28 Tổng cộng 20 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR (Wang C. Z., 2002). Giai đoạn 1: 94 0 C trong 3 phút Giai đoạn 2: Bước 1: 94 0 C trong 1 phút Bước 2: 56 0 C trong 30 giây 30chu kỳ Bước 3: 72 0 C trong 1 phút Giai đoạn 3: 72 0 C trong 7 phút 3.3.4. Đánh giá kết quả Sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 0,8 %, dịch đệm TAE 0,5 X. Chạy điện di: 100 V, 250 mA, 25 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide từ trong vòng 15 phút. Kết quả được ghi lại nhờ đọc tia UV và chụp ảnh. 3.3.5. Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS5 Côn trùng nhiễm nấm Phân lập, tách đơn bào tử Nhân sinh khối trong môi trường CZA Thu sợi nấm Ly trích DNA Thực hiện phản ứng PCR Hóa chất: Master mix Primer ITS4 Primer ITS5 DNA khuôn Nước cất Chu kỳ nhiệt: 94 0 C/3 phút 94 0 C/1 phút 56 0 C/30 giây 72 0 C/1 phút 72 0 C/7 phút 30 chu kỳ 29 Hình 3.1 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS5 3.3.6. Bố trí thí nghiệm trong phản ứng PCR Mục tiêu: Xác định nồng độ primer tối ưu cho master mix để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2. Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức: Nghiệm thức 1: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 5 pmol/ l. Thí nghiệm được bố trí với 7 nguồn nấm: PUL-Q2-4, SCL-LA-8, BH-BD-11, SCL-LA-6, RN-LA- 10, SCL-LA-5, BH-BD-13 và một đối chứng dương là nguồn PUL2 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS4 và ITS5. Nghiệm thức 2: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 3 pmol/ l . Thí nghiệm được bố trí với 7 nguồn nấm: DP-BD-1, SCL-KG-37, BH-BD-12, SN-PT-9, PUL-BC- 6, BXD-Q9-8, RM-TD-11. Đối chứng dương là nguồn PUL-BC-3 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS3 và ITS4, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng. Ngoài ra, nấm Corynespora cũng được bố trí chạy chung quy trình PCR để so sánh kích thước đoạn khuếch đại của nấm này so với các nguồn Beauveria bassiana thí nghiệm. Nghiệm thức 3: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 0,5 pmol/ l. Bố trí thí nghiệm lần thứ nhất với 6 nguồn: SCL-KG-37, RM-TD-11, SCL-LA-5, SX-DL-9, PUL-BC-4, DTB-5, đối chứng dương là PUL-BC-3, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được tiến hành với nấm Paecilomyces để thử khả năng khuếch đại của 2 primer ITS4 và ITS5 trên nấm này. Sau khi kiểm tra kết quả và xác định primer đã đạt nồng độ tối ưu, tiếp tục chạy PCR với các nguồn còn lại với nồng độ primer trên. Chạy PCR lần thứ 2 theo nghiệm thức trên với 7 nguồn: PUL-Q2-4, PUL-BC- 6, BH-BD-11, SCL-LA-8, BH-BD-13, RN-LA-10, DTB-9. Đối chứng dương là PUL2, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với 2 nấm Metarhizum và Corynespora. Chạy PCR lần thứ 3 theo nghiệm thức trên với 6 nguồn: SCL-LA-6, CC-TD-4, SCL-KG-3, BXD-Q9-8, SN-PT-9, BH-BD-12. Đối chứng dương là BXD-Q9-9, đối chứng âm là nước cất hai lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với nấm Rhizoctonia. 30 3.4. Đọc trình tự sản phẩm PCR 3.4.1. Chuẩn bị khuôn DNA 3.4.1.1. Tinh sạch sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dư thừa cũng như các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện được. Quy trình tinh sạch gồm các bước như sau: Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose). Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lượng. Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao tác này được tiến hành dưới tia UV trong phòng tối), cắt càng xát band chứa DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã được cân từ trước, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn. Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lượng của miếng gel. Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh sạch là 300 l buffer và 300 mg gel). Vortex nhẹ và ủ ở 60 0 C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thường khoảng 10 - 15 phút. Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube. Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu xuống phần đáy của ependorf. Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy nhẹ theo thành column). Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây. Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào collection tube trở lại. Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây. Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã được làm lạnh. 31 Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch. 3.4.1.2. Định lƣợng DNA tinh sạch DNA sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P. Curran, 2002). Sản phẩm PCR Lượng 100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1000-2000 bp 1-3 ng 3-10 ng 5-20 ng 10-40 ng 3.4.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) 3.4.2.1. Thành phần hóa chất Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự được thể hiện trong bảng sau: Bảng 3.4: Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự Thành phần Lƣợng BDT mix 4 l Buffer 2 l DNA khuôn (580bp) 1 l Primer 1 l Nước khử ion 2 l Tổng số 10 l 32 3.4.1.2.Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự Đặt các ống tube vào Thermal cycler và cài đặt thể tích 10 Làm nóng các ống tube ở 95 0 C trong 5 phút Bước 1:95 0 C trong 30 giây Bước 2: 50 - 55 0 C trong 10 giây 25 chu kỳ Bước 3: 60 0 C trong 4 phút Hạ nhiệt độ xuống 4 0 C và duy trì cho tới khi tinh sạch. 3.4.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại Mục đích của việc tinh sạch là để loại bỏ dye terminator còn dư trước khi điện di. Phương pháp tinh sạch (Trung tâm phân tích hóa sinh) Bổ sung 5 l EDTA 125 mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm PCR. Spin nhẹ. Thêm vào 60 l ethnol 100 %. Ủ tại nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 4500 vòng/phút trong 45 phút Thu tủa sau đó rửa tủa bằng 60 l ethanol 70 %. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại dịch thu cặn. Làm khô bằng máy speed vac. Thêm vào 10 l Hidiformamide. Biến tính ở 95 0 C trong 3 phút. 3.4.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại được load vào các cột mao dẫn chứa polymer để điện di phân tích kết quả. Kết quả thu được từ tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận bằng phần mềm của máy sequencer. 33 3.4.5. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR. 3.4.6. Bố trí thí nghiệm tinh sạch, đọc trình tự và phân tích kết quả Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 nguồn RN-LA-10 và PUL-Q2-4. Tiến hành đọc trình tự với 2 primer ITS4 và ITS5. Trình tự đọc bằng primer ITS4 và primer ITS5 được so sánh bằng phần mềm Clustal và chọn trình tự đọc đáng tin cậy nhất. So sánh trình tự PUL-Q2-4 và RN-LA-10 bằng phần mềm Clustal, tìm sự khác biệt. So sánh trình tự PUL-Q2-4 với trình tự tương ứng của vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 trên 6 nguồn nấm Beauveria bassiana ký sinh trên nhiều đối tượng ký chủ chọn ngẫu nhiên trong cơ sở dữ liệu của NCBI. So sánh sự tương đồng bằng phần mềm Clustal và tìm những khác biệt giữa 