19 2.4.3. Đọc trình tự sản phẩm PCR Có hai phương pháp đọc trình tự sản phẩm PCR: Một là, người ta sẽ tạo ra các dòng phụ (subclone) của sản phẩm PCR sau đó đọc trình tự các subclone này. Hai là, đọc trình tự sản phẩm PCR một cách trực tiếp, phương pháp này là một cải tiến kỹ thuật rất quan trọng trong phân tích genome. Phương pháp này được ưa thích sử dụng hơn vì người nghiên cứu có thể nhanh chóng có được đặc điểm của trình tự của đối tượng nghiên cứu mà không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone. 2.5. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về nấm Beauveria bassiana 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc Ở nước ta kể từ năm 1990 đến nay, các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana chủ yếu là các nghiên cứu về công nghệ sản xuất các chế phẩm từ nấm và hiệu suất phòng trừ côn trùng của chúng. Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nước ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 10 8 bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo phương pháp này là 10 ngày, chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45 o C trong 8 giờ và có thể được bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phương pháp lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 10 9 bào tử/gam. Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lưng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 10 8 bào tử/ml. Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm. Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phương pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao. Từ các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập được 9 chủng nấm Beauveria bassiana từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia. 20 Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da láng nhưng ở các mức độ khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10 % số củ khoai lang bị hà (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế phẩm Bemetent (được phối từ 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa. 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập từ New Zealand bằng hai phương pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập được thành 4 nhóm có kiểu di truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhóm B. bassiana, nhóm B. brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền giữa giống B. bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii. Hegedus và cộng sự (1998) đã giải toàn bộ vùng gen mã hóa SSU-RNA của ti thể nấm Beauveria bassiana. Khi so sánh trình tự này với các trình tự ở vùng tương tự của nấm sợi thì thấy có sự khác biệt lớn. Các kết quả từ việc phân tích cây phát sinh loài cho thấy nấm Beauveria bassiana có mối liên hệ chặt chẽ với nấm bột hơn là nấm túi, kết quả này không giống với các kết quả so sánh trước đó tiến hành ở nấm sợi. Theo Wang C. – Z., Li Z. – Z. và Butt T. M. (2002), các dòng đơn bào tử của nấm Beauveria bassiana là Bb 123 (phân lập từ Ammophila sp.) và Bb 151 (phân lập từ Brachyderes incanus) có thể được phân biệt dựa vào marker phân tử là một đoạn intron trong vùng 11 của 28 S rDNA. Khi sử dụng hai primer I21 và I22 để khuếch đại vùng 11 này thì sản phẩm khuếch đại của hai dòng này có kích thước không bằng nhau. Kết quả đọc trình tự cho thấy một trong hai đoạn khuếch đại có thêm một vùng intron 405 bp, đoạn intron này cũng có thể được phân biệt bằng phương pháp RAPD 21 