PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI docx

G1 S interphase gian kỳ G2 2 gđ chính M: Mitosis phân chia tb Anaphase : kỳ sau Telophase : kỳ cuối Trong giai đoạn phân chia tế bào, ta quan sát các NST rõ nhất ở kỳ giữa.. Nguyên tắc

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NHIỄM

SẮC THỂ NGƯỜI

I ĐẠI CƯƠNG:

 Nhiễm sắc thể (NST) người được xem là những yếu tố của sự di truyền

 Thuật ngữ “Chromosome” (chromo = color = MÀU và some = body = THỂ) đã được Waldeyer đưa ra vào năm 1888 Các NST chỉ có thể quan sát được khi chúng co ngắn lại ở kỳ giữa để chuẩn bị cho sự phân chia tế bào

 NST đã được nghiên cứu từ cuối thế kỷ 19, nhưng với trình độ khoa học kỹ thuật thời bấy giờ các nhà khoa học đã đưa ra nhiều kết luận khác nhau về số lượng NST người

1891  Flemming đề nghị bộ NST người là: 2n = 24

Morre đề nghị bộ NST người là: 2n = 32

Wilcox đề nghị bộ NST người là: 2n = 36

 Đầu thế kỷ 20, việc quan sát phân tích số lượng NST người đã gần đúng sự thật

 1912  Winiwater phân tích mô tinh hoàn cắt mảnh và cho rằng :

♂ = 47 NST (trong đó có 1 NST giới tính X)

♀ = 48 NST (trong đó có 2 NST giới tính XX)

 1921  Tìm ra NST Y

 1923  Painter cũng dùng mô tinh hoàn cắt mảnh để phân tích và đi đến kết luận bộ NST người là 2n = 48

♂ = 46 NST thường + XY

♀ = 46 NST thường + XX

 Như vậy, số lượng NST người với 2n = 48 của Painter được mọi người công nhận

và tồn tại trong các sách giáo khoa hàng chục năm

 Mãi đến năm 1956, Tjio và Levan qua phân tích tế bào thai người, xác định chính xác số lượng NST của người là 2n = 46

Nam = 44 nst thường + XY

Nữ = 44 nst thường + XX

 Năm 1960, Moorhead và cộng sự đã đề xuất phương pháp cấy tế bào lympho ở máu ngoại vi trong vòng 48h – 72h để làm tiêu bản NST người và qua đó phân tích, đánh giá các NST một cách chính xác

 Chu kỳ tế bào:

(Pr)

G2

(Pr)

G2

S (AND)

M

G1

S interphase (gian kỳ) G2

2 gđ chính

M: Mitosis (phân chia tb) Anaphase : kỳ sau

Telophase : kỳ cuối Trong giai đoạn phân chia tế bào, ta quan sát các NST rõ nhất ở kỳ giữa

II CÁC NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT ĐỂ LÀM TIÊU BẢN NST NGƯỜI:

1 Nguyên tắc cơ bản:

 Các NST chỉ có thể được xác định và phân tích cấu trúc ở cuối kỳ đầu và kỳ giữa,

vì thế, trong việc nghiên cứu NST người, ta chỉ dùng những mô có các tế bào đang trong giai đoạn phân chia, còn đối với những mô bao gồm các tế bào ít phân chia hoặc không phân chia, phải kích thích cho chúng phân chia và nuôi cấy chúng trong một môi trường thích hợp (RPMI, F10, TC199… ) VD: Tế bào lympho ở máu ngoại vi là

những tế bào không phân chia, tuy nhiên dưới tác dụng của chất Phytohemagglutinin (PHA), tế bào lympho sẽ chuyển dạng và phân chia PHA là một loại mucoprotein chiết xuất từ hạt đậu đỏ hình thận, tên khoa học là Phaseolus Vulgaris PHA có tác dụng làm chuyển dạng các tế bào lympho nhỏ thành những tế bào giống như nguyên bào lympho (lymphoblast-like cells), gây nên sự gia tăng tổng hợp ARN và ADN trong vòng 48 giờ nuôi cấy PHA còn có tác dụng gây ngưng kết hồng cầu

 Làm cho các tế bào đang phân chia dừng lại ở kỳ giữa vì các NST ở kỳ giữa có dạng điển hình nhất giúp ta dễ quan sát, phân tích và đánh giá Hoá chất có tác dụng này là Colchicin, là một hoạt chất của hạt cây Thu Thủy Tiên (Colchicum Autumnale) hoặc hóa chất tổng hợp có tác dụng tương tự như Colchicin là Colcemid Đặc tính của hóa chất này là phá vỡ thoi vô sắc, do đó NST mất chỗ tựa và không thể di chuyển về

2 cực của tế bào được, vẫn nằm tại mặt phẳng xích đạo Colchicin còn có tác dụng làm cho NST co ngắn lại, dày lên và quan sát dễ dàng

 Dùng sốc nhược trương (hypotonic shock) để làm trương phồng tế bào phá vỡ màng tế bào, các NST ở kỳ giữa sẽ phân tán không xếp chồng lên nhau, nhờ vậy có thể quan sát dễ từng chiếc một Dung dịch nhược trương thường được dùng là KCl 0,75M hoặc Citrat Natri 1%

 Định hình các NST bằng dung dịch Carnoy theo tỷ lệ 3/1 (3 methanol / 1 acid acetic)

 Nhuộm NST bằng các loại phẩm nhuộm nhân: Giemsa, orcein …

2 Phương pháp làm tiêu bản NST:

 Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp

a Phương pháp trực tiếp:

 Là phương pháp lấy tế bào của cơ thể không qua giai đoạn nuôi cấy chuẩn bị, chỉ

sử dụng những tế bào đang ở trong giai đoạn phân chia rất mạnh trong cơ thể VD: tế bào tủy xương, mô bào thai, mô tinh hoàn …

 Chú ý :

 Vẫn phải nhỏ Colchicin với mục đích làm ngưng giai đoạn phân chia tế bào ở kỳ giữa

 Vẫn phải dùng dung dịch nhược trương KCl với mục đích làm bung các NST

b Phương pháp gián tiếp:

 Là phương pháp mà trong đó các tế bào phải trải qua 1 quá trình nuôi cấy trong môi trường thích hợp, kích thích các tế bào chuyển dạng và phân chia nhờ vào PHA

 Loại tế bào hay được dùng trong phương pháp gián tiếp là các lympho bào ở máu ngoại vi vì mẫu vật dễ lấy và phương pháp nuôi cấy tương đối đơn giản

 Ngoài tế bào lympho ở máu ngoại vi, còn có thể nuôi cấy các tế bào của mô bào thai, tế bào gai nhau, nguyên bào sợi, tế bào của các khối u ác tính …

 Sử dụng phương pháp gián tiếp thường có nhiều tế bào phân chia hơn so với phương pháp trực tiếp, và do vậy có được nhiều cụm kỳ giữa để quan sát, phân tích và đánh giá hơn

2 Tiến hành nuôi cấy máu ngoại vi: (giảng trong phần thực tập)

III BỘ NST NGƯỜI:

 Tế bào lưỡng bội bình thường ở ngươi chứa 46 NST, các NST giống nhau từng đôi một về hình dạng, kích thước (gọi là NST tự thân hay Autosomes) và một đôi không giống nhau đó là NST giới tính (sex chromosomes)

♂ = 44A + 2 NST giới tính giống nhau là XX

♀ = 44A + 2 NST giới tính giống nhau 1 X và 1 Y

 Năm 1960 các nhà tế bào di truyền đã họp tại Denver, Colorado thống nhất về việc sắp xếp bộ NST người dựa vào cấu trúc và kích thước của các NST

