Luận văn : Xác định các thành phần chủ yếu trong cà phê nhân, tạo chế phẩm Biocoffee-1 với hoạt tính cao của pectinase và cellulase part 3 pot

Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu bia, thức ă

Trong thực vật, pectin có chức năng tự nhiên như một chất keo để giữ thành tế bào cũng như các tế bào lại với nhau Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da

Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác Pectin tan trong nước, NH3, dung dịch kiềm, Na2CO3 và trong glycerin nóng

2.4.2 Cấu trúc

Hình 2.7: Cấu trúc hóa học của phân tử pectin 2.4.3 Phân loại

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng:

o Pectin hòa tan: là ester methylic của acid polygalacturonic

o Pectinic acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol

o Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước Trong thành phần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải

phóng pectin hòa tan

2.5 CELLULOSE [12], [13], [23], [30]

Mỗi năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ quá trình quang hợp Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành trên đất liền và 60 tỷ tấn

được tạo thành ở trong các đại dương Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ

Ligno-cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ,…) gồm cellulose, hemicellulose và lignin

2.5.1 Định nghĩa

Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị -D-glucose được nối với nhau qua liên kết -D-1,4-glucan Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril (vi sợi) có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình)

2.5.2 Cấu trúc

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau bằng lực hút Vanderwall và liên kết hydro Chúng tạo nên sợi sơ cấp, sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi

Hình 2.8: Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật 2.5.3 Tính chất

Cellulose có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 2.500.000 Da

Cellulose thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường

Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc

ở nhiệt độ 40 – 50o

C nhờ các enzyme thủy phân cellulose – được gọi chung là cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí lẫn yếm khí Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và thường không triệt để

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20 – 40% trọng lượng khô) là một loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl Do bản chất không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân Cellulose còn liên kết chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô) Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose tồn tại ở trạng thái một polymer gần tinh khiết

Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy, bột giấy,…

2.5.4 Vị trí

Cellulose là nguồn hữu cơ nhiều nhất trong thực phẩm, chất đốt và hóa chất Cellulose tồn tại một lượng rất lớn trong thực vật, không đều ở các cơ quan khác nhau, ít nhất ở lá và nhiều nhất là ở thân cây

Sự hiện diện của cellulose đóng vai trò là một vật liệu phổ biến của vách tế bào thực vật được phát hiện lần đầu tiên bởi Anselm Payen vào năm 1838 Nó tồn tại ở hầu hết những hình thức nguyên trong sợi cotton và trong tổ hợp với những vật liệu khác, như lignin và hemicellulose, trong gỗ, lá và thân … Mặc dù, nhìn chung được xem như vật liệu thực vật nhưng cellulose cũng được sản xuất bởi một số vi khuẩn

Cellulose là nền tảng bộ xương của thành tế bào thực vật Ngoài ra người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (cellulose ở vi sinh vật thuộc loại

vô định hình, việc phân hủy thường dễ thực hiện) Cellulose không có trong tế bào động vật

TÌM HIỂU VỀ HỆ ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE

2.6 ENZYME [12], [13]

Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấm men

Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ thể Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein

Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể

Pavlov đã nói: “Hoạt động của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống Không có sự sống nào lại không có quá trình enzyme” Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hoá học xảy ra trong cơ thể sống, bảo đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng cân đối, theo những chiều hướng xác định Enzyme bảo đảm cho sự trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là bảo đảm điều kiện tiên quyết cho sự tồn tại của

cơ thể sống

Enzyme không những hoạt động xúc tác trong tế bào mà còn ngoài tế bào sinh vật, chính điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzyme vào nhiều lĩnh vực khác của công nghiệp và đời sống

Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, hoạt độ xúc tác của enzyme lớn gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Ví

dụ như trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm xúc tác tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2 ×1012 lần so với khi dùng acid làm xúc tác

Điều quan trọng là enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh

lý Hơn nữa enzyme lại có khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng

Vì enzyme là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hóa học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật

Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau: động vật (pepsin từ dạ dày, trypsin từ tụy tạng….), thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…) Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme với qui mô công nghiệp vì những lí do như khó tìm, tốc độ sinh sản chậm, đắt tiền,… Mặc dù vậy, người ta có thể tận dụng phế phẩm từ hai nguồn này làm môi trường và thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật cho sản xuất enzyme

Trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn Vi sinh vật là giới sinh vật được xem như nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất Hiện nay người ta khai thác enzyme nhiều từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất

Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Vi sinh vật có thể đồng hóa bất

kỳ chất nào trong thiên nhiên, trong khi có nhiều chất mà động vật và thực vật không thể đồng hoá được

Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Do vậy chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hoá một lượng lớn cơ chất Người ta tính rằng trong 24 giờ, vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng thức ăn gấp

30 – 40 lần so với trọng lượng cơ thể của chúng

Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, tuy khối lượng nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu nhận được một khối lượng enzyme rất lớn Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme

Phần lớn thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và rẻ tiền Đa số vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản rẻ tiền như các phế phụ liệu, phế phẩm của các ngành sản xuất

Ưu điểm lớn của việc thu nhận enzyme từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường sinh tổng hợp các enzyme nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dưỡng Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzyme cũng

như hoạt tính của chúng và gia tăng tối đa quá trình sinh tổng hợp Điều đó cho phép ta

có thể tạo được những enzyme theo ý muốn, dễ dàng thu nhận được enzyme có độ thuần khiết cao

