Luận văn : Xác định các thành phần chủ yếu trong cà phê nhân, tạo chế phẩm Biocoffee-1 với hoạt tính cao của pectinase và cellulase part 5 doc

53 3.3.2.2. Phƣơng pháp trích chất hòa tan Phương pháp trích chất hòa tan trong cà phê sau khi lên men: 3.3.2.3. Phƣơng pháp đo kích thƣớc Dùng thước đo kỹ thuật để đo chiều ngang, chiều dài và bề dày của hạt cà phê. Cân 10 g cà phê bột Bổ sung 30 ml nước sôi Thu lấy dịch lọc Thêm 20 ml nước sôi Thu lấy dịch lọc Sấy khô Thu chất khô là chất hòa tan Đem sấy ở nhiệt độ 100 – 105 o C Thu chất khô Cân trọng lượng Đo pH Đo độ hòa tan đun trên bếp cho vào tủ sấy Cho vào becher đã xác định trọng lượng 54 3.3.2.4. Phƣơng pháp nghiền Dùng máy xay để nghiền cà phê (cà phê tươi và cà phê lên men) khi cần lượng cà phê bột để nghiên cứu. 3.3.2.5. Phƣơng pháp ray Dùng lưới ray để ray những nguyên vật liệu còn tạp chất hoặc khi cần thu lượng bột mịn. 3.3.2.6. Phƣơng pháp đếm Dùng mắt thường để đếm số hạt cà phê, thu nhặt những hạt hư, hỏng và tạp chất. 3.3.2.7. Phƣơng pháp ngâm Dùng nước để ngâm cà phê, mục đích là để hạt cà phê đạt được độ ẩm cần thiết. 3.3.3. Phƣơng pháp hóa sinh 3.3.3.1. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme a. Xác định hoạt tính cellulase [14], [25] Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân CMC (Sodium carboxymethyl cellulose) bằng enzyme ở nhiệt độ 40 o C và pH 5,0. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid). Sau đó tiến hành đo độ hấp thu OD của dung dịch đường bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. 55 Cách thực hiện Phản ứng enzyme Phản ứng thử không Thêm 1 ml dung dịch CMC vào dung dịch mẫu Lắc đều Ổn nhiệt 40 0.1 o C trong 10 phút Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS Lắc thật kỹ Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm Đặt trong nước sôi 15 phút Làm nguội bằng nước lạnh Tiến hành đo OD ( = 540 nm) (dùng nước cất làm đối chứng)  A T Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS vào dung dịch mẫu Lắc đều Thêm 1 ml dung dịch CMC Lắc đều Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm Đặt trong nước sôi 15 phút Làm nguội bằng nước lạnh Tiến hành đo OD ( = 540 nm) (dùng nước cất làm đối chứng)  A B 1 ml dung dịch mẫu  ổn nhiệt 40 0.1 o C trong 5 phút Cơ chất CMC  ổn nhiệt tương tự 1 ml dung dịch mẫu  ổn nhiệt 40 0.1 o C trong 5 phút Cơ chất CMC  ổn nhiệt tương tự 56 Dựng đƣờng chuẩn glucose Pha dung dịch glucose 1 mg/ml bằng cách hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng dưới đây: Bảng 3.1: Dựng đƣờng chuẩn glucose Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dung dịch glucose 1 mg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dung dịch CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - ml dung dịch lactose-DNS 4 4 4 4 4 4 4 - ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều các ống nghiệm này Dán nylon lên miệng ống nghiệm Đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh về nhiệt độ phòng (bằng một chậu nước lạnh) Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 540 nm  A G Ống số 0 là ống đối chứng  A W Tính kết quả Định nghĩa đơn vị hoạt tính Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1 mol/phút dưới các điều kiện phản ứng. 57 Tính toán  Tính hệ số glucose o Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số A G - A W o Dựng đồ thị đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là nồng dộ glucose (mg/ml). Hệ số glucose được tính bằng công thức: WG G AA C F Trong đó: F: Hệ số glucose C G : Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) A G : Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn A W : Độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất o Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch glucose chuẩn để thu được giá trị hệ số glucose, sau đó tính giá trị hệ số trung bình.  