Phân tích acid nucleic

Phân tích acid nucleic Phân tích acid nucleic Bởi: Nguyễn Lân Dũng Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN lai ADN Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích bao gồm tách plasmid, so sánh loại plasmid kích thước sau tinh plasmid xử lý enzym cắt hạn chế, sau điện di gel agarose so sánh đa hình mảnh cắt để phân biệt chủng vi sinh vật với Plasmid vòng 1/10 Phân tích acid nucleic Streptomyces Borrelia Plasmid nhân tố di truyền nhân chép độc lập với nhiễm sắc thể Cấu trúc plasmid sợi đôi ADN khép kín theo vòng Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ sợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia Streptomyces) Plasmid tìm thấy hầu hết vi khuẩn số vi sinh vật nhân thực bậc thấp nấm men Tách plasmid: Thông thường lượng plasmid có tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic tế bào Như vậy, ta phải thực phép tách plasmid khỏi ADN nhiễm sắc thể Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nguyên tắc chung phá tế bào vi khuẩn dùng enzym, siêu âm hay dung dịch kiềm có chất tẩy rửa SDS TritonX-100, sau việc loại ADN nhiễm sắc thể protein Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat Lúc phần lớn thành phần ADN nhiễm sắc thể protein tế bào bị kết tủa bị loại li tâm plasmid nằm dịch tủa tách kết tủa với ethanol hay isopropanol Đây phương pháp có hiệu để tách plasmid, thực tế hiệu tách plasmid có kích thước nhỏ cao nhiều so với plasmid có kích thước lớn (>100 Kb) Với plasmid có kích thước lớn cần thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy nguyên nhân học Với cách tách plasmid sản phẩm thu có lẫn đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp nhiễm ARN Để tránh nhiễm ARN cần xử lý với RNase (ribonuclease A) Tuy nhiên, tách theo phương pháp như: - Tách Caeseium chloride - Tách KIT QIAGENE - Tách kỹ thuật khác 2/10 Phân tích acid nucleic Điện di plasmid gel agarose: Sau thu plasmid phải tiến hành kiểm tra trước phân tích kết điện di gel agarose để biết phổ plasmid kích thước chúng Khi tiến hành điện di nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, mM EDTA, pH 8.0) TPE (80 mM Tris- phosphats mM EDTA, pH 8.0) Sau điện di, gel nhuộm với ethidium bromide phát tia UV (310 nm) Nồng độ ethidium bromide khoảng mg/l thời gian nhuộm 10 phút Sau rửa lần nhanh nước loại ion trước nhìn UV chụp ảnh làm tài liệu Một số vấn đề cần lưu ý phân tích plasmid: gel thông thường plasmid thấy dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy dạng mạch thẳng bị cắt endonuclease Dạng di chuyển tốc độ cao siêu xoắn (Hình 1.1) Hình 1.1 Di chuyển plasmid mạch thẳng (L) siêu xoắn (OC) điện di Đôi việc tách plasmid phức tạp đặc biệt trường hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn mảnh ADN nhiễm sắc thể Trong trường hợp có nhiễm RNA chúng di động nhanh trừ trường hợp plasmid không nhầm lẫn plasmid siêu xoắn dạng plasmid đứt gãy plasmid khác Một ý khác tránh nhầm lẫn so sánh kích thước plasmid siêu 3/10 Phân tích acid nucleic xoắn dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng Thực tế so sánh plasmid siêu soắn với kích thước Khi tiến hành phân biệt chủng vi khuẩn đương nhiên thực so sánh chủng có plasmid với Cũng nên ý chủng giống đặc tính miễn dịch có chung kết phân tích plasmid Phép phân tích có hiệu mẫu có nhiều loại plasmid, nhiên phải tính đến việc plasmid bị trình bảo quản Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế: Cho đến nay, người ta tìm thấy 400 enzym cắt hạn chế Mục đích kỹ thuật bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid Tức người ta phân biệt khác plasmid có kích thước Như