Luận văn : Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 các nguồn nấm Beauveria basiana có tính độc cao part 5 pdf

37 12 13 4 15 16 17 18 19 20 21 22 Hình 4.3 DNA tổng số ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996. Ghi chú 1. BXD-Q9-9 2. SCL-LA-5 3. DP-BD-1 4. SN-PT-9 5. CC-TD-4 6. BXD-Q9-8 7. SX-DL-9 8. CC-TD-5 9. DTB -9 10. BH-BD-13 11. PUL 2 12. BH-BD-11 13. BH-BD-12 14. DTB-5 15. PUL-BC-6 16. RM-TD-11 17. PUL-Q2-4 18. SCL-LA-3 19. SCL-KG-37 20. SCL-LA-8 21. RN-LA-10 22. SCL-LA-6 Nồng độ agarose: 1 %. Hiệu điện thế: 50 V. Thời gian điện di: 60 phút. Nhận xét: Qua hình 4.2 và 4.3 cho thấy DNA tổng số ly trích theo quy trình ở mục 3.3.2 không sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có các đoạn DNA bị gãy do quá trình nghiền chưa tốt, các đoạn DNA bị gãy thể hiện thành các vệt mờ chạy dọc theo giếng, xuất hiện cả bên trên và bên dưới band DNA tổng số; các nguồn ly trích có nhiều DNA bị gãy gồm: 5, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 20. Các vệt sáng ở cuối các giếng là phần tạp nhiễm do quá trình tinh sạch DNA ly trích chưa tốt, các nguồn ly trích có nhiều tạp nhiễm gồm 5, 6, 10, 11, 13, 15, 16, 20. Như vậy, quá trình nghiền và ly trích ảnh hưởng rất lớn đến mức độ tinh sạch của DNA tổng số thu được. Hầu hết các nguồn ly trích đều có nồng độ DNA tổng số cao trong đó các nguồn 4, 5, 10, 11, 13, 15, 16 có nồng độ DNA tổng số tương đối cao hơn các nguồn còn lại. Tất cả các DNA tổng số 38 nguồn DNA thu được đều phải pha loãng xuống các nồng độ thấp hơn trước khi tiến hành phản ứng PCR. 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 Nghiệm thức 1: Thực hiện phản ứng PCR theo thành phần trình bày ở mục 3.3.3 với nồng độ primer 5 pmol/ l. Kết quả thể hiện ở hình 4.4. 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 4.4 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 5 pmol/ l Ghi chú: 1. PUL-Q2-4 2. SCL-LA-8 3. BH-BD-11 4. SCL-LA-6 5. RN-LA-10 6. SCL-LA-5 7. BH-BD-13 8. PUL2 (đối chứng +) Nồng độ agarose: 1 %. Hiệu điện thế: 50 V. Thời gian điện di: 60 phút. Nhận xét: Qua kết quả ở hình 4.4 cho thấy tất cả 7 nguồn nấm thí nghiệm đều tạo sản phẩm khuếch đại có kích thước 580 bp (nằm gần vị trí band thấp của loading dye khoảng 500 bp) giống với đối chứng dương. Tất cả 8 nguồn nấm khi chạy PCR với nồng độ primer 5 pmol/ l đều có band phụ ở bên dưới band mong muốn. Các band sản phẩm phụ không thể hiện sắc nét như band chính mà hơi nhòe chứng tỏ có một lượng nhỏ hóa chất PCR dư trong phản ứng. Tuy nhiên, ngoại trừ nồng độ primer tất cả các thành phần khác trong master mix đều đã được tối ưu hóa bởi nhà sản xuất nên có thể khẳng định nguyên nhân phản ứng PCR có sản phẩm phụ là do nồng độ primer quá cao. 580 bp 39 Nghiệm thức 2: Thực hiện phản ứng PCR theo thành phần trình bày ở mục 3.3.3 với nồng độ primer 3 pmol/ l. Kết quả thể hiện ở hình 4.