1 Phân loại theo cấu trúc :

 Dựa vào vị trí của tâm động, ta xác định 3 loại NST quan sát được ở kỳ giữa như sau:

a) NST tâm giữa (Metacentric chromosomes): gồm các NST có tâm nằm ở gần như chính giữa tạo thành 2 nhánh gần bằng nhau

b) NST có tâm lệch (Submetacentric chromosomes): Các NST có tâm nằm lệch ở một bên tạo thành 2 nhánh không bằng nhau; nhánh ngắn và nhánh dài

c) NST tâm đầu (Acrocentric chromosomes): Các NST có tâm nằm rất lệch ở gần một đầu NST tạo thành 2 nhánh: một nhánh rất ngắn và một nhánh rất dài

 Ở người các NST số 1, 2, 3, 16, 19 và 20 là những NST có tâm giữa hoặc gần giữa Các NST 13, 14, 15, 21, 22 và Y là những NST tâm đầu Các NST còn lại có tâm lệch

2 Phân loại NST theo kích thước :

 Khi các NST được nhuộm bằng kỹ thuật Giemsa thông thường thì không tạo nên các băng, ta không thể xác định số từng NST một Do đó, dựa vào kích thước to, nhỏ cũng như cấu trúc (vị trí của tâm động) mà sắp xếp các NST theo hệ thống Denver thành 7 nhóm dùng các chữ số từ A đến G như sau:

 Nhóm A: gồm những NST lớn nhất có tâm giữa hoặc gần giữa gồm các đôi 1, 2, 3 Đôi 1 và 3 có tâm giữa Đôi 2 có tâm gần giữa

 Nhóm B: gồm những NST lớn nhưng hơi nhỏ hơn nhóm A, có tâm lệch hoặc hơi lệch, gồm đôi số 4, 5

 Nhóm C: là NST trung bình có tâm lệch, các đôi NST ở nhóm này rất khó phân biệt chính xác từng đôi một nếu không sử dụng KT nhuộm băng Gồm các đôi NST số 6  số 12 và NST giới tính X Các đôi 6, 7, 8, 11 và X

có tâm gần giữa, còn các đôi 9, 10, 12 có tâm lệch

 Nhóm D: là những NST trung bình, tâm đầu có kèm theo vệ tinh gồm các đôi 13, 14, 15

 Nhóm E: là những NST trung bình hoặc dưới trung bình gồm các đôi 16,

17, 18 Đôi 16 có tâm giữa Đôi 17, 18 có tâm lệch

 Nhóm F: là những NST nhỏ có tâm giữa, gồm đôi 19, 20

 Nhóm G: là những NST nhỏ có tâm đầu, kèm theo vệ tinh gồm đôi 21,

22 NST Y cũng xếp vào nhóm này nhưng không có vệ tinh, các nhánh dài nằm sát nhau

NHÁNH NGẮN

CENTROMERE NHÁNH DÀI

METACENTRIC SUBMETACENTRIC ACROCENTRIC

3 Ký hiệu thường dùng trong nghiên cứu NST người :

 Trong nghiên cứu phân tích bộ NST người được tiến hành theo thứ tự qua 2 giai đoạn:

a) Giai đoạn phân tích qua kính hiển vi:

 Chọn các cụm kỳ giữa đẹp, rõ để qua đó xác định số lượng NST, phân tích các sai lệch về số lượng cũng như các sai lệch lớn về cấu trúc

 Ghi lại tọa độ của các cụm kỳ giữa đã được phân tích vào phiếu phân tích NST

 Quan sát và phân tích khoảng 30 cụm kỳ giữa

 Chọn và đánh dấu tọa độ những cụm kỳ giữa đẹp, rõ, sau đó chụp hình

b) Phân tích qua ảnh chụp:

 Các cụm kỳ giữa đẹp, rõ đã được ghi tọa độ lại qua kính hiển vi sẽ được chụp hình qua kính KHV có máy chụp hình

