3/24/2011 1 CHƯƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN • “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế bào là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc thực vật” (Schleiden và Schwann, 1838). • Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men với môi trường nhân tạo. Sản phẩm biến dưỡng của thực vật • Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid béo, acid amine,… • Sản phẩm thứ cấp: alkaloid, nicotine, berberin, ginsenosid, palitaxel,… Sản phẩm thứ cấp giúp đáp ứng stress, phòng vệ chống vi sinh vật, côn trùng,… Ví dụ về hợp chất thứ cấp Hợp chất ginsenosid từ cây Nhân sâm ( Panax ginseng ) : • Tác dụng đến hệ thần kinh trung ương; • Gia tăng sức đề kháng; • Tăng cường co bóp cơ tim • Hạ đường huyết Ví dụ về hợp chất thứ cấp Hợp chất ginsenosid từ cây Sâm Ngọc Linh ( Panax vietnamensis Ha et Grutzv.) Ví dụ về hợp chất thứ cấp • Đan sâm, Đảng sâm, Giác sâm, Hải quy sâm, Hồng sâm, Khổ sâm, Sa sâm, Sâm bòng bong, Sâm bố chính, Sâm chèo mèo, Sâm cuốn chiếu, Sâm đại hành, Sâm đất, Sâm lông, Sâm nam, Sâm ớt,… • Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam (Ngũ gia bì), Sâm Vũ Diệp (Trúc tiết Nhân sâm) 3/24/2011 2 • Giới : Plantae • Ngành : Magnoliophyta • Lớp : Magnoliopsida • Bộ : Apiales • Họ : Araliaceae • Chi : Panax Ví dụ về hợp chất thứ cấp Ví dụ về hợp chất thứ cấp Saponin: • Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa và tẩy sạch. • Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. • Độc với cá và động vật máu lạnh; có tác dụng diệt những loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. • Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt. • Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-ß-hydroxysteroid khác Ví dụ về hợp chất thứ cấp • Saponin steroid phân bố hẹp, được tìm thấy trong những loài cây một lá mầm và một ít cây hai lá mầm: Araliaceae, Agavaceae, Smilacaceae, • Trong cây, saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả như bồ kết, bồ hòn; tích lũy ở rễ như cam thảo, viễn chí, cát cánh; tích lũy ở lá như dứa Mỹ,… Hàm lượng trong cây thường rất cao có một số trường hợp lên đến 10 % Ví dụ về hợp chất thứ cấp Hợp chất taxol từ cây Thông đỏ ( Taxus wallichiana Zucc.): Vt liu thc vt Tc đ sinh tng hp đc bit Hm lưng paclitaxel TB (% trng lưng khô) V cây trưng thnh (100 năm tui) 4.70 x 10 -6 mg/g/day 0.017 Cây con (4 năm tui) 0.34 x 10 -6 mg/g/day 0.005 Nuôi cy mô 0.64 mg/l/day 0.200 Taxomyces andreanae 400 x 10 -6 mg/l/day - Tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các hệ thống thích hợp để sản xuất ra những hợp chất thứ cấp với sản lượng cao hơn cây nguyên vẹn 3/24/2011 3 Những hợp chất được tạo ra trong công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật để s dụng làm thuốc bao gồm: diosgenin, codeine, morphine, atropine, hyoscy- amine, scopolamine, digoxin, digitoxin, quinine, reserpine, artemisinin Quá trình nuôi cấy Điểm khác biệt giữa nuôi cấy tế bào đơn thực vật và VSV • Mức độ vô trùng • Tồn tại dưới dạng huyền phù • Tốc độ phân chia sinh khối • Phương thức sinh dưỡng • Các chất được tạo ra trong quá trình trao đổi chất Ưu điểm • Điều kiện nuôi cấy có thể được kiểm soát và có thể được tối ưu cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. • Tế bào có thể được chọn lọc và cải thiện bằng cách nhân dòng, gây đột biến hoặc biệt hóa dùng phương pháp hóa học hoặc phương pháp sinh học. • Có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy • Nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng là những tế bào mô sẹo. • Trong quá trình phát triển trong môi trường lỏng, các tế bào đơn của thực vật thường phát triển qua bốn giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy tàn. Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy Tế bào đơn phát triển thành dòng tế bào có các đặc tính sau: • Tách riêng từng tế bào dễ dàng; • Các tế bào có độ đồng nhất cao; • Tế bào có nhân to, nguyên sinh chất đậm đặc • Có chứa nhiều hạt tinh bột; • Có khả năng phân chia trong khoảng 24-72h; • Bị mất tính toàn thế; • Bị tăng mức bội thể. 3/24/2011 4 Những yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào đơn • Các chất điều hòa sinh trưởng: làm tăng quá trình phân bào, kích thích quá trình biệt hóa, tạo ra sản phẩm thứ cấp,… • Các nguồn dinh dưỡng: đạm, nguồn carbon, vi lượng, ánh sáng,… Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn thu nhận sản phẩm thứ cấp Điểm cần lưu ý • Không nên nuôi cấy tế bào đơn một cách đại trà mà không tính toán đến khả năng tạo ra những sản phẩm đặc biệt của loài thực vật đó. • Không phải tất cả các cơ quan đều có khả năng tạo ra chất