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 3 pmol/ l Ghi chú: 1. PUL-BC-3 (đối chứng +) 2. DP-BD-1 3. SCL-KG-37 4. BH-BD-12 5. SN-PT-9 6. PUL-BC-6 7. BXD-Q9-8 8. RM-TD-11 9. Corynespora 10. Đối chứng âm Nồng độ agarose: 1 %. Hiệu điện thế: 100 V. Thời gian điện di: 15 phút. Nhận xét: Tất cả 7 nguồn nấm thí nghiệm đều có sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp (gần vị trí band thấp của loading dye) giống với đối chứng dương. Nấm Corynespora cũng cho sản phẩm khuếch đại với kích thước tương tự chứng tỏ 2 primer ITS4 và ITS5 có thể sử dụng để khuếch đại vùng tương ứng trên nấm Corynespora. Tất cả 9 nguồn nấm thí nghiệm đều có sản phẩm phụ tương tự thí nghiệm 1, sản phẩm phụ của đối chứng âm thể hiện rõ hơn sản phẩm phụ của các nấm thí nghiệm. Như vậy nồng độ primer 3 pmol/ l vẫn còn cao. Nghiệm thức 3: Thực hiện phản ứng PCR theo thành phần trình bày ở mục 3.3.3 với nồng độ primer 0,5 pmol/ l. Kết quả thể hiện ở hình 4.6, 4.7 và 4.8. 40 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ l 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ l 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ l 580 bp 580 bp 580 bp 41 Ghi chú: 1. SCL-KG-37 2. RM-TD-11 3.SCL-LA-5 4. SX-DL-9 5. PUL-BC-4 6. PUL-BC-3 (đối chứng +) 7. DTB-5 8. Paecilomyces 9. Đối chứng âm M: Ladder (100 bp) 10. PUL-Q2-4 11. PUL-BC-6 12. BH-BD-11 13. SCL-LA-8 14. BH-BD-13 15. RN-LA-10 16. DTB-9 17. PUL2 (đối chứng +) 18. Metarhizium 19. Corynespora 20. Đối chứng âm 21. Đối chứng âm 22. SCL-LA-6 23. CC-TD-4 24. SCL-KG-3 25. BXD-Q9-8 26. SN-PT-9 27. BH-BD-12 28. BXD-Q9-9 (đối chứng +) 29. Rhizoctonia Nồng độ agarose: 1,5 %. Hiệu điện thế: 50 V. Thời gian điện di: 70 phút. Nhận xét: Ở lần chạy PCR thứ nhất (hình 4.6), tất cả 6 nguồn nấm thí nghiệm đều có sản phẩm khuếch đại là 580 bp giống với đối chứng dương và phù hợp với kết quả chạy của ladder. Sản phẩm khuếch đại ngoài đoạn DNA mong muốn ra hầu như không có band phụ nhòe bên dưới band sản phẩm chính như hai nghiệm thức 1 và 2, ở vị trí đối chứng âm hầu như không có sản phẩm phụ như trong trường hợp nghiệm thức 2. Nấm Paecilomyces cũng cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 580 bp chứng tỏ không có sự khác biệt về kích thước của vùng được khuếch đại giữa nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces. Như vậy nồng độ primer 0,5 pmol/ l là thích hợp cho phản ứng khuếch đại vùng ITS với 2 primer ITS4 và ITS5. Ở lần chạy PCR thứ 2 (hình 4.7), tất cả 7 nguồn nấm thí nghiệm đều cho sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp và hầu như không có sản phẩm phụ. Nấm Metarizium và nấm Corynespora cũng cho sản phẩm khuếch đại với kích thước tương ứng. Ở lần chạy PCR thứ 3 (hình 4.8), kết quả khuếch đại của 6 nguồn còn lại cũng rất tốt, không có sản phẩm phụ. Nấm Rhizoctonia cho sản phẩm khuếch đại có kích thước lớn hơn của nấm Beauveria bassiana. 42 Như vậy nồng độ primer thích hợp cho việc khuếch đại vùng ITS giữa 2 mồi ITS4 và ITS5 là 0,5 pmol/ l. Nhận xét chung: Nồng độ primer cho kết quả khuếch đại tốt nhất khi sử dụng master mix là 0,5 pmol/ l, tuy nhiên trong sản phẩm khuếch đại vẫn còn một lượng nhỏ hóa chất dư và các sản phẩm ký sinh không thể hiện trên gel nên sản phẩm khuếch đại vẫn cần phải tinh sạch trước khi đọc trình tự. Đã khuếch đại được vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 kích thước khoảng 580 bp của tất cả các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao, với tỷ lệ chết của