327 Nhanh, âiãûn ạp cao Nhỉỵng ỉïng dủng no âọ, nhỉ l kiãøm tra cạc máùu, cọ thãø thỉûc hiãûn nhanh dỉåïi âiãưu kiãûn âiãûn ạp cao. Lm lảnh (−20 0 C ) v giåïi hản thåìi gian váûn hnh 5 phụt hồûc êt hån åí âiãûn ạp 500 V. Cháûm hån, âiãûn ạp cao hån Mäüt gradient âiãûn ạp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phụt (sỉí dủng dung dëch âãûm 1% gel agaroza v 0,5 X TBE) càõt Hind III ca lamda ADN thnh cạc âoản 0,1 ÷ 23 kb. Hồûc, dng dung dëch nhỉ váûy, máùu ny cọ thãø chảy åí 24 V/cm (300V) thç cọ thãø phán càõt trong 20 ÷ 30 phụt. Lm lảnh thiãút bë trỉåïc khi tiãún hnh. Chụ : - Nãúu khäng âäø thãm mu vo cháút lng lm ngüi thç âàût trãn nãưn täúi âãø quan sạt dãù dng hån. - Âàût thiãút bë cn nọng lãn nãưn âỉåüc lm lảnh cọ thãø nh hỉåíng âãún nhiãût âäü xung quanh. Nãúu sỉû quạ nhiãût khäng âỉåü c kiãøm soạt, gel s tan hồûc thiãút bë s cong. - Etydi bromua l cháút àn da mảnh, nãn cáưn mang bao tay. - Âeo kênh chàõn tia UV v bo vãû da khi sỉí dủng ân UV. - Tênh gradient âiãûn ạp, chia âiãûn ạp âàût vo cho khong cạch giỉỵa cạc cỉûc 12,7 cm. Bng 15.2. Âiãûn ạp âàût vo v thåìi gian âãư nghë (1) Âiãûn ạp, V Gradient, V/cm Thåìi gian, phụt 500 40 5 (1) 400 31 10 (1) 300 24 20 (1) 200 16 30 ÷ 40 150 12 30 ÷ 60 Ghi chụ: (1) Âãø thåìi gian chảy êt hån hồûc bàòng 20 phụt, sỉí dủng 0,5X TBE v lm lảnh nãưn âãún −20 0 C trỉåïc khi sỉí dủng. Sau khi phán ly 1- Ngàõt âiãûn, thạo dáy dáùn, thạo nàõp. 2- Nãúu khäng thãm etydi bromua vo gel hồûc máùu trỉåïc khi chảy, nhüm gel trong dung dëch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong nỉåïc hồûc âãûm. 3- Lm sảch thiãút bë. 328 Váûn hnh Cạc loải gel agaroza âỉåüc chøn bë láưn âáưu trong khn âục gel. Nhỉỵng máùu âỉåüc nảp vo trong cạc bãø chỉïa v âỉåüc phán ly. Thúc nhüm hunh quang C 12 H 20 BrN 3 cọ thãø âỉåüc thãm vo cháút âãûm âiãûn di hồûc gel hồûc c hai âãø tçm ra dáúu hiãûu ca quạ trçnh phán ly. Sau khi âiãûn di, gel cọ thãø cho mu, ghi lải mu, tháúm mu thãm hồûc sáúy tỉû âäüng. - Âäø âáưy läù våïi cháút ti lảnh. D khäng lm lảnh âi nỉỵa thç âiãưu quan trng l phi âäø âáưy läù våïi dung dëch lm lảnh âàûc trỉng trỉåïc khi sỉí dủng vç dung dëch cung cáúp ngưn nhiãût cáưn thiãút. Chøn bë 600 ml våïi 50/50 C 2 H 2 (OH) 2 /H 2 O - Âãø giụp xem cạc bãø chỉïa âỉåüc r rng hån trong khi nảp máùu, thãm 1 hồûc 2 git thúc nhüm ho tan hồûc mu thỉûc pháøm