321 Chỉång 15 MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di dng âãø phạt hiãûn v xạc âënh ADN trong tãú bo vi sinh váût, thỉûc váût v âäüng váût. 15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) V NGUN TÀÕC XẠC ÂËNH Gen l âån vë di truưn cå bn. Nọ l mäüt âoản ADN (âäi khi ARN) m hoạ thäng tin cho viãûc täøng håüp sn pháøm sinh hc xạc âënh (ch úu l protein). Nhỉỵng nghiãn cỉïu hiãûn âải vãư cáúu trục v chỉïc nàng ca ngun sinh cháút â måí ra nhỉỵng hiãøu biãút måïi vãư cáúu tảo v chỉïc nàng hoảt âäüng ca tãú bo. Cáúu trục ADN cho phẹp gii thêch tải sao lải cọ kh nàng tng trỉỵ v di truưn thäng tin tỉì thãú hãû ny sang thãú hãû khạc mäüt cạch äøn âënh v bàòng cạch no nọ thäng tin di tuưn åí dảng thỉï tỉû sàõp xãúp cạc gäúc nucleotit lải chuøn hoạ thnh phán tỉí protein chỉïc nàng. Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giạo l trung tám ca di truưn phán tỉí gäưm 3 âiãøm chênh: sao chẹp thäng tin di truưn tỉì ADN bäú mẻ sang ADN con cại, chuøn âäøi m di truưn tỉì ADN sang ARN - quạ trçnh phiãn m (transcription) v dëch m di truưn (translation) - thäng tin di truưn tỉì mARN âỉåüc chuøn sang trçnh tỉû sàõp xãúp âàûc hiãûu ca axit amin trong phán tỉí protein. Cäng nghãû ADN tại täø håüp - hiãûn l nãưn tng cho sỉû phạt triãøn nhỉ v bo ca ngnh cäng nghãû sinh hc hiãûn âải. Cạc phỉång phạp phán têch v täøng håüp hiãûn âải l tạch DNA, xạc âënh thỉï tỉû, täøng håüp, gàõn xen nọ vo vë trê nháút âënh bãn trong såüi ADN khạc âãø nhán lãn, v räưi lải tạch ra. Hiãûn nay hon ton cọ thãø nháûn biãút chênh xạc nhỉỵng âoản ADN âàûc hiãûu qua cháøn âoạn cạc bãûnh âàûc biãût. Âäúi våïi cạc bãûnh khi cạc gel chỉa âỉåüc xạc âënh thç viãûc cháøn âoạn kẹm chênh xạc. Mäüt bäü d tçm âån gin chè l mäüt khục ADN (hồûc ARN) cọ thãø tçm khục bäø sung våïi nọ bàòng cạch lai (hybridization). Cọ thãø phạt hiãûn sỉû bàõt càûp ny bàòng nhiãưu cạch, nhỉng phäø biãún nháút l sỉí dủng phỉång phạp tỉû chủp phọng xả våïi bäü d tçm cọ 32p (hçnh 15.1). 322 Viãûc lai bäü d tçm ADN våïi âoản ADN tạch råìi gi l Southern Blotting âỉåüc mä t trãn hçnh 15.1. Cạc âoản ADN hçnh thnh sau khi ADN bë endonucleaza restrictaza càõt s âỉåüc tạch råìi ra bàòng phỉång phạp âiãûn di trãn gel agaroza. Khong cạch di chuøn phủ thüc vo kêch thỉåïc âoản. Cng nh chảy cng nhanh. Sau khi â tạch råìi, ngỉåìi ta dng kiãưm âãø lm biãún tênh cạc âoản âọ v chuøn chụng lãn mng nylon. Táúm mng ny âỉåüc våïi dung dëch cọ cháút d tçm cháút phọng xả, nọ chè lai våïi cạc âoản ADN no chỉïa thỉï tỉû bäø sung. Viãûc xạc âënh thỉï tỉû ARN (vê dủ mARN) cng cọ thãø theo trçnh tỉû tạch bàòng âiãûn di ARN trãn gel, chuøn lãn mng nylon v cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu. Phỉång pha ïp ny gi l Northern Blotting. Hçnh 15.1. Lai “bäü d tçm” våïi âoản ADN, tạch ra bàòng âiãûn di v chuøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15.2. CÁÚU TRỤC CA MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di gäưm ba bäü pháûn cå bn: khay váûn hnh (hçnh 15.2), nàõp cọ âiãûn thãú cao v bưng gim xäúc. N hỉỵng âoản ADN s au khi càõt bàòng endonucleasa Tạch âiãûn di trãn gel agarosa B iãún tênh bàòng kiãưm âãø tạch såüi trung ho Cạc âoản AD N tạch ra theo kêch thỉåïc Vë trê âoản ADN chỉïa thỉ tỉû tỉång âäưng probe nhán dng  ënh vë A DN bàòng tia UV U Í vãût cọ ADN nhán dng såüi âån v cọ gàõn p họng xả R ỉía v s ỉû chủp p họng xảû P h bàòng mng nylon 323 Khay váûn hnh