với các primer : OPA - 03, OPA - 08, OPA - 11, OPA - 13, OPB - 07, OPE - 01, OPE - 04. Thử nghiệm chủng đồng thời hai dòng nấm này trên Galleria mellonella cũng như trên môi trường nhân tạo sau đó phân tích kết quả bằng RAPD cho thấy luôn luôn có một dòng chiếm ưu thế hơn dòng còn lại. Hơn nữa, sự nhiễm đồng thời hai dòng lên cùng ký chủ dẫn đến việc tạo ra các thể dị nhân, tuy nhiên các thể dị nhân này thường không ổn định và có khuynh hướng trở lại dạng bình thường giống dòng mẹ sau nhiều lần cấy chuyền. Các phân tích ở mức độ phân cũng cho thấy không có sự tái tổ hợp ở các dòng phân tách từ ký chủ thí nghiệm nhiễm đồng thời hai dòng nấm trên. Talaei - hassanloui và cộng sự (2002) đã so sánh trình tự đoạn gen mã hóa RNA ribosom 5.8 S, vùng ITS và vùng gen mã hóa các yếu tố kéo dài trong quá trình phiên mã của 10 nguồn Beauveria bassiana khác nhau. Kết quả so sánh trình tự của vùng ITS1 - 5.8 S - ITS2 gồm 595 nucleotide của 10 nguồn nấm trên cho thấy chỉ có 0,16 - 1,77 % trình tự là có sự biến đổi. Sử dụng phần mềm UPGMA xác định được 10 nguồn trên thuộc 3 nhóm khác nhau, các nhóm này có liên quan nguồn gốc nơi nấm được phân lập. Ngoài ra, kết quả so sánh trình tự gene tef-1a mã hóa cho protein chỉ ra rằng có 1,8 % trình tự có sự thay đổi và dựa trên trình tự gen này cũng có thể chia 10 nguồn trên thành 3 nhóm kiểu gen khác nhau, các nhóm kiểu gen này có liên quan tới vùng phân bố của các nguồn nấm thu thập được. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy không có mối liên hệ ý nghĩa giữa các kiểu gen của nấm Beauveria bassiana với đặc tính gây bệnh trên các côn trùng như Plutella xylostella, Leptinotarsa decemineata, côn trùng cánh cứng hại khoai tây. Shih HL và cộng sự (2002) đã giải trình tự hoàn toàn gene mã hóa 5.8 S rDNA và vùng ITS lân cận 2 dòng Beauveria bassiana. Sự giống trên toàn vùng trình tự giải được của hai dòng này là 96 %. Sự giống nhau ở vùng ITS1 là 96 %, vùng ITS2 là 100 %. Sự tương đồng của hai vùng trình tự gen mã hóa 5.8 S rRNA là 98 %. Theo Eiji và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vùng intron nhóm 1 trong trình tự rDNA mã hóa tiểu đơn vị ribosom (SSU rDNA) của nấm Beauveria bassiana và chỉ ra rằng tổ tiên của Cordicepts prolifera và C. kanzashiana có được các vùng intron trong trình tự rDNA là do nhận được từ các nấm khác. Khi tiến hành đọc trình tự của SSU rDNA cua nấm Beauveria bassiana và các nấm có liên quan thì thấy có sự đa hình xảy ra giống như sự đa hình giữa các dòng Beauveria bassiana. Sự đa hình này xảy ra do có sự chèn các intron nhóm 1 vào trình tự. 22 Theo Martin Kendall J and Rygiewicz Paul T (2005), các vùng ITS của rDNA nấm có sự thay đổi lớn trong trình tự, trên cơ sở các khác biệt trong trình tự này có thể phân biệt các loài nấm nhờ phản ứng PCR. Hai primer ITS1 và ITS2 thường được sử dụng để khuếch đại vùng gen 5,8 S tạo các đoạn khuếch đại kích thước không giống nhau giữa các loài. 23 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm Đề tài được tiến hành từ 28/2/2005 - 30/7/2005 tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật - Khoa Nông học và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật - Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh. 