côn trùng trong điều kiện phòng thí nghiệm là 67 % - 87 % so với các nguồn không được khuếch đại là 50 % - 70 % (Lê Kiều Khánh Vân, 2005). Tất cả các nguồn nấm Beauveria bassiana phân lập từ những địa phương khác nhau và trên các đối tượng ký chủ khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thước giống nhau. Sản phẩm PCR khuếch đại được có thể dùng đọc trình tự trực tiếp làm cơ sở nghiên cứu mối quan hệ giữa vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 với tính độc của các nguồn nấm phân lập từ những địa phương khác nhau và trên các đối tượng ký chủ khác nhau. 4.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Sau khi tiến hành khuếch đại trình tự mong muốn bằng PCR, chọn 2 nguồn PUL-Q2-4 và RN-LA10 tiến hành tinh sạch. Kết quả sau khi tinh sạch được trình bày trong hình 4.9 sau: 1 2 3 4 Hình 4.9 Sản phẩm PCR trƣớc và sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp cắt gel 43 Ghi chú: 1. PUL-Q2-4 chưa tinh sạch 2. PUL-Q2-4 sau khi thinh sạch 3. RN-LA-10 chưa tinh sạch 4. RN-LA-10 sau khi tinh sạch Nồng độ agarose: 0,8 %. Hiệu điện thế: 50 V. Thời gian điện di: 45 phút. Nhận xét: Kết quả ở hình 4.9 cho thấy sản phẩm PCR sau khi tinh sạch có nồng độ thấp hơn sản phẩm PCR trước khi tinh sạch rất nhiều. Nồng độ DNA bị giảm là do trong quá trình tinh sạch có 2 bước tác động tới DNA: cố định DNA trước khi rửa và hòa tan DNA trở lại sau khi rửa. Sau khi tinh sạch, thể tích sản phẩm PCR thu được của mỗi nguồn là 10 l. Trước khi đọc trình tự cần phải pha loãng xuống nồng độ thích hợp. 4.5. Kết quả đọc trình tự 4.5.1. Kết quả đọc trình tự trên máy sequencer ABI PRISM 3100 4.5.1.1 PUL-Q2-4 Kết quả tín hiệu đọc trình tự nguồn PUL-Q2-4 với 2 primer ITS4 và ITS5 thể hiện trong phần phụ lục II và phụ lục III. Nhận xét: Kết quả đọc trình tự với primer ITS4 chỉ có tín hiệu ổn định từ nucleotide thứ 71 trở đi, tín hiệu tiếp tục tốt cho tới nucleotide thứ 424 thì bắt đầu nhiễu. Kết quả đọc trình tự với primer ITS5 chỉ ổn định tín hiệu từ nucleotide 65 trở đi và tín hiệu bắt đầu nhiễu và dừng lại ở nucleotide 390. Kết quả đọc trình tự của cả 2 primer đều không hoàn toàn và có nhiều sai xót nên cần phải sử dụng cả hai trình tự đọc được để so sánh tìm đoạn trình tự đáng tin cậy. 4.5.1.2 RN-LA-10 Kết quả tín hiệu đọc trình tự nguồn RN-LA-10 với 2 primer ITS4 và ITS5 thể hiện trong phần phụ lục IV và phụ lục V. Nhận xét: 44 Tín hiệu đọc trình tự với primer ITS4 hoàn toàn bị nhiễu. Tín hiệu đọc trình tự với primer ITS5 thể hiện tốt từ nucleotide thứ 67 đến nucleotide 475. Vì trình tự với primer ITS4 bị nhiễu nên trình tự cuối cùng được chọn dựa trên vùng đáng tin cậy của trình tự đọc được với primer ITS5. 4.5.2. Kết quả tìm trình tự đáng tin cậy 4.5.2.1. PUL-Q2-4 Kết quả align hai trình tự đọc được với primer ITS4 và primer ITS5 thể hiện như sau: ABI3100_ITS4 GTAATTCACGGGGTAGTCATACCTGATTCGAGGTCAATCTTAGAAGTAAG 50 ABI3100_ITS5 ABI3100_ITS3 GAATAGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTCCCGGTGCGAGCTGTATTA 100 ABI3100_ITS4 ABI3100_ITS4 CTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCG 150 ABI3100_ITS5 ABI3100_ITS4 GTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTT 200 ABI3100_ITS5 TCCCGGTCCCCCCCCCCGACCTCCC-AAGGGGAGGTCGAGGGTT 44 *G*********AA*G**********C****************** ABI3100_ITS4 GAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATG 250 ABI3100_ITS5 GAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATG 94 ************************************************** ABI3100_ITS4 TGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTA 300 ABI3100_ITS5 TGCGTTTAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTA 144 ******C******************************************* ABI3100_ITS4 TCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGT 350 ABI3100_ITS5 TCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGT 194 ************************************************** 71 45 ABI3100_ITS4 TGAAGGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCT 400 ABI3100_ITS5 TGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCT 244 ****A********************************************* ABI3100_ITS4 GGAATACAA-AGTTTGAGGTCCCCGGC CCTGGACAAACCAC 440 ABI3100_ITS5 GGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTC 294 *********G*****************GGGCCG*TG*TC**GT**G*GTC ABI3100_ITS4 ABI3100_ITS5 CGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAGAAGGG 344 ABI3100_ITS4 ABI3100_ITS5 TTAGGGAGTTGAAGAACTCGGTAATGTCCCTCCGCTGGTCACCCAACGGA 394 ABI3100_ITS4 ABI3100_ITS5 AGCCC 399 Ghi chú: dấu * thể hiện sự tương đồng Nhận xét: Sau khi so sánh kết quả align và tín hiệu đọc được với cả 2 primer thì thấy rằng hầu hết các vị trí có trình tự không khớp nhau giữa 2 primer đều có thể chỉnh sửa dựa trên tín hiệu đọc chính xác của primer ITS4 hoặc primer ITS5 (các vị trí chỉnh sửa thể hiện là các nucleotide in đậm ngay bên dưới các sai xót). Dựa trên cả hai lần đọc trình tự chọn được vùng trình tự đáng tin cậy là từ nucleotide thứ 71 của lần đọc thứ nhất đến hết nucleotide thứ 325 của lần đọc thứ hai. Trình tự đọc hoàn chỉnh và đáng tin cậy có kích thước là 411 nucleotide thể hiện dưới đây: ATCGTTGCTT CGGCGGACTC GCCCCAGCCC GGACGCGGAC TGGACCAGCG 50 GCCCGCCGGG GACCTCAAAC TCTTGTATTC CAGCATCTTC TGAATACGCC 100 GCAAGGCAAA ACAAATGAAT CAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGCTC 150 TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAACGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG 200 AATCCAGTGA ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CGCCAGCATT 250 CTGGCGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTT CAACCCTCGA CCTCCCCTTG 300 GGGAGGTCGG CGTTGGGGAC CGGCAGCACA CCGCCGGCCC TGAAATGGAG 350 TGGCGGCCCG TCCGCGGCGA CCTCTGCGCA GTAATACAGC TCGCACCGGG 400 ACCCCGACGC G 411 325 5.8S 5.8S . CC-TD -5 9. DTB -9 10. BH-BD-13 11. PUL 2 12. BH-BD-11 13. BH-BD-12 14. DTB -5 15. PUL-BC-6 16. RM-TD-11 17. PUL-Q 2-4 18. SCL-LA-3 19. SCL-KG-37 20. SCL-LA-8 21. RN-LA-10 22. SCL-LA-6. 6 7 8 Hình 4.4 S n phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 5 pmol/ l Ghi ch : 1. PUL-Q 2-4 2. SCL-LA-8 3. BH-BD-11 4. SCL-LA-6 5. RN-LA-10 6. SCL-LA -5 7. BH-BD-13 8. PUL2 (đối. 25 26 27 28 29 Hình 4.8 S n phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0 ,5 pmol/ l 58 0 bp 58 0 bp 58 0 bp 41 Ghi ch : 1. SCL-KG-37 2. RM-TD-11 3.SCL-LA -5 4. SX-DL-9 5. PUL-BC-4