bao gäưm khn âục gel, khay di âäüng trong sút v bt âãûm bàòng caosu. Chøn bë khn gel nhỉ sau: lọt miãúng bt âãûm vo âạy khay di âäüng v sau âọ áún mảnh miãúng âãûm vo cảnh khay (ẹp cho âạy khay di âäüng lt hon ton vo khay khn trỉåïc khi hn kên vo miãúng bt). Trãn nàõp cọ âáưu ra ca m mu, âỉåüc näúi våïi ngưn âiãûn qua âiãûn cỉûc trãn âãú mạy (hçnh 15.3). Bưng gim xäúc cọ äúng näúi âiãûn cỉûc, bủc di chuøn v läù nảp etylen glycol / nỉåïc våïi t lãû 50/50 (hçnh 15.4). Ä Ú ng näúi âiãûn cỉûc B ủc di chuøn (häù tråü khay váûn hnh) N åi (läù) nảp 50/50 etylen g lycol / nỉåïc vo H çnh 15.4. B ưng gim xäúc H çnh 15.2. Khay váûn hnh UV khay di âäüng trong sút Miãúng bt âãûm K hn âục ge l M mu âáưu ra näúi âiãûn cỉûc trãn âãú mạy våïi ngưn âiãûn N àõp thiãút bë H çnh 15.3. Nàõp cọ âiãûn thãú cao 324 15.3. CU TRUẽC VN HAèNH 15.3.1. Chuỏứn bở dung dởch - Chuỏứn bở 250 ml dung dởch õóỷm. Hai dung dởch õóỷm õổồỹc sổớ duỷng phọứ bióỳn cho õióỷn di ADN õổồỹc chuỏứn bở theo cọng thổùc pha chóỳ dổồùi õỏy. 1. 10X Tris- borate-EDTA. Nguọửn cung cỏỳp chỏỳt õóỷm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g Dung dởch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 1000,0 ml pH luọn luọn giổợ ồớ 8,2 Trổồùc khi sổớ duỷng vồùi dung dởch loaợng 0,5 X vồùi 45 mM base tris; 45 mM axit boric vaỡ 1 mM EDTA thổồỡng duỡng pha loaợng bồới vỗ nổồùc coù nhióỷt õọỹ thỏỳp 1X vồùi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaỡ 2 mM EDTA. 2. 10X Tris- acetate -EDTA Cung cỏỳp cho chỏỳt õóỷm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml Dung dởch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 1000,0 ml Khuỏỳy õóửu õổỡng laỡm giaớm pH. Pha loaợng tồùi 1X trổồùc khi sổớ duỷng tồùi 40 mM base tris; 20 mM axit axetic vaỡ 1 mM EDTA. 3. Dung dởch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml) Na 2 EDTA.2H 2 O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 70,0 ml NaOH (10M) tồùi pH 8,0 5,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 100,0 ml - Chuỏứn bở bọỹ õóỷm taới mỏựu. óứ chuỏứn bở bọỹ õóỷm mỏựu cỏửn chuỏứn bở mỏựu õóỷm thổớ (dung dởch mỏựu) vaỡ bọỹ lổồỹc coù dung tờch khaùc nhau. Mỏựu õóỷm thổớ Dung dởch mỏựu (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) 325 Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 7,0 ml Ficoll 400: 2,5 mg Phenol bromua xanh (F 691,9): 25,0 mg Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 10,0 ml Chụ 1: Sucroza v glyxerol cọ thãø sỉí dủng âãø thay thãú cho ficoll 400. Chụ 2: Xylen cyanol (0,25 %) m di chuøn cháûm hån phenol bromua xanh, thç cọ thãø tàng thãm mäüt lỉåüng nãúu mong mún, sỉû cä cản dung dëch agaroza âỉåüc xạc âënh khi thãm vo cọ liãn quan âãún polynucleotit. Thãø têch bãøø Bng 15.1. Nhỉỵng loải lỉåüc M säú lỉåüc Bãư dy, mm Âäü räüng, mm Dung têch Âäü sáu 80 - 6051 - 88 1 prep/2 ref 1,0 44/6 44/6 * 80 - 6052 - 07 1 prep/2 ref 1,5 44/6 66/9 * 80 - 6051 - 50 8 1,0 6,5 6,5 80 - 6051 - 69 8 1,5 6,5 9,7 80 - 6050 - 74 12 1,0 3,9 3,9 80 - 6050 - 93 12 1,5 3,9 5,8 80 - 6051 - 12 16 1,0 2,6 2,6 80 - 6050 - 31 16 1,5 2,6 3,9 - Chøn bë khong 7 ml dung dëch agaroza ỉïng våïi mäùi mililit chiãưu dy gel (vê dủ 1 gel 3 mm cáưn 0,3×7×10 = 21 ml). Ho tan agaroza trong dung dëch âãûm , âiãưu chènh nhiãût âäü häùn håüp. Cho phẹp lm mạt dung dëch âãún 50 0 C trỉåïc khi rọt vo khn. Âãø quan sạt sỉû phán ly trong hiãûn tỉåüng âiãûn chuøn thỉåìng thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch gel. 15.3.2. Âục gel - Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giỉỵ chàût khn âục, tay kia âàût âáưu khay di âäüng ạp vo miãûng bt âãûm v sau âọ hả tháúp räưi âàût lãn âoản cúi ca khn âục. Âàût âáưu cn lải ca khay ạp sạt miãûng bt âãûm. - Chøn bë lỉåüc: Làõp hai rnh trong lỉåüc vo giỉỵa nhỉỵng âáưu äúc v màût sau lỉåüc. Siãút chàût äúc. Âàût lỉåüc vo mẹp khn v chènh pháưn cúi ca lỉåüc âãø cạch khay di âäüng khong 1 mm. Siãút chàût äúc âãø giỉỵ chàõc lỉåüc. - Di chuøn lỉåüc: Âàût khn làõp rạp lãn màût phàóng nàòm ngang. Âàût äúng nivä lãn khay di âäüng, nọ nhỉ thiãút bë kiãøm tra xem khn cọ âụng vë trê nàòm ngang khäng. 326 Hçnh 15.5. Màût sau lỉåüc, làõp trãn vnh ca khn âục, vë trê lỉåüc trong gel. Hai äúc hiãûu chènh lỉåüc. Âãø tảo hai rnh, âàût lỉåüc thỉï hai vo giỉỵa gel - Âäø dung dëch agaroza (âỉåüc lm lảnh âãún 50 0 C) vo khn âục. Âënh hỉåïng lỉåüc âãø cạc bãư màût lỉåüc gáưn miãúng âãûm bt nháút v âàût nọ lãn cảnh khay. Lỉåüc ln ln åí vo vë trê thàóng âỉïng âãø trạnh sỉû vàûn vẻo hçnh dảng. Âãø chảy lỉåüng máùu gáúp 2 láưn, âàût lỉåüc thỉï hai vo chênh giỉỵa khay. Cho phẹp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc lải l 30 phụt. - Khi gel â kãút lải, láưn lỉåüt thạo lỉåüc cáøn tháûn. Nháúc mäüt pháưn v nghiãng nhẻ mäüt âáưu ca lỉåüc, sau âọ rụt tỉì tỉì ra khi gel (kẹo thàóng lỉåüc, tảo ra mäüt khong khäng âãø cọ thãø nháúc gel ra khi khay). - Thạo khay di âäüng v gel bàòng cạch nàõm láúy tay cáưm ca khay, áún âáưu ạp vo miãúng bt âãûm. Khi khay â sảch âãûm thç nháúc ra. Chuøn khay v gel tåïi chäù mạt. 15.3.3. Váûn hnh âiãûn di 1. Lm lảnh nãưn trỉåïc khi tiãún hnh, âàûc biãût khi dng âiãûn ạp cao hån hồûc khi sỉû phán ly quy âënh trãn 30 phụt. Chụ ï: Âãø tiãún hnh phán ly, hồûc l thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch âãûm hồûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vo bäü âãûm máùu. Âãø quan sạt, hy càõt âiãûn, thạo pháưn nàõp v giỉỵ ân cỉûc têm gáưn gel. Thãm tỉì tỉì etydi bromua vo dung dëch âãûm hay âãûm máùu. Phạt hiãûn bàòng phỉång phạp ny khäng nhảy bàòng cạch nhüm mu v nhçn qua thiãút bë soi. 2. Âäø dung dëch vo cạc khoang sao cho âãún khi âãûm cao hån gel khong 1 mm (khong 220 ml). 3. Nảp máù u. Thãm máùu vo 5X bäü âãûm ti máùu v träün (1/5 thãø têch l âãûm nảp vo). Sỉí dủng micropipet âãø nảp máùu, chụ trạnh âám thng hồûc tảo nãn nhiãưu bong bọng. 4. Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoản cúi gáưn máùu nháút. (Máùu axit nucleic di chuøn vãư phêa anät, +, dáy â). Näúi cạc dáy mu (â våïi â, âen våïi âen) tåïi cạc ngưn âiãûn, nhỉ l ESP 2A200. Âàût mỉïc âiãûn ạp v thiãút bë báúm giåì (nãúu cọ sàơn) theo mỉïc âäü phán ly. Màût sau lỉåüc ÄÚc (2) L ỉåüc . axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 10 00 ml) Tris base(FW 12 1 .1 ): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5% ): 0,20 M 11 4 ,1 ml Dung dởch EDTA (0,5M; pH 0,8 ): 0,01M 20,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoa : 10 00,0. 80 - 60 51 - 50 8 1, 0 6,5 6,5 80 - 60 51 - 69 8 1, 5 6,5 9,7 80 - 6050 - 74 12 1, 0 3,9 3,9 80 - 6050 - 93 12 1, 5 3,9 5,8 80 - 60 51 - 12 16 1, 0 2,6 2,6 80 - 6050 - 31 16 1, 5 2,6 3,9 - Chøn. dổồùi õỏy. 1. 10 X Tris- borate-EDTA. Nguọửn cung cỏỳp chỏỳt õóỷm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 10 00 ml) Tris base(FW 12 1 .1 ): 0,89 M 10 8, 0g Axit boric (FW 61. 8 ): 0,89M