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu Bảng 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Ký chủ Nơi thu thập Tên khoa học Ký hiệu Nguồn tham khảo Rệp vảy mềm nâu tím Bình Chánh Quận 2 Pulvinaria sp. (Coccidae-Homoptera) PUL-BC PUL-Q2 1 1 Sâu cuốn lá nhỏ Long An Kiên Giang Cnaphalocrosis medinalis G. (Pyralidae-Lepidoptera) SCL-LA SCL-KG 1 2 Bọ xít đen Quận 9 Scotinophora spp. (Pentatomidae-Hemiptera) BXD-Q9 1 Bọ hà Bình Dương Cylas formicalus (Curculionidae-Coleoptera) BH-BD 1 Cào cào Thủ Đứ Oxya sp. (Acrididae-Orthoptera) CC-TD 1 Rầy mềm Thủ Đức Pulvinaria sp. (Coccidae-Homoptera) RM-TD 1 Sâu đục thân bắp Thủ Đức Ostrinia furnacalis H. (Pyralidae-Lepidoptera) DTB 1 Sâu xanh da láng Bình Dương Spodoptera exigua H. (Noctuidae-Lepidoptera) DP-BD 1 Bọ Trĩ Phan Thiết Thrips SNPT 1 Sâu xanh Bình Dương Spodoptera litura Fab. (Noctuidae-Lepidoptera) SX-BD 1 Rầy nâu Long An Nilaparvata lugens RN-LA 1 Nhiều chủng nấm khác 24 Ghi chú: Nguồn tham khảo (1): Lê Thị Kim Thoa, 2004. Nguồn tham khảo (2): Mới thu thập và phân lập. . 3.2. Phân lập và nhân sinh khối các nguồn Beauveria bassiana 3.2.1. Hóa chất và dụng cụ 3.2.1.1. Hóa chất Môi trường sử dụng: Agar, PGA, CZA Bảng 3.2 Thành phần môi trƣờng phân lập và nhân nấm Môi trƣờng agar (1 lít) Môi trƣờng PGA (1lít) Môi trƣờng CZA (0,5 lít) Agar: 15 g Nước cất một lần: 1 lít Khoai tây: 200 g Đường glucose: 17 g Agar: 15 g Nước cất một lần Glucose: 15 g Yeast extract: 2,5 g NaNO 3 : 1,5 g K 2 HPO 4 : 0,5 g MgSO 4 .7H 2 O: 0,25 g Nước cất 2 lần: 500 ml pH: 6 - 6,5 3.2.1.2. Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri, đèn cồn, các loại que cấy, lame, lamel, kính hiển vi, cân phân tích, giấy lọc, giấy bạc. 3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm Cách nấu môi trường agar: đong 1 lít nước cất một lần nấu sôi, cho 15 g agar vào đun cho đến khi agar tan hoàn toàn, rót vào bình tam giác, hấp vô trùng ở 121 o C, 1 atm trong 25 phút. Cách nấu môi trường PGA: gọt vỏ khoai tây, rửa sạch, cắt nhỏ, cho vào nước cất đang sôi, nấu khoảng 25 phút, lọc bỏ khoai tây và thêm nước cất cho đủ 1 lít, đun sôi trở lại, cho agar và agarose vào, tiếp tục đun sôi cho đến khi agarose và agar tan hoàn toàn, rót môi trường vào bình tam giác đem hấp vô trùng, đổ đĩa petri. Nấm từ mẫu côn trùng chết được phân lập bằng môi trường PGA và agar (Nguyễn Thị Bích Lập, 2005). 25 Đặt côn trùng nhiễm nấm trên một lame sạch và chuyển vào một đĩa petri có sẵn lớp giấy ẩm, để ở nhiệt độ phòng trong 3 - 7 ngày. Sau khi nấm phát triển mạnh và tạo thành một lớp bột trắng phủ đầy trên mình côn trùng, dùng que cấy chấm bào tử cấy 3 điểm vào môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. Quan sát cách mọc bào tử của nấm dưới kính hiển vi, khi đã khẳng định nấm được phân lập là Beauveria bassiana thì tiến hành tách đơn bào tử. Đặt các lame sạch vào đĩa petri, hút 1 ml môi trường agar cho vào lame và trang thành một lớp mỏng. Dùng nước cất 2 lần vô trùng để pha loãng bào tử nấm. Hút 10 ml nước cho trực tiếp vào đĩa nấm, quan sát mật độ bào tử dưới kính hiển vi và pha loãng tới mật độ thích hợp thuận lợi cho quá trình tách đơn bào tử. Hút 0,1 ml dịch bào tử chuyển lên lame agar đã chuẩn bị, dùng que cấy tam giác trang đều cho đến khi bề mặt agar khô hoàn toàn. Sau 12 giờ, quan sát lame agar dưới kính hiển vi, tìm vị trí bào tử mọc thưa, cắt phần agar chứa từng bào tử đơn chuyển sang môi trường PGA. 3.2.3. Phƣơng pháp nhân sinh khối Nấm sau khi phân lập được tiến hành nhân sinh khối trong môi trường CZA (Rakotonirainy, 1991). Cách nấu môi trường CZA: Đong 0,5 lít nước cất 2 lần cho vào becher 1 lít, đặt lên máy khuấy từ ở 100 o