 Rửa ảnh các cụm kỳ giữa đẹp

 Các NST được cắt ra và xếp từng đôi theo hệ thống xếp loại Denver

 Quá trình này được gọi là xếp bộ NST (Karyotyping) và ảnh các NST được cắt và xếp hoàn tất thì được gọi là NST đồ (Karyotype)

 Để miêu tả bộ NST người trong bộ NST đồ (Karyotype), người ta sử dụng các ký hiệu đã được thông qua, tiêu chuẩn hóa trong các cuộc hội nghị về tế bào di truyền quốc tế Denver (1960) và Paris (1970) Diễn tả một bộ NST người gồm 3 phần, ngăn cách nhau bởi dấu phẩy:

 Phần 1: Số lượng NST

 Phần 2: Số lượng NST giới tính

 Phần 3: Miêu tả các rối loạn về số lượng và cấu trúc

 Dưới đây là một số ký hiệu thường dùng để nghiên cứu bộ NST người:

 dic : NST 2 tâm (dicentric)

 i : NST đều (isochromosome) có 2 nhánh bằng nhau đều nhánh ngắn hoặc đều nhánh dài Do hiện tượng phân chia NST tại centromère theo chiều thẳng góc

 + hay - : Đặt trước số của NST thì chỉ NST đó thừa hoặc thiếu cả NST đó Ví dụ: 47, XX, +21 (thừa 1 NST 21)

 + hay - : Đặt ngay sau ký hiệu của nhánh thì chỉ nhánh

đó thiếu hoặc thừa Ví dụ: 46,XXq- (NST X thiếu 1 phần nhánh dài)

 45, XO : nữ bị hội chứng Turner

 47, XXY : nam bị hội chứng Klinefelter

 47, XX, +21 : nữ bị hội chứng Down

 46, XX, del (5p) : nam bị mất một phần nhánh ngắn NST số 5 (Hội chứng mèo kêu: cri du chat syndrome)

 46, XY, -14, +t(14q, 21q) : nam bị hội chứng Down thể chuyển đoạn

IV CÁC PHƯƠNG PHÁP MỚI ĐỂ XẾP LOẠI BỘ NST:

- Bằng các phương pháp làm tiêu bản NST và nhuộm Giemsa thông thường, chỉ cho phép phân tích và phát hiện được các RL về số lượng cũng như các sai lệch về cấu trúc lớn như đứt gãy NST, NST vòng, NST 2 tâm, chuyển đoạn hòa nhập tâm …

- Ngày nay với sự tiến bộ của môn Tế bào-Di truyền và các kỹ thuật mới làm tiêu bản NST cho phép xác định một cách chính xác các sai lệch NST rất nhỏ như đảo đoạn, thêm đoạn, chuyển đoạn tương hỗ

1 Phương pháp tự chụp hình phóng xạ :

- Phương pháp này dựa vào đặc điểm tự nhân lên của ADN của một số NST không giống nhau vào các thời gian khác nhau được đánh dấu vào Thymidin, qua đó người ta

đã phân biệt được các NST nhóm B, D và G và NST X

- Tuy nhiên việc áp dụng phương pháp này còn gặp nhiều trở ngại về trang thiết bị, hóa chất, và thời gian

2 Phương pháp huỳnh quang (FISH - Fluorescence In Situ Hybridization):

- Năm 1971 Caspersson và cộng sự đã công bố phương pháp huỳnh quang để xác định vị trí các NST

- Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: khi nhuộm NST bằng các phẩm nhuộm huỳnh quang (Quinacrine hoặc Quinacrine mustard) liên kết với ADN thì trên

NST xuất hiện các băng sẫm và các băng nhạt, các băng này quan sát được qua KHV huỳnh quang; phần cuối NST Y bắt màu huỳnh quang mạnh nhất