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học, đặc biệt trong lĩnh vực sinh học nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, cùng với nhu cầu enzyme trong các ngành công nghiệp ngày càng cao, phương pháp sinh tổng hợp enzyme ngày càng được áp dụng rộng rãi, và có hiệu quả trong nhiều nước trên thế giới Nhật Bản là một trong những quốc gia đi đầu trong lĩnh vực này, ở Nhật đã có hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme Mỗi năm Nhật sản xuất khoảng 9850 tấn amilase, 8960 tấn protease, 2200 tấn glucoamilase, 100 tấn lipase, 200 tấn enzyme khác…Ở các nước phát triển như Đức, Hungari, Nga, Pháp, Anh, Đan Mạch, Trung Quốc…ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh

2.7 PECTINASE [12], [13], [39]

2.7.1 Định nghĩa

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả

2.7.2 Ứng dụng

Pectinase được tạo ra trong suốt quá trình chín tự nhiên của một số quả (cùng với cellulase), chúng giúp làm mềm thành tế bào của quả

2.7.3 Phân loại

Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng

o Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester

o Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4-glycoside

 Polymethylgalacturonase: hay còn gọi là -1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalacturonic acid đã được methoxyl hóa Enzyme này lại được phân thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu I và exo-glucosidase-endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III

 Polygalacturonase: enzyme tác dụng trên pectic acid (hoặc pectinic), cũng được chia thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV

o Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hóa Các enzyme vi sinh vật ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật

Ngoài ra còn có:

o Pectin-transeliminase

o Polygalacturonate-transeliminase

o Pectin lyase (PNL)

2.7.4 Chức năng

Pectinase làm đứt trạng thái gắn chặt giữa những phân tử acid galacturonic để làm ngắn chuỗi pectin từ những đoạn lớn thành những đoạn nhỏ hơn

Cơ chế xúc tác của pectinase sử dụng nước, vì thế pectinase được xem là một enzyme thủy phân Nó cắt đứt phân tử nước, gắn –H vào một C và gắn –OH vào một C khác

Hình 2.9: Hoạt động của pectinase 2.7.5 Các vi sinh vật tổng hợp pectinase

o Nấm mốc

 Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Aspergillus terrus, Aspergillus saitoi

 Fusarium moniliforme

 Penicillium glaucum, Penicillium ehrlichii, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam, Penicillium cilrrimim,…

o Nấm men

 Saccharomyces fragilis

o Vi khuẩn

 Bacillus polymyxa

 Flavobacterium pectinovorum

 Klebsiella aerogenes,…

Ngoài ra, pectinase cũng được tiết ra bởi một số mầm bệnh cây trồng như:

o Nấm Monilinia fructigena

o Vi khuẩn gây thối rữa Enwinia carotovora

2.8 CELLULASE [12], [13], [26], [34]

2.8.1 Định nghĩa

Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase C1 đến cellulase Cx và -glucosidase Chúng sẽ phân hủy lần lượt cellulose để cuối cùng tạo ra sản phẩm đường glucose

2.8.2 Tính chất

Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng 40 – 60oC, pH nằm trong khoảng 4 – 7

Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose

Hg ức chế hoàn toàn cellulase, trong khi các ion như Mn2+

, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ

Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 80o

C

2.8.3 Ứng dụng

Hiện nay, cellulase từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô công nghiệp và được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau Các ứng dụng quan trọng nhất có thể

kể đến là:

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng để sản xuất glucose, mật đường từ nguyên liệu chứa nhiều cellulose như rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa,…

Trong công nghiệp sản xuất ethanol từ các phế liệu có chứa cellulose

Trong chăn nuôi động vật ăn cỏ: việc bổ sung cellulase vào thức ăn sẽ tăng cường sự tiêu hóa hấp thụ thức ăn ở các loài này

Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật: cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly được dễ dàng

2.8.4 Phân loại

Enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm sau :

Endocellulase

Exocellulase

-glucosidase Theo danh pháp quốc tế thì được phân chia thành 3 nhóm:

1,4- -D-glucan cellobiohyrolase

1,4- -D-glucan-4-glucanohydrolase

-D-glucoside glucohydrolase

2.8.5 Chức năng

Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase hay endoglucanase, tên khác là 1,4- -D-glucan-4-glucanohydrolase

Thủy phân liên kết -1,4-glucosid ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như Carboxyl Methyl Cellulose (CMC) và Hydroxyethyl Cellulose (HEC)

Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh

Sự thủy phân của endocellulase tạo ra những chuỗi cellodextrin có đầu không khử

Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase hay exobiohydrolase, tên khác là 1,4- -D-glucan cellobiohyrolase

Thủy phân đặc hiệu liên kết -1,4-glucosid ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết -1,4-glucosid)

Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

-glucosidase (cellobiase), tên khác là -D-glucoside glucohydrolase

Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D-glucose

2.8.6 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase

Hệ vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase khá phong phú, thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn Trong công nghiệp sản xuất cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được sử dụng

o Nấm sợi

Chủ yếu là nấm mốc và nấm quả thể, đa số có khả năng sinh tổng hợp hai hoặc nhiều exocellulase, một vài endocellulase và một ít -glucosidase Các enzyme này đều là enzyme ngoại bào (được nấm tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy)

 Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sydovii, Aspergillus terrus

 Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma roseum, Trichoderma reesei

 Penicillium spp

 Altenaria tenuis

 Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani,…

o Xạ khuẩn

 Actinomyces spp,…

 Chiếm ưu thế là loài xạ khuẩn chịu nhiệt Thermonospora cruvata được

phân lập từ phân rác ủ

o Vi khuẩn

 Hệ vi sinh vật trong dạ dày của động vật ăn cỏ, ví dụ: Cillobacterium cellulosolvens, Ruminococcus albus, Ruminobacter parum,…

 Celluvibrio gilvus

 Acetobacter xylinum,…