C. Cho yeast extract vào khuấy tan, tiếp tục cho các muối NaNO 3 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 .7H 2 O khuấy cho đến khi các muối này tan hoàn toàn thì ngưng, để nguội và đo pH, rót 80 ml môi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml, hấp vô trùng ở 121 o C trong vòng 30 phút. Các dòng nấm sau khi tách đơn bào tử đem nuôi cấy trên môi trường PGA trong đĩa petri, sau khi nấm mọc được 15 ngày tuổi dùng que cấy mốc nhúng ướt hớt ngang bề mặt khuẩn lạc để thu bào tử chuyển sang môi trường lỏng CZA, lắc 120 vòng/phút ở 27 o C trong 1 tuần, thu sợi nấm, phơi khô, gói vào giấy bạc và bảo quản ở -70 o C. 26 3.3. Khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao 3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm dùng trong phản ứng PCR 3.3.1.1. Hóa chất Master mix 2X (Sapphire) Các primer: 2 primer sử dụng trong nghiên cứu là ITS 4 và ITS 5 (Biorad), được thiết kế để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana. Trình tự của các primer: Primer Trình tự (5’ - 3’) IT S 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG DNA marker (Biorad) Nước cất Ethidium bromide Dịch đệm TAE 0,5 % Loading buffer 6X, agarose 3.3.1.2. Dụng cụ thí nghiệm Cối, chày Cân điện tử Ependorf các loại: 0,2 l, 0,3 l, 1,5 l Micropipet và các loại đầu típ Waterbath Máy Thermo cycle DNA - photography equipment UV transilluminator Máy điện di Máy li tâm Máy vortex Tủ cấy 27 3.3.2. Chuẩn bị khuôn DNA DNA từ các nguồn nấm đã nhân sinh khối được ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996 Nghiền phần sợi nấm thu được trong dung dịch nitơ lỏng cho đến khi sợi nấm chuyển sang dạng bột trắng, mịn Chuyển bột nấm vào ống eppendoft 1,5 ml Thêm 600 l lysis buffer, lắc mạnh tay hoặc vortex. Ủ ở 65 0 C trong 1 giờ Thêm 600 l hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), lắc nhẹ, ly tâm 14000 vòng/phút ở 28 0 C trong vòng 20 phút. Thu phần dịch nổi (nếu dịch nổi chưa trong có thể ly tâm lại với cùng tốc độ thêm một thời gian ngắn) Thêm 0,03 V sodium acetate và 0,5 V isopropanol, đảo nhẹ, ly tâm 14000 vòng/phút ở 28 0 C trong 5 phút, thu phần tủa trắng Rửa sạch DNA ba lần bằng ethanol 70 %, mỗi lần dùng 150 l Phơi khô DNA cho đến khi phần tủa chuyển sang màu trắng trong, hòa tan trong 50 l dung dịch TE 1X, ủ ở 55 0 C trong bồn ủ nhiệt cho đến khi phần tủa trắng tan hoàn toàn trong dung dịch TE 1X giữ ở 4 0 C hay – 20 0 C cho tới khi sử dụng 3.3.3. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR và chu kỳ phản ứng PCR Thành phần hóa chất Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR Thành phần Liều lƣợng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối + Master mix 10 2X 1X dNTP 0,4 mM 0,2 mM MgCl 2 3 mM 1,5 mM Tag DNA polymerase 1 U 1U +Primer 1 1 100 pmol/ l +Primer 2 1 100 pmol/ l +Khuôn DNA 1 100 ng/ l 5 ng/ l +Nước cất 7 . cứu là ITS 4 và ITS 5 (Biorad), được thiết kế để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana. Trình tự của các primer: Primer Trình tự (5’ - 3 ) IT S 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC. của SSU rDNA cua nấm Beauveria bassiana và các nấm có liên quan thì thấy có s đa hình xảy ra giống như s đa hình giữa các dòng Beauveria bassiana. S đa hình này xảy ra do có s chèn các. Hegedus và cộng s (1998) đã giải toàn bộ vùng gen mã hóa SSU-RNA của ti thể nấm Beauveria bassiana. Khi so s nh trình tự này với các trình tự ở vùng tương tự của nấm s i thì thấy có s khác