vậy, xử lý plasmid với hay kết hợp số enzym cắt hạn chế kết thu đoạn ADN cắt có kích thước khác Kết có độ lặp lại cao, dễ sử dụng so sánh mẫu khác Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế sản xuất tiêu thụ thị trường, enzym có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid Thông thường xử lý enzym sau mẫu phát gel agarose polyacrylamid Tuỳ thuộc vào kích thước mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau: Bảng 1.1 Nồng độ agarose kích thước mẫu ADN tương ứng Nồng độ agarose (%) Kích thước ADN (kb) 0.3 1-7 0.5 0.7-45 0.8 0.4-20 1.0 0.3-10 1.2 0.2-8 1.5 0.2-6 2.0 0.1-5 Theo kinh nghiệm nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ băng ADN có ý nghĩa cho so sánh không nên 10 băng nên có băng kích thước nhỏ kích thước lớn Tuy nhiên, băng lớn không nên vượt 10 băng có kích thước lớn 4/10 Phân tích acid nucleic khó di chuyển gel Trong trường hợp so sánh nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước phép phân tích dấu vân tay cho lần phân tích khác Như trình bày trên, phân tích chủng vi sinh vật dựa vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối tượng có nhiều plasmid phương pháp xử lý enzym cắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trường hợp nghiên cứu dịch tễ học chủng có phổ plasmid hay plasmid có kích thước giống Người ta ứng dụng kỹ thuật nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm (Hamburger) Các plasmid từ chủng khác có phổ khác đặc điểm cắt enzym cắt hạn chế Kết tạo mảnh ADN đặc trưng cho cá thể làm sở cho phép so sánh Tuy nhiên khó so sánh kết thu từ phòng thí nghiệm khác nhau, không dùng loại enzym cắt hạn chế Một lý cần đề cập đến xuất đột biến ngẫu nhiên vị trí enzym cắt, kết tạo khác biệt phổ thu từ mảnh cắt Phân tích ADN nhiễm sắc thể: Phương pháp phân tích bao gồm việc tách ADN nhiễm sắc thể cắt enzym cắt hạn chế để phân biệt vi sinh vật với Một ý tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy nguyên nhân học Nói chung mảnh cắt nên có kích thước nhỏ 50 kb Việc tách mảnh cắt thực dựa vào kỹ thuật điện di trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style="text-align: justify; margin-top: 6.0pt"> Như kỹ thuật dấu vân tay không áp dụng trường hợp tế bào mang plasmid mà kỹ thuật sử dụng với nhiễm sắc thể cho trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp Liên quan đến vấn đề phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết xử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật Ở cách chọn loại enzym cắt hạn chế vô quan trọng, theo cách chọn tạo nhiều mảnh cắt nên phân biệt băng riêng rẽ trường hợp khác lại tạo mảnh cắt có kích thước lớn khó tách theo kỹ thuật điện di có Các vi sinh vật khác có tỷ lệ GC khác (dao động từ 25-75%) mảnh cắt thu sau xử lý enzym cắt hạn chế khác Theo Nei M Li W H (1979) số mảnh cắt thu tính lý thuyết là: a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2 Trong đó: g - tỷ lệ GC ADN r1 - số cặp GC r2 - số cặp AT vị trí cắt enzym giới hạn sử dụng 5/10 Phân tích acid nucleic a - số vị trí cắt sử dụng enzym cắt hạn chế Mặt khác, người ta vào kết nghiên cứu vị trí cắt gene vi sinh vật làm sở cho cách chọn enzym cắt Thông thường cho phép phân tích người ta ghi số băng cắt enzym tính toán kích thước mảnh tạo thành làm sở cho phép phân tích sau Tuy nhiên, nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích phương pháp tách ADN thông thường dẫn đến thay đổi kích thước đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác có mặt plasmid lẫn tạo khác biệt giả kết phân tích, để khắc phục nhược điểm người ta phải thực phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết phân tích Kỹ thuật điện di trường xung điện (điện di trường điện thay đổi, PFGE) - Nguyên tắc: Trước tiên mẫu đưa vào phân tích phải xử lý trước loại enzym cắt hạn chế mà có điểm cắt Kết phải tạo mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước điện di theo phương pháp thông thường mà tách kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis ) Kỹ thuật PFGE lần Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu Tuy nhiên sau có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, có sai khác nhiều sở lý thuyết phương pháp nhau: Mục đích kỹ thuật tăng khả di động mảnh ADN có kích thước lớn điện trường, thành phần gel đệm không thay đổi theo phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theo phương pháp thông thường điện di liên quan đến di động mảnh ADN có kích thước khác gel agarose trường điện không đổi Kết phân tử lớn khó di động phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo tách biệt trường điện di Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả di động lại trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến mảnh ADN có kích thước khác thay đổi hướng di động Như kết mảnh có kích thước khác có khả di động khác Kích thước lớn mức độ di động chậm Sự di động khác ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước gel agarose phương pháp điện di thông thường, hình 1.2 6/10 Phân tích acid nucleic Hình 1.2 Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau xử lý với Sma I với chủng Haemophilus ìnluenzae Tiếp theo mô tả Schwartz va Cantor, Smith Codemine (1990) đề cập đến di chuyển mảnh ADN khác hàm số tuyến tính với kích thước chúng Trên sở điều chỉnh xung điện điện trường Tuy nhiên nhân tố khác có mối tương tác lẫn ảnh hưởng đến khả di động ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose nồng độ ion đệm - Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giống phương pháp chuẩn bị ADN plasmid Một vấn đề thường xảy đứt gãy ngẫu nhiên ADN dẫn đến sai khác kết phân tích Để hạn chế điều người ta phải thực kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT (Schwartz va Cantor – 1984 Smith, Klco 1988) Theo phương pháp hỗn dịch tế bào (dịch nuôi cấy dịch huyền phù) trộn với LMT agarose 37oC Hỗn dịch xử lý với enzym chất tẩy rửa để tách ADN NST khỏi thành, màng tế bào, RNA protein Sau xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease tế bào với proteinase K N-lauroylsarcosine để loại thành phần khác tế bào Kết phần LMT agarose có chứa ADN NST dùng làm mẫu chạy gel 0.5-1.0% (nên làm tan 65oC) đưa lên mẫu chạy gel PFGE, tài liệu Smith (1988) mô tả chi tiết cách chuẩn bị mẫu từ tế bào có thành tế bào: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tế bào thực vật động vật Nói chung với trường hợp có thành tế bào cần đến enzym phá thành tế bào Lượng ADN NST thường dao động khoảng 0.5-20 µg ADN thích hợp Nếu nhiều ADN phân tích được, phát băng ADN kết phân tích Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE giữ năm lạnh có chứa 0.5M EDTA 7/10 Phân tích acid nucleic - Sau thu ADN NST mẫu LMT agarose tiến hành xử lý với enzym giới hạn loại có điểm cắt Tuy nhiên mẫu phải xử lý với PMSF để bất hoạt protein K sau PMSF lại phải loại bỏ sau số lần rửa với chất tẩy rửa EDTA Sau cần phân nhỏ mẫu agarose xử lý với đệm enzym cắt hạn chế qua đêm tube sau toàn mẫu sử dụng để tách trường xung điện Bảng 1.2 liệt kê enzym cắt hạn chế dùng cho phân tích PFGE Bảng 1.2 Một số enzym cắt hạn chế dùng cho kỹ thuật PFGE Enzym Vị trí cắt AatII GACGT/C ApaI GGGCC/C ClaI AT/CGAT MluI A/CGCGT NarI GG/CGCC NheI G/CTAGC NotI GC/GGCCGC NruI TCG/CGA PvuI CGAT/CG SacII CCGC/GG