mà ta quan tâm. • Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành tuyển chọn để nâng cao năng suất tạo ra các sản phẩm bậc 2. • Bổ sung cơ chất tương ứng. • Tìm ra môi trường đặc hiệu cho từng loại tế bào Phương pháp làm tăng sản lượng • Điều kiện môi trường thích hợp • Chọn lựa chủng có năng suất cao • Biến đổi tiền chất • X lý với các chất cảm ứng • Cố định tế bào • Tiết sản phẩm ra môi trường • Gây đột biến tế bào • Phát sinh hình thái Điều kiện môi trường thích hợp • Thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, độ lay chuyển, ánh sáng,… • Auxin thường được bổ sung vào môi trường để cảm ứng sự tạo mô sẹo, và nó sẽ được giữ lại với một hàm lượng rất thấp hoặc loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất các chất biến dưỡng. Mô sẹo của Oxalis reclinata dưới ánh sáng có màu vàng, nhưng khi được chuyển sang điều kiện tối thì có màu đỏ vì chúng bắt đầu sản xuất sắc tố anthocyanin có màu đỏ. 3/24/2011 5 Lựa chọn chủng có khả năng sản xuất cao • Các đặc tính sinh lý của mỗi tế bào riêng lẻ không luôn thống nhất với nhau. • Việc chọn dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng lượng sản phẩm thứ cấp và nên áp dụng phương pháp này rộng rãi. Biến đổi tiền chất và biến đổi sinh học • Việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có liên quan đôi khi kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. • Thay vì bổ sung một hợp chất đặc biệt như một tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, người ta còn có thể s dụng tế bào thực vật nuôi cấy để biến đổi các cơ chất thích hợp thành sản phẩm mong muốn. Ví dụ về biến đổi sinh học trong nuôi cấy tế bào: Coniferin được bổ sung vào huyền phù tế bào Podophyllum hexandrum và podophyllotoxin được tạo ra. Podophyllotoxin được s dụng để sản xuất thuốc trị ung thư. X lý với các chất cảm ứng (elicitor) • Khi vi sinh vật xâm nhiễm vào một thực vật nguyên vẹn thường cảm ứng sự tạo ra các hợp chất thứ cấp. • Tác động kích thích của chúng rất đáng kể nếu như một chất cảm ứng thích hợp được chọn lựa để kích thích sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Elicitor > Elicitor recognition > Enzyme synthesis > Phytoalexin synthesis 3/24/2011 6 Elicitor Loi TV Sn phm Phytophthora megasperma Glycine max Soybean Glycollin Fungal homogenate Ruta gravolens Acridone exposides Phytium aphanidermatum Catharanthus roseus Periwinkle Strictosidine lactam Ajmaciline Tabersonine Lochnericine Catharanthine Botrytis Colletotrichum Verticillium Altenaria Arachidonic acid Chitosan Nigram Papaver somniferum Opium poppy Sanguinarine Cố định tế bào Một hệ thống cố định có thể duy trì sự sống của tế bào qua một khoảng thời gian dài và phóng thích phần lớn sản phẩm ra môi trường ngoại bào ở dạng ổn định: • Sự cố định thường bị hạn chế • Sinh khối ban đầu phải được nuôi cấy dạng huyền phù tế bào • Sản phẩm bắt buộc tiết ra môi trường • Sản phẩm bị thoái biến • Ngăn cản sự khuếch tán của tế bào Tiết sản phẩm ra môi trường • Có thể làm tăng khả năng sản xuất những hợp chất thứ cấp bằng cách kích thích cho chúng được tiết ra ngoài môi trường. • Để làm tăng sự tiết sản phẩm ra môi trường, người ta cố gắng làm tăng tính thấm của màng tế bào những kết quả đạt được vẫn rất hạn chế. Gây đột biến tế bào • Các dạng đột biến điều hòa và đột biến khuyết dưỡng được s dụng rộng rãi để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm như amino acid, nucleotide, kháng sinh,… • Sự gia tăng hoạt động biến dưỡng bằng cách s dụng các đột biến điều hòa có thể thực hiện được về mặt lý thuyết và việc chọn lọc các kiểu tế bào đồng dạng cho mục đích này là một yếu tố quan trọng để sản xuất ra các loại sản phẩm khác nhau. Phát sinh hình thái • Có một mối quan hệ giữa sự phản phân hóa của tế bào với khả năng sản xuất ra các hợp chất thứ cấp nhưng vẫn chưa rõ rằng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có phụ thuộc vào sự phát triển của các cấu trúc chuyên biệt hay không hay những quá trình này có liên quan với nhau về đặc tính di truyền và đặc tính sinh lý? • Nuôi cấy lông rễ (chuyển plasmid Ri vào vết thương trên mô) . 3/24/2011 1 CHƯƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN • “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay Tế bào là đơn vị sống căn bản của mọi. trong tế bào và cơ chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy • Nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng là những tế bào. đạm, nguồn carbon, vi lượng, ánh sáng,… Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn thu nhận sản phẩm thứ cấp Điểm cần lưu ý • Không nên nuôi cấy tế bào đơn một cách đại trà mà không tính toán đến