Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn docx

Phương pháp đông khô Freeze drying/ lyophilization: Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới.. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi c

Các phương pháp dùng cho bảo quản vi

khuẩn và xạ khuẩn

Bảo quản vi khuẩn:

a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization):

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài

Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại

NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh)

1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô:

Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên,

cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log

2, Chuẩn bị đệm mẫu:

Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:

+ Đệm huyết thanh- inositol;

Meso-inositol: 5 gam

Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml

Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng

+ Đệm inositol:

Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam

Meso-inositol: 5 gam

Nước cất: đủ 100 ml

Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC

3, Chuẩn bị dịch tế bào:

Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010

(đối với vi sinh vật không có bào tử) Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật

có bào tử Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn

4, Chuẩn bị ống đông khô:

Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường

5, Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:

Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô

6, Bước tiền đông khô:

Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ

7, Tạo chỗ thắt trên ống đông khô:

Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật

sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động

8, Hậu đông khô:

Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1% Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ

9, Hàn ống đông khô:

Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm

và cẩn thận Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô

10, Kiểm tra độ chân không của ống đông khô:

Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm

11, Kiểm tra khả năng sống của mẫu:

Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy

12, Bảo quản mẫu:

Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng

b Phương pháp giữ trong lạnh sâu:

1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log

2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng

độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106

3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ)

Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng

Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết

(-100OC đến -80 OC) Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65OC

4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37 OC trong 40-60 giây) Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản

c Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản trên gelatin và silicagel

Bảo quản xạ khuẩn:

Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó

cần có những phương pháp bảo quản thích hợp

Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường

như cấy truyền, đông khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây, đó là phương pháp bảo quản trong đất

Các bước tiến hành bảo quản trong đất:

1, Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô tại 150 OC trong 6 giờ để làm chết các

vi sinh vật có bào tử và trứng giun nếu có Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh Đất sau khi nghiền được đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút bông và thanh trùng trong 60 phút Trước khi tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24 OC, 28 OC và 37 OC, kiểm tra sau 2-4 ngày

2, Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi ống nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24OC)

trong thời gian 1 tháng Đập nhẹ vào thành ống cho các hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4OC

3, Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp