Phân tích acid nucleic - Phân tích ADN plasmid Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai ADN. Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích ở đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kích thước sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng enzym cắt hạn chế, sau đó điện di trên gel agarose và so sánh sự đa hình của các mảnh cắt để phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau. Plasmid vòng Streptomyces và Borrelia Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc thể. Cấu trúc plasmid là sợi đôi ADN khép kín theo vòng. Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ là sợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia và Streptomyces). Plasmid được tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm men. + Tách plasmid: Thông thường lượng plasmid có trong tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic của tế bào. Như vậy, ta phải thực hiện phép tách plasmid ra khỏi ADN của nhiễm sắc thể. Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nhưng nguyên tắc chung là phá tế bào vi khuẩn dùng enzym, siêu âm hay trong dung dịch kiềm có chất tẩy rửa là SDS hoặc TritonX-100, sau đó là việc loại ADN của nhiễm sắc thể và protein. Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat. Lúc này phần lớn các thành phần ADN nhiễm sắc thể và protein của tế bào đã bị kết tủa bị loại bằng li tâm và plasmid nằm trong dịch trên tủa được tách khi kết tủa với ethanol hay isopropanol. Đây là phương pháp có hiệu quả để tách plasmid, trên thực tế hiệu quả tách các plasmid có kích thước nhỏ cao hơn nhiều so với các plasmid có kích thước lớn (>100 Kb). Với các plasmid có kích thước lớn cần các thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do các nguyên nhân cơ học. Với cách tách plasmid như trên thì sản phẩm thu được có lẫn các đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp và nhiễm ARN. Để tránh nhiễm ARN thì cần xử lý với RNase (ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể tách theo các phương pháp như: - Tách bằng Caeseium chloride. - Tách bằng KIT QIAGENE. - Tách bằng kỹ thuật khác. + Điện di plasmid trên gel agarose: Sau khi thu được plasmid thì phải tiến hành kiểm tra trước khi phân tích kết quả điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid và kích thước của chúng. Khi tiến hành điện di thì nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với một trong các đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) và TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH 8.0). Sau khi điện di, gel được nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dưới tia UV (310 nm). Nồng độ ethidium bromide khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm là 10 phút. Sau đó được rửa một lần nhanh bằng nước loại ion trước khi được nhìn dưới UV và chụp ảnh làm tài liệu. Một số vấn đề cần lưu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông thường plasmid được thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi endonuclease. Dạng di chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn (Hình 1.1). Hình 1.1. Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di Đôi khi việc tách plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong những trường hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn các mảnh ADN của nhiễm sắc thể. Trong mọi trường hợp đều có nhiễm các RNA và chúng di động nhanh nhất trừ các trường hợp plasmid như vậy không được nhầm lẫn giữa plasmid siêu xoắn và dạng chính plasmid đứt gãy và plasmid khác. Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh kích thước giữa các plasmid siêu xoắn và dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng. Thực tế là chỉ có thể so sánh các plasmid siêu soắn với nhau về kích thước. Khi tiến hành phân biệt giữa các chủng vi khuẩn thì đương nhiên là chỉ có thể thực hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid với nhau. Cũng nên chú ý là không phải các chủng đều giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết quả phân tích plasmid như nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu quả trong các mẫu có nhiều loại plasmid, tuy nhiên cũng phải tính đến việc các plasmid cũng có thể bị mất trong quá trình bảo quản. + Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế: Cho đến nay, người ta đã tìm thấy hơn 400 enzym cắt hạn chế. Mục đích của kỹ thuật này bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid ở trên. Tức là người ta có thể phân biệt được sự khác nhau của các plasmid có cùng kích thước. Như vậy, khi xử lý plasmid với một hay kết hợp một số enzym cắt hạn chế thì kết quả sẽ thu được là các đoạn ADN được cắt có kích thước khác nhau. Kết quả này có độ lặp lại cao, do đó dễ sử dụng khi so sánh các mẫu khác nhau. Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế được sản xuất và tiêu thụ trên thị trường, các enzym này có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid. Thông thường xử lý enzym trong 1 giờ sau đó mẫu được phát hiện trên gel agarose hoặc polyacrylamid Tuỳ thuộc vào kích thước của các mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau: Bảng 1.1. Nồng độ agarose và kích thước mẫu ADN tương ứng. Nồng độ agarose (%) Kích thước ADN (kb) 0.3 1-7 0.5 0.7-45 0.8 0.4-20 1.0 0.3-10 1.2 0.2-8 1.5 0.2-6 2.0 0.1-5 Theo kinh nghiệm của nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ các băng ADN có ý nghĩa cho so sánh không nên dưới 10 băng và nên có cả băng kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên, các băng lớn không nên vượt quá 10 do băng có kích thước lớn như vậy khó di chuyển trên gel. Trong các trường hợp so sánh thì nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước và phép phân tích dấu vân tay cho các lần phân tích khác nhau. Như đã trình bày ở trên, nếu như phân tích các chủng vi sinh vật dựa vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối với các đối tượng có nhiều plasmid thì phương pháp xử lý enzym cắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trong các trường hợp nghiên cứu dịch tễ học trên các chủng có cùng phổ plasmid hay plasmid có kích thước giống nhau. Người ta đã ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm (Hamburger). Các plasmid từ các chủng khác nhau thì có phổ khác nhau về các đặc điểm cắt bởi enzym cắt hạn chế. Kết quả tạo ra các mảnh ADN đặc trưng cho cá thể làm cơ sở cho phép so sánh. Tuy nhiên khó có thể so sánh kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau, sở dĩ như vậy là do không dùng cùng một loại enzym cắt hạn chế. Một lý do nữa cũng cần được đề cập đến là sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên tại vị trí enzym cắt, kết quả này tạo ra sự khác biệt về phổ thu được từ các mảnh cắt. . Phân tích acid nucleic - Phân tích ADN plasmid Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic. thông qua giải trình tự ADN và lai ADN. Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích ở đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kích thước sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng. thước mẫu ADN tương ứng. Nồng độ agarose (%) Kích thước ADN (kb) 0.3 1-7 0.5 0. 7-4 5 0.8 0. 4-2 0 1.0 0. 3-1 0 1.2 0. 2-8 1.5 0. 2-6 2.0 0. 1-5 Theo kinh nghiệm của nhiều tác giả (Grimont-1991)