltetrazolium bromide, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ

[-2,5-ở 37oC, 5% CO2 Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những

tế bào sống Khả năng hấp thụ của dung dich có màu này có thể được định lượng bằngmáy quang phổ kế ở bước song 540 – 600 nm Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzymereductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếpđến số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độctính của thuốc đối với tế bào

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thử tác dụng hạ đường huyết của hạt và vỏ quả vải trên chuột tăng đường huyết gây bởi alloxan

a Nguyên vật liệu thí nghiệm:

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, cả hai giống, trọng lượng từ20-22 g do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

- Mẫu thử:

+ Hạt quả vải: 500 g dược liệu khô = 75 g cao khô + Vỏ quả vải: 500 g dược liệu khô = 120 g cao khô

- Máy móc và trang thiết bị:

Máy định lượng sinh hoá bán tự động SCOUTMáy li tâm lạnh HETICH

Ống eppendorf 1,5 mlLồng chuột nhắtHoá chất: Kít định lượng glucose hãng HUMAN, Alloxane tetrahydrate- SIGMA, Gliclazide cSanofi-synthelabo

b Nguyên tắc:

Gây tăng glucose huyết thực nghiệm bằng alloxan Alloxan là tác nhân phá huỷ

tế bào β đảo tuỵ, làm giảm lượng insulin trong máu và là nguyên nhân gây tăng glucosehuyết

dicloromethan cLCH2, LCV2)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [; phân đoạn chiết ethylacetat cLCH3, LCV3)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [; phân đoạnchiết cồn nước còn lại cLCH4, LCV4)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [.

3.2 Thử độc tính của các cặn chiết từ vỏ và hạt quả vải trên 3 dòng tế bào ung thư

vú MCF-7, ung thư gan Hep-G2 và ung thư phổi A549.

- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độgốc của các mẫu là 2 mg/ml Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm

5 nồng độ 100, 75, 50, 25, và 12,5 μmol Fe (II)/g.[16]g/ml Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêuchuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997[2] Ellepticine được sử dụng làm chứng dương, với nồng độ thử lần lượt là 50; 25;12,5; 5,25; và 3,125 μmol Fe (II)/g.[16]M Dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm

- Quy trình nuôi cấy:

chứng trắng cblank control)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [

vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Nuôi tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định

3 Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 10 μmol Fe (II)/g.[16]l thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khácnhau vào mỗi giếng Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốcđược tan hoàn toàn trong môi trường

4 Ủ đĩa nuôi cấy từ 72 giờ c37oC, 5% CO2)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ cho phép thuốc phát huy tác dụng

Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.

6 Thêm 20 μmol Fe (II)/g.[16]l dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Lắc nhẹ cho MTTkhuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy

8 Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy

9 Hoàn trả formazan csản phẩm chuyển hóa MTT)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ bằng 100 μmol Fe (II)/g.[16]l DMSO Lắc kỹ đểformazan có thể tan hoàn toàn

10 Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tếbào sống sót

- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức nhưsau:

% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào không được

Chuột đã được nhịn đói 16 giờ, gây tăng glucose huyết bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôichuột dung dịch alloxan pha trong nước muối sinh lý với tỷ lệ thích hợp để đạt liều 65mg/kg Chuột sinh lý được tiêm nước muối sinh lý

- Ngày thứ 4: Các chuột đã được nhịn đói 16 giờ, uống nước theo nhu cầu, lấymáu, ly tâm lấy huyết thanh để định lượng nồng độ glucose huyết Loại bỏ nhữngchuột không đạt điều kiện thí nghiệm Chia đều các chuột đã được gây tăng glucosehuyết thành các lô:

+ lô chứng sinh lý: uống nước cất

+ lô chứng bệnh lý: uống nước cất

+ lô uống cao khô hạt quả vải liều 1,5g cao/ kg thể trọng chuột

+ lô uống cao khô hạt quả vải liều 3 g cao/ kg thể trọng chuột

+ lô uống cao khô vỏ quả vải liều 2,4 g cao/ kg thể trọng chuột

+ lô uống cao khô vỏ quả vải liều 4,8 g cao/ kg thể trọng chuột

+ lô đối chứng: uống gliclazid liều 200 mg/kg

Tất cả các lô được uống với thể tích như nhau là 0,2 ml/ 10 g chuột

- Ngày thứ 12 csau 8 ngày uống thuốc)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [: Các chuột đã được nhịn đói 16 giờ, uốngnước tùy thích, sau 1 giờ uống thuốc, lấy máu, ly tâm lấy huyết thanh định lượngglucose huyết tất cả các chuột

- Đánh giá kết quả: Tính % glucose huyết cGH)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [ trước và sau khi uống thuốc ởtừng chuột ở mỗi lô ccoi GH ban đầu là 100%)glycin, một acid amin có tác dụng hạ đường huyết chuột [, sau đó so sánh trung bình phần trăm ởcác lô mẫu thử với lô chứng bệnh lý không dùng mẫu thử

pháp so màu, dùng kit của hãng Human, đo trên máy định lượng sinh hóa bán tư động

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1 Kết quả điều chế các cặn chiết

Chúng tôi đã điều chế được 10 mẫu cao chiết để thử tác dụng sinh học Kết quảđược thể hiện trong bảng 1:

Bảng 1: Hiệu suất các cặn chiết

c c

m

m H

Với mc, c là khối lượng, độ ẩm của cặn chiết với độ ẩm tương ứng

md, d là khối lượng, độ ẩm dược liệu khô ban đầu

4.2 Kết quả định tính thành phần hóa học của hạt và vỏ quả vải

Bảng 2: Kết quả định tính thành phần hóa học của hạt và vỏ quả vải