Xác định hoạt tính enzyme Hoạt tính CMCase được tính theo công thức sau: C 1 ml 1 1 phut 10 1 180 1000 F)A(A(UI/g) CMCase BT Trong đó: A T : Độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme A B : Độ hấp thu OD của phản ứng thử không F: Hệ số glucose (mg/ml) 1000: Chuyển từ mg sang g 180: Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ g sang mol 10 phút: Thời gian phản ứng 1 ml: Thể tích dung dịch enzyme C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml) 58 b. Xác định hoạt tính pectinase [14] Sử dụng phương pháp so màu, là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Phương pháp so màu cho phép sai số 5%. Nguyên tắc Định lượng acid galacturonic, là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới tác dụng của pectinase không kết tủa bởi ZnSO 4 . Cách thực hiện 20 ml dung dịch pectin Cho vào becher 100 ml Thêm 10 ml dung dịch enzyme 1% Lắc đều Để ở nhiệt độ 30 o C (nhiệt độ phòng) trong 60 phút Thêm 2 ml dung dịch ZnSO 4 15% Lọc qua giấy lọc Thu dịch lọc Pha loãng 5 lần Ta có dung dịch pha loãng gọi là dung dịch (*) 59 5 ml dung dịch antron cho vào ống nghiệm Thêm 2,5 ml dung dịch (*) Lắc mạnh 10 phút Đun cách thủy 70 o C trong 12 phút Làm nguội Tiến hành đo OD ở bước sóng 584 nm Tính kết quả Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn có khả năng xúc tác 1 g pectin thành acid galacturonic trong 60 phút. Điều kiện tiêu chuẩn: Nhiệt độ: 30 o C, thời gian: 60 phút pH 3,9 – 4,1 Nồng độ pectin: 0,66% Mức độ thủy phân pectin: 30% Hoạt tính pectinase V 0,0104OD0,34 (UI) Trong đó: OD: Mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron V: Lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml) 3.3.3.2. Các phƣơng pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê a. Xác định hàm lƣợng cellulose [16] Nguyên tắc Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền vững của cellulose trước tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh, không bị thủy phân dưới tác dụng của acid yếu. Trong khi đó, các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin,… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxi hóa, phân giải và tan 60 vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitric với acid acetic. Cách thực hiện Cân 2 g mẫu cà phê đã nghiền nhỏ Sấy khô đến trọng lượng không đổi (100 – 105 o C) Cho vào bình tam giác 250 ml Thêm vào bình 16,5 ml hỗn hợp 1,5 ml HNO 3 đậm đặc 15 ml CH 3 COOH đậm đặc Đun sôi 30 phút (có làm lạnh hồi lưu) Giấy lọc Để nguội, pha loãng bằng nước nóng Sấy khô đến trọng lượng không đổi Lọc Rửa kết tủa cellulose 3 lần (10 – 15 ml nước cất nóng/lần) Rửa bằng rượu etylic 96% 2 lần (10 – 15 ml/lần) Rửa bằng ete etylic 1 lần (15 – 20 ml) Sấy giấy lọc có chứa cellulose đến trọng lượng không đổi (100 – 105 o C trong 2 – 3 giờ) 61 Tính kết quả w 100a X Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính bằng % a: Trọng lượng cellulose (g) w: Trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: Hệ số chuyển đổi thành % b. Xác định hàm lƣợng pectin (Sử dụng phương pháp Canxi pectat) [9], [16] Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa. Cách thực hiện Cân 0,15 g mẫu cà phê Thêm vào 100 ml dung dịch NaOH 0,1N Để hỗn hợp qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic Thêm 50 ml dung dịch CH 3 COOH 1N 5 phút Thêm vào 50 ml dung dịch CaCl 2 2N Giấy lọc không tro 1 giờ Đun sôi 5 phút Sấy khô đến trọng lượng không đổi Lọc Rửa kết tủa canxi pectate bằng nước cất nóng đến khi không còn ion Clo nữa (thử nước rửa không có kết tủa trắng bằng dung dịch AgNO 3 1%) Sấy giấy lọc đến trọng lượng không đổi (100 – 105 o C) Tính kết quả Hàm lượng canxi pectate được tính bằng hiệu số của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không. 62 Hàm lượng pectin được tính theo công thức sau: B 1000,92w P Trong đó: P: Hàm lượng pectin (%) W: Trọng lượng kết tủa canxi pectat (g) B: Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g) (khoảng 0,15 g) 0,92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (pectin chiếm 92% trọng lượng canxi pectat) 100: Hệ số chuyển đổi thành % c. Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng số hòa tan [1], [9] Nguyên tắc Sự định phân này căn bản dựa trên sự phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của acid sulfuric (H 2 SO 4 ). Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào: o Độ sạch các dụng cụ o Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H 2 SO 4 o Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun [...]... 4 5 Nước cất (ml) 5 5 4 3 2 1 0 Nồng độ đường mỗi ống (mg/ml) 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0 ,5 9 5 Dung dịch đường nghiên cứu (ml) 8 5 x x Để tất cả các ống vào một nồi nước đá Thêm thật chậm 10 ml thuốc thử antronvào mỗi ống (chảy theo thành ống nghiệm) Dùng đũa thủy tinh khuấy chậm Đun sôi cách thủy đúng 7 ,5 phút Làm lạnh trong nước đá Khi nguội, đo OD ở bước sóng 630 nm Tính kết quả Trị số mật độ quang của. .. lọc trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết Pha loãng cặn thu được với nước cất, định mức 50 ml Để lắng 64 Thực hiện phản ứng màu Ta có thể tạo phản ứng màu của dung dịch đường với một trong những thuốc thử sau đây: phenol, orcinol hay antron Trong đề tài này, chúng tôi chọn thuốc thử là antron Thực hiện theo bảng dưới đây: Bảng 3. 2: Bảng thực hiện phản ứng màu với antron Ống số 1 2 3 4 5 6 7 Glucose... đi trị số của ống thử không sẽ xác định được đường chuẩn Với dung dịch đường cần định nồng độ, ta cũng lấy trị số mật độ quang trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra nồng độ x, từ đó tính ra % lượng đường trong mẫu  65 d Xác định hàm lƣợng đƣờng khử [16] Sử dụng phương pháp Acid dinitrosalicylic (DNS) Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa... khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu Cách thực hiện Dựng đƣờng chuẩn glucose Pha dãy glucose chuẩn từ 0,1 – 0,8 mg/ml Cho 1 ml dung dịch glucose chuẩn vào 8 ống nghiệm Thêm 4 ml thuốc thử DNS Đun sôi 15. ..63 Cách thực hiện Trích đƣờng Cân 1 g mẫu cà phê đã nghiền nhỏ Cho vào becher 100 ml và thêm vào 10 ml cồn 90o Đun cách thủy cho sôi 3 lần Khuấy đều, để nguội Lọc qua giấy lọc không tro (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc) Thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều Đun cách thủy cho sôi 2 lần Khuấy, để nguội, lọc Lặp lại 2 lần Đưa cặn lên giấy lọc và rửa sạch 2 – 3 lần bằng... nhiệt độ phòng Đo mật độ quang ở bước sóng 54 0 nm (đối chứng là nước cất) Dựng đường chuẩn glucose (với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose) Xác định lƣợng đƣờng khử Dung dịch đường cần phân tích cũng được chuẩn bị như phần trích đường của phương pháp xác định đường tổng số Hỗn hợp phản ứng giữa glucose với thuốc thử DNS được tiến hành như phần dựng đường chuẩn glucose (thay 1 ml . (UI) Trong đ : OD: Mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron V: Lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml) 3.3.3.2. Các phƣơng pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê. sau đó tính giá trị hệ số trung bình.  Xác định hoạt tính enzyme Hoạt tính CMCase được tính theo công thức sau: C 1 ml 1 1 phut 10 1 180 1000 F)A(A(UI/g) CMCase BT Trong đ : A T : Độ. độ ẩm cần thiết. 3.3.3. Phƣơng pháp hóa sinh 3.3.3.1. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme a. Xác định hoạt tính cellulase [14], [ 25] Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân