Với mong muốn phát triển hơn nữa khả năng nuôi trồng và ứng dụng nấm vân chi trong ngành dược phẩm, chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc.
Trang 1LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm tạ:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TpHCM, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường
Trân trọng cám ơn:
Th.S Cổ Đức Trọng và Th.S Phan Thị Nhiều đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp
Thầy Lưu Phúc Lợi đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp
Các chị công nhân tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM
Và cảm ơn:
Các bạn của lớp CNSH K27 và bạn bè xung quanh đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hổ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2005
Nguyễn Phương Uyên
Trang 2
TÓM TẮT
NGUYỄN PHƯƠNG UYÊN, Đại học Nông Lâm TpHCM Đề tài “KHẢO SÁT
SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN CHI ĐEN TRAMETES VERSICOLOR
L.:Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC” được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM và Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường đại học Nông Lâm TpHCM trong thời gian từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Cổ Đức Trọng
Th.S Phan Thị Nhiều Mục đích đề tài: Tìm kiếm các môi trường nuôi trồng thích hợp đối với vân chi
đen Trametes versicolor Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần Qua quá
trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu nhận được một số kết quả như sau:
Quan sát hình thái giải phẫu quả thể và hệ sợi nấm vân chi dưới kính hiển vi nhận thấy rằng: Quả thể nấm vân chi không cuống, hình quạt, cứng, mỏng xếp xen kẽ chồng chất đan xen nhau như ngói lợp, mặt trên tai nấm có nhiều đường đồng tâm có màu sắc thay đổi từ xám tro, nâu đen đến đen, mặt dưới tai nấm màu trắng hay trắng kem, có nhiều lỗ rất nhỏ, thịt nấm mỏng màu trắng Hệ sợi nấm vân chi trong suốt có vách dày, không hoặc ít khi phân nhánh gồm 3 loại: Sợi dinh dưỡng, sợi bện và sợi cứng Bào tử trong suốt, nhẵn, vách mỏng, thon dài hơi cong
Khảo sát môi trường nhân giống cấp một trên các môi trường PSA, BTH, CRA, PSA + Nước dừa 10%, PSA + Nước chiết giá 10%; môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ; môi trường BTH ở các pH khác nhau Kết quả cho thấy hệ sợi lan nhanh nhất trên môi trường PSA + Nước dừa 10%, hệ sợi lan tốt ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC ) và ở pH
5 – 5,5 trên môi trường BTH (khoai tây + muối khoáng)
Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai với các cơ chất lúa, bắp xay, mùn cưa có
bổ sung các thành phần dinh dưỡng khác nhau Kết quả thu được có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và công thức gồm Lúa (80%), Mùn cưa (5%), Cám bắp (5%) là công thức tốt nhất thích hợp cho sự lan của hệ sợi
Thí nghiệm môi trường nuôi trồng ra quả thể vân chi trong điều kiện tại TpHCM với cơ chất mùn cưa có bổ sung cám gạo, cám bắp và các loại phân hữu cơ như Urea, DAP, SA, NPK…Qua quá trình khảo sát nhận thấy môi trường Mùn cưa + Cám gạo 10% và Mùn Cưa + Cám bắp 10% có sự hình thành quả thể sớm nhất, tương đối đồng đều và nhiều hơn cả
Thí nghiệm khả năng tạo sinh khối nấm vân chi trong môi trường nuôi cấy lỏng qua các nghiệm thức PSA, BTH, CRA, PSA + Nước chiết bắp, PSA + Nước chiết giá,
PS + Nước dừa với các nồng độ khác nhau Kết quả cho thấy trong tất cả môi trường thí nghiệm, môi trường BTH có lượng sinh khối cao nhất
Ly trích và định lượng các hợp chất trích từ sinh khối thu được ở thí nghiệm trên bằng phương pháp chiết nóng và tủa bằng cồn 96o Kết quả cho thấy sinh khối từ môi trường PSA + Nước dừa 10% có tỉ lệ polysacharide thô thu được cao nhất qua các lần chiết Khi tiến hành chiết và định lượng các hợp chất thô từ quả thể và hệ sợi trong môi trường nuôi cấy lỏng BTH cho kết quả: tỉ lệ chất chiết từ sinh khối hệ sợi cao hơn