2 nguồn nấm thí nghiệm với trình tự các nguồn còn lại. Dùng phần mềm Treeview vẽ diagram của 8 nguồn nấm dùng trong so sánh và đánh giá kết quả. Sản phẩm PCR Tinh sạch GFX PCR DNA and gel band Purification kit Phản ứng đọc trình tự Hóa chất: BDT mix Buffer DNA khuôn Primer Nước khử ion Chu kỳ nhiệt: 95 0 C/5 phút 95 0 C/30 giây 55 0 C/10 giây 60 0 C/4 phút 25 chu kỳ Tinh sạch Điện di, ghi nhận tín hiệu 34 Bảng 3.5 Các nguồn nấm dùng trong so sánh (Coates Brat S., 2002) Ký hiệu Dòng phân lập Ký chủ Nơi phân lập AF322924 AF322927 AF322928 AF322929 AF322930 AF322932 Bb 153 Bb 1022 Bb1149 Bb 1155 Bb 2515 Bb 3167 Chrysopa sp. (Neuroptera) O. nubilalis (Lepidoptera; Crambidae) Sitona discoideus (Lepidoptera; Noctuidae) Diabrotica speciosa (Coleoptera; Chysomelidae) Diabrotica speciosa (Coleoptera; Chysomelidae) Diuraphis noxia (Homoptera Aphididae) Mỹ Mỹ Tây Ban Nha Moracco Mexico Thổ Nhĩ Kỳ 35 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và nhân sinh khối nấm trong môi trƣờng CZA Ủ sâu nhiễm nấm, phân lập nấm trên môi trường PDA. Sau 10 ngày, quan sát sợi nấm và cách mọc bào tử dưới kính hiển vi. Hình 4.1 Hình dạng và cách mọc bào tử của Beauveria bassiana chụp dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần Kết quả phân lập: Phân lập được một nguồn nấm Beauveria bassiana mới, ký hiệu SCL-KG. Tiến hành tách đơn bào tử trên lame trang Agar đã tách được 40 bào tử, cấy chuyền các bào tử đơn sang môi trường giữ giống, ký hiệu từ SCL-KG1 đến SCL-KG- 40. Chọn dòng SCL-KG-3 và SCL-KG-37 tiến hành nhân trong môi trường lỏng để tiếp tục nghiên cứu. Kết quả nhân sinh khối Sau khi nuôi cấy sợi nấm trong môi trường CZA ở 27 o C lắc ở 120 vòng/phút trong vòng 1 tuần, kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.1. 36 Bảng 4.1 Khối lƣợng sợi nấm sau khi nhân trong môi trƣờng lỏng STT Nguồn Khối lƣợng (g) STT Nguồn Khối lƣợng (g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 BXD-Q9-9 SCL-LA-5 DP-BD-1 SN-PT-9 CC-TD-4 BXD-Q9-8 SX-DL-9 CC-TD-5 DTD-9 BH-BD-13 PUL 2 1,05 1,69 0,54 2,04 0,87 2,12 1,45 1,34 1,65 2,23 1,69 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 BH-BD-11 BH-BD-12 DTB-5 PUL-BC-6 RM-TD-11 PUL-Q2-4 SCL-LA-3 SCL-KG-37 SCL-LA-8 RN-LA-10 SCL-LA-6 0,87 2,12 0,54 1,34 1,52 1,22 1,67 2,13 1,43 0,30 1,32 Nhận xét: Qua bảng 4.1 cho thấy tất cả các nguồn nấm thí nghiệm đều có khả năng tạo sợi nấm trong môi trường lỏng CZA. Nguồn nấm BH-BD-13 cho khối lượng cao nhất với khối lượng là 2,23 g. Nguồn nấm RN-LA-10 cho khối lượng thấp nhất với khối lượng là 0,3 g. 4.2. Kết quả li trích DNA tổng số các nguồn nấm Beauveria bassiana Tiến hành ly trích DNA của 22 nguồn đã được nhân sinh khối, kết quả thể hiện trong hình 4.2 và 4.3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Hình 4.2 DNA tổng số ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996. DNA tổng số . lỏng STT Nguồn Khối lƣợng (g) STT Nguồn Khối lƣợng (g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 BXD-Q 9-9 SCL-LA-5 DP-BD-1 SN-PT-9 CC-TD -4 BXD-Q 9-8 SX-DL-9 CC-TD-5 DTD-9 BH-BD-13 PUL. 0, 54 2, 04 0,87 2,12 1 ,45 1, 34 1,65 2,23 1,69 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 BH-BD-11 BH-BD-12 DTB-5 PUL-BC-6 RM-TD-11 PUL-Q 2 -4 SCL-LA-3 SCL-KG-37 SCL-LA-8 RN-LA-10. PUL-Q 2 -4 với trình tự tương ứng của vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 trên 6 nguồn nấm Beauveria bassiana ký sinh trên nhiều đối tượng ký chủ chọn ngẫu nhiên trong cơ s dữ liệu của NCBI. So s nh s