- Với phương pháp huỳnh quang ta có thể xác định chắc chắn từng NST một

3 Phương pháp ASG (Acetic – Saline – Giemsa):

- Năm 1971, Summer và cộng sự đề xuất phương pháp ASG

- Phương pháp ASG gồm các phương pháp cơ bản sau:

 NST được cố định bằng dung dịch cố định có acid acetic (A)

 Xử lý tiêu bản trong dung dịch muối nóng (S)

 Nhuộm tiêu bản bằng phẩm nhuộm Giemsa (G)

- Nguyên tắc cơ bản của ASG: Các ADN tạo nên phần dị nhiễm sắc ở trên NST sẽ bắt màu phẩm nhuộm Giemsa không giống nhau tạo nên các băng sẫm và nhạt đặc trưng cho từng NST Các băng tạo bởi phương pháp ASG gọi là băng G và ta có thể quan sát chúng bằng KHV quang học

- Năm 1972 Seabright đã dùng men Trypsin hoặc Chymotrypsin thay cho giai đoạn

xử lý bằng dung dịch muối nóng, cũng cho các băng sẫm nhạt trên NST tương tự như băng làm theo phương pháp ASG Phương pháp xử lý bằng Trypsin hoặc Chymotrypsin tạo nên các băng gọi là băng T

- Từ năm 1970 đến nay, chủ yếu dựa vào các nguyên tắc cơ bản trên mà các nhà nghiên cứu Tế bào-Di truyền đã đưa ra hàng loạt các phương pháp phát hiện băng khác nhau như băng R (vị trí các băng sẫm và nhạt ngược với băng G), băng C, băng T……

- Gần đây nhất với sự nuôi cấy tế bào và thu hoạch NST ở giai đoạn kỳ đầu, và áp dụng các phương pháp nhuộm băng nói trên đã cho phép phân tích đánh giá những sai lệch rất nhỏ về cấu trúc của từng NST một cách rất chính xác

V ỨNG DỤNG Y HỌC CỦA VIỆC PHÂN TÍCH NST NGƯỜI:

1 Chẩn đoán lâm sàng:

- Nghiên cứu NST rất có lợi trong chẩn đoán lâm sàng chủ yếu ở các bệnh nhân đa

dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần; khả năng sống kém hoặc những rối loạn về

sự phát triển cơ quan sinh dục

2 Nghiên cứu các loại u ác tính:

- Ứng dụng đầu tiên của băng Q là phát hiện ra NST Philadelphia, tìm thấy khi nuôi cấy tế bào máu tủy xương của bệnh nhân bị CML (Chronic myelogenous leukemia) đó chính là NST 22 một phần nhánh dài bị mất đi

- 1973 Rowley xác định chính xác NST Philadelphia là do sự chuyển đoạn nhánh dài của NST 22; t(9q22q)

- Trong Retinoblastoma  13q14–

- Trong bệnh Wilm’s Tumors  11p13

3 Vấn đề sinh sản :

- Khảo sát NST ở các cặp vợ chồng sẩy thai liên tiếp, vô sinh… cho thấy có sự bất thường NST, ví dụ như có một sự chuyển đoạn từ 1 NST giới tính sang NST thường,

46, XY, t(Y  2p)

- Đa số bệnh nhân vô sinh một phần có liên quan đến gen và rối loạn NST

4 Chẩn đoán trước sinh :

- Lập Karyotype của phôi thai qua nuôi cấy tế bào nước ối, tế bào gai nhau và máu thai nhi để phát hiện các rối loạn NST về số lượng cũng như về cấu trúc Đối với các thai phụ lớn tuổi hoặc có tiền căn đẻ con dị tật bẩm sinh thì thông qua xét nghiệm chẩn đoán trước sinh lập Karyotype thai nhi, qua đó phân tích và đưa ra các lời khuyên di

truyền và các biện pháp điều trị kịp thời

ThS BS PHÙNG NHƯ TOÀN