so với chiết từ quả thể nấm
iv
Trang 3MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các hình x
Danh sách bảng xii
1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2 TỔNG QUAN 3
2.1 Khái quát về nấm trồng 3
2.1.1 Giới thiệu sơ lược 3
2.1.2 Giá trị của nấm 4
2.2 Tổng quan về nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilat 4
2.2.1 Giới thiệu về nấm vân chi: tên gọi và vị trí phân loại 4
2.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Trametes versicolor 6
2.2.3 Đặc điểm vi học 6
2.2.4 Đặc điểm phân bố 7
2.2.5 Chu trình sống 7
2.2.6 Quy trình nuôi trồng nấm 8
2.2.6.1 Chọn dòng và giữ giống 8
2.2.6.2 Quy trình nhân giống cấp một và cấp hai 9
2.2.6.3 Quy trình nuôi trồng ra quả thể 9
a Quy trình nuôi trồng trên gỗ khúc .10
b Quy trình nuôi trồng trên giá thể tổng hợp 11
2.2.6.4 Quy trình nuôi trồng thu sinh khối 12
2.2.7 Giá trị dược tính của nấm vân chi 13
2.2.8 Các giá trị khác của vân chi .14
Trang 42.2.9 Thành phần hoá học sơ bộ nấm vân chi 14
2.3 Một số khái niệm sinh hoá .15
2.3.1 Khái niệm về polysaccharide 15
2.3.1.1 Polysaccharide đồng thể 15
2.3.1.2 Polysaccharide dị thể 16
2.3.2 Amino acid .17
2.3.3 Chuỗi liên kết ∃-D-glucan 17
2.4 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi 18
2.4.1 PSK (polysaccharide - Kureha) 19
2.4.1.1 Cấu tạo 19
2.4.1.2 Dược tính .20
2.4.2 PSP (polysaccharide-peptide) 21
2.4.2.1 Cấu tạo 21
2.4.2.2 Dược tính 21
2.4.3 So sánh giữa PSK và PSP .23
2.5 Phương pháp chiết xuất hợp chất thô từ nấm (Phương pháp trích ly) 25
2.5.1 Khái niệm 25
2.5.2 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 25
2.5.2.1 Quá trình hoà tan .25
2.5.2.2 Quá trình khuếch tán 25
2.5.2.3 Quá trình thẩm tích .25
2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất 26
2.5.3.1 Nguyên liệu 26
2.5.3.2 Dung môi .26
2.5.3.3 Kỹ thuật chiết 26
2.5.4 Các phương pháp chiết .27
2.5.4.1 Chiết các nguyên liệu tươi 27
2.5.4.2 Phương pháp ngâm .27
2.5.4.3 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt 27
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 29
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 29
3.1.1 Thời gian .29
vi
Trang 53.1.2 Địa điểm 29
3.2 Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 29
3.2.1 Nguyên liệu 29
3.2.2 Hoá chất, môi trường sử dụng 29
3.2.2.1.Hoá chất 29
3.2.2.2 Các môi trường sử dụng 29
3.2.3 Dụng cụ, thiết bị 31
3.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 32
3.3.1 Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi .32
3.3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể 32
3.3.1.2 Hệ sợi tơ thứ cấp 32
3.3.1.3 Đảm và đảm bào tử 32
3.3.2 Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 32
3.3.2.1 Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau 32
3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 33
3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 33
3.3.3 Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai .33
3.3.4 Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể 34
3.3.5 Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng 35
3.3.6 Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor 36
3.4 Phương pháp xử lý số liệu 38
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
4.1 Quan sát hình thái giải phẫu 39
4.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể 39
4.1.2 Hình thái cấu tạo hệ sợi hệ sợi thứ cấp 40
4.1.3 Đảm và bào tử đảm 41
4.2 Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 42
4.2.1 Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên môi trường dinh dưỡng khác nhau 42
Trang 64.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ .43
4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 45
4.3 Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt) 46
4.4 Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể 48
4.5 Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng 49