SalI C/TCGAC SfiI GGCC(N)4/NGGCC SmaI CCC/GGG XhoI C/TCGAG Ứng dụng kỹ thuật phân tích PFGE: 8/10 Phân tích acid nucleic Kỹ thuật PFGE sử dụng cho nghiên cứu nhiều đối tượng khác (xem bảng 1.3) Bảng 1.3 Minh hoạ chủng vi sinh vật phân tích dựa kết PFGE thu từ đoạn nhiễm sắc thể Vi sinh vật nghiên cứu Tài liệu tham khảo Acinetobacter baumannii2 Brucella spp3 Campylobacter hyointestinalis4 Campylobacter jejuni5 CADNida arabicans6 CADNida prapsilosis7 Coxiella burnettii8 Enterobacter cloacae9 Enterococcus faecium10.Escherichia coli11.Listeria monocytogenees12 Leptospira spp13.Mycobacterium tuberculosis14.Neisseria meningitidis15.Psedomonas aeruginosa16.Shigella spp17.Staphylococcus aureus18 Streptococci ssp Gouby et al (1992)Allardet, Servent et al (19980Salama et al (1992)Yan et al (1991)Vasquez et al (1991)Carruba et al (1991)Heizen et al (1990)Haertl ADN BADNlow (1993)MirADNa et al (1991)Bohm ADN Karch (1992)Brosch et al (1991)Herrmann et al (1992)Zhang et al (1992)Bygraves ADN Maiden (1992)Boukadida et al (1987)Sodati ADN Piffaretti (1991)Prevost et al (1992)Single ADN Martin (1992) Mỗi đối tượng có đặc trưng riêng kết phân tích PFGE dùng cho nghiên cứu so sánh với tương đồng Đối với nhiều đối tượng có nhiễm sắc thể không thiết phải thực nhiễm sắc thể mà cần số nhiễm sắc thể mà Ví dụ trường hợp C.albicans Monod (1990) cần thực phép phân tích với tổ hợp số nhiễm sắc thể đủ Cho dù theo cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác kết phép phân tích PFGE giống Phép phân tích PFGE ứng dụng cho nghiên cứu mức độ loài với loài Một số điểm cần lưu ý sử dụng kỹ thuật PFGE: + Kỹ thuật đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật kinh nghiệm việc tách nhiễm sắc thể gặp khó khăn số đối tượng vi sinh vật + Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát sai khác nhỏ mẫu, đặc biệt thực với enzym kết giống không chắn hai mẫu giống hoàn toàn Điều có nghĩa kỹ thuật nên dùng để 9/10 Phân tích acid nucleic xác định khác việc xác định giống không đủ tin cậy Tuy nhiên xác định khác mẫu có plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cần xét đến nguồn ADN tạo sai khác giả + Sự khác biệt mẫu phát dùng enzym cắt hạn chế khác Tóm tắt: Phương pháp phân tích plasmid phương pháp dùng phổ biến phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật Việc kết hợp phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn chế tạo phân tích xác với thông tin đáng tin cậy mẫu phân tích Tuy nhiên, phân tích mẫu dựa plasmid cần lưu ý plasmid bị qua hệ phân chia, dẫn đến sai lệch kết nghiên cứu Khi thực phép phân tích PFGE với plasmid lớn khắc phục hạn chế phép phân tích với plasmid nhỏ Phương pháp PFGE dùng rộng rãi phòng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng đối tượng dễ nuôi cấy cho kết tốt hạn chế giá thành thiết bị yêu cầu cao kỹ thuật kinh nghiệm Mặt khác sử dụng enzym cắt hạn chế khó phát mức độ sai khác Như kết hợp phép phân tích plasmid, PFGE lai ADN cho kết tin cậy 10/10 ... 4/10 Phân tích acid nucleic khó di chuyển gel Trong trường hợp so sánh nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước phép phân tích dấu vân tay cho lần phân tích khác Như trình bày trên, phân tích. .. 0.5-20 µg ADN thích hợp Nếu nhiều ADN phân tích được, phát băng ADN kết phân tích Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE giữ năm lạnh có chứa 0.5M EDTA 7/10 Phân tích acid nucleic - Sau thu ADN NST mẫu LMT... Ứng dụng kỹ thuật phân tích PFGE: 8/10 Phân tích acid nucleic Kỹ thuật PFGE sử dụng cho nghiên cứu nhiều đối tượng khác (xem bảng 1.3) Bảng 1.3 Minh hoạ chủng vi sinh vật phân tích dựa kết PFGE