4.6 Khảo sát tỉ lệ ly trích hợp chất thô từ sinh khối nấm vân chi 52
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
7 PHỤ LỤC
viii
Trang 7DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PSK : polysaccharide Kureha
PSP : polysacharide peptide
IL : interleukin
INF : yếu tố gây hoại tử
CPA : cyclophosphamine
PLB : tế bào lympho máu ngoại vi
ALS : huyết thanh bạch cầu
MCM : mytomycin-M
LD : lethal dose (Liều chết trung bình)
CD : kháng nguyên biểu hiện bên ngoài của tế bào T
ITF : interferon
BTH : môi trường bán tổng hợp
TLPT : trọng lượng phân tử
Trang 8DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Quả thể nấm vân chi Trametes versicolor 6
Sơ đồ 2.1: Chu trình phát triển của nấm vân chi .7
Sơ đồ 2.2 Quy trình phân lập tổng quát .8
Sơ đồ 2.3 Quy trình nuôi trồng nấm 10
Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi beta-glucan trích từ nấm 18
Sơ đồ 3.2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi 37
Hình 4.1: Quả thể nấm Vân chi đen Trametes versicolor (theo chiều từ trên xuống, trái qua phải: Hình 4.1a, Hình 4.1b, Hình 4.1c, Hình 4.1d ) .39
Hình 4.2: Hệ sợi trích từ quả thể nấm vân chi 40
Hình 4.3: Hệ sợi vân chi lấy từ môi trường thạch 41
Hình 4.4: Bào tử nấm vân chi 42
Hình 4.5: Đường kính hệ sợi tăng trưởng trên năm môi trường dinh dưỡng sau 4 ngày cấy 43
Hình 4.6: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở 27oC và 30oC vào ngày thứ 4 .45
Hình 4.7: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH vào ngày thứ 4 46
Hình 4 8 : Hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống trung gian sau 7 ngày cấy 48
Hình 4.9: Sinh khối nấm Vân chi trong 3 môi trường lỏng 50
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường dinh dưỡng theo thời gian .42
Biểu đồ 4.2: Biểu diễn đường kính hệ sợi nấm vân chi lan trên môi trường BTH ở nhiệt độ 27oC và 30oC theo thời gian .44
Biểu đồ 4.3: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 45
Biểu đồ 4.4: Biểu diễn chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai 47
Biểu đồ 4.5: Biểu diễn sinh khối nấm vân chi được tạo ra trên 3 môi trường 50
x
Trang 9Biểu đồ 4.6: Biểu diễn sinh khối nấm trong các môi trường có bổ sung thành phần dinh dưỡng tự nhiên 51 Biểu đồ 4.7 : Biểu diễn tỉ lệ hợp chất polysccharide thô chiết từ sinh khối thu được trên
3 môi trường lỏng 53 Biểu đồ 4.8: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô chiết từ sinh khối hệ sợi nấm vân chi thu được trên 10 môi trường lỏng 54 Biểu đồ 4.9: Biểu diễn khối lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường 55 Biểu đồ 4.10: Biểu diễn tỉ lệ chất trích từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau 56
Trang 10DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật 14
Bảng 2.2: So sánh giữa PSK và PSP 23
Bảng 3.1: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong mùn cưa (%) .31
Bảng 3.2: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong các loại bột (%) 31
Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa 31
Bảng 4.1: Đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường đinh dưỡng theo thời gian 42
Bảng 4.2: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ theo thời gian .44
Bảng 4.3: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 45
Bảng 4.4: Chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai 46
Bảng 4.5: Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng 48
Bảng 4.6: Sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trường lỏng 49
Bảng 4.7: Sinh khối vân chi trên các môi trường bổ sung dinh dưỡng tự nhiên 51
Bảng 4.8: Tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trường lỏng 53
Bảng 4.9: Tỉ lệ hợp chất polysaccharide thô trích từ sinh khối thu hoạch trên 10 môi trường lỏng 53
Bảng 4.10: Khối lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường 55
Bảng 4.11: Tỉ lệ chất trích từ các nguồn nguyên liệu khác nhau .56
xii