vo dung dëch lm lảnh. Tçm ra hai läù hng nảp nỉåïc åí pháưn trãn ca läù. Âäø âáưy läù hng âãún mỉïc cọ thãø nhỉ cháút lm lảnh bàòng äúng phun hồûc mạy båm våïi 50 ml. Báúm nụt caosu mu náu vo mäùi läù. - Sàõp xãúp dung dëch â chøn bë trong thng âạ hồûc bãn trong mạy lảnh hồûc t lảnh âãø khäng dỉåïi 20 0 C trong khong 1 giåì trỉåïc khi sỉí dủng (hoạ cháút âỉåüc dỉû trỉỵ trong phng lảnh hay t lảnh). Chụ : - Khäng âäø âáưy läù våïi cháút chäúng âäng thỉång mải, dung mäi hỉỵu cå hồûc nỉåïc cáút. - Khäng cáưn thiãút thay thãú cháút lm lảnh. 15.3.4. Tênh kãút qu Hiãûn tỉåüng âiãûn di cháút gel cọ thãø sỉí dủng nhỉỵng mnh nh ADN khong 0,1 kb hay nh hån loải gel polyacrylamit thỉåìng sỉí dủng nhỉỵng mnh nh hån 1 kb. Tênh âiãûn di ca ADN. Näưng âäü agaroza qui âënh cho quạ trçnh phán ly thnh nhỉỵng mnh våỵ våïi nhỉỵng kêch thỉåïc khạc nhau âỉåüc cho trong bng 15.3. Bng 15.3. Näưng âäü âãø âiãûn di ca cạc mnh våỵ ADN âäúi våïi cạc loải cháút khạc Âiãûn di, % Hiãûu qu ca nhỉỵng âoản thàóng âäúi våïi sỉû phán gii 0,5 1,0 ÷ 3,0 0,7 0,8 ÷ 12 1,0 0,5 ÷ 10 1,2 0,4 ÷ 7 1,5 0,2 ÷ 3 329 Nhỉỵng nhán täú khạc nh hỉåíng âãún kãút qu quạ trçnh phán ly bao gäưm: cháút âãûm, âiãûn ạp âàût vo, nhiãût âäü , cáúu tảo v sỉû cọ màût ca etydi brommua, cạc agaroza âàûc biãût cọ sàơn. Tiãu chøn chung cho âoản Hind III phage λ. Loải cho 8 mnh våỵ sàõp xãúp trong khong tỉì 0,1 âãún 23 kb cho mäùi càûp 2 såüi. Âãø phán gii täút, di chuøn trãn âoản 10 cm máút 45 phụt 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE åí âiãûn ạp 150V. Tênh âiãûn di ca ARN ARN cọ thãø phán chia âỉûa theo kêch thỉåïc cå bn. Âãø trạnh tạc âäüng âãún thåìi k chuøn hoạ cáúu trục ARN âỉåüc biãún tênh trỉåïc hay sút thåìi gian âiãûn di. Vê dủ: âoản ARN â biãún tênh trỉåïc våïi glyoxal v âimetyl sunfoxit cọ thãø gel agaroza âäüc láûp, hay ARN cọ thãø bë càõt phán âoản. Gel agaroza chỉïa hydroxyt thu ngán II metyl hay focmaldehyt. 15.3.5 Sỉû phạt hiãûn ADN ADN cọ thãø âỉåüc phạt hiãûn nhåì sỉû phạt hunh quang ca liãn kãút etydi bromua (C 2 H 10 BrN 3 ) hay nhåì phỉång phạp chủp nh bàòng tia X ca âäưng vë phọng xả ADN. Etydi bromua (0,5 µg/ml) cọ thãø âỉåüc thãm vo dung dëch âãûm di chuøn, âãø quan sạt sỉû biãún âäüng ca máùu, vç sỉû phạt hunh quang ca thúc nhüm dỉåïi tạc dủng ca tia cỉûc têm s âỉåüc biãøu hiãûn åí dảng di (âãø xạc âënh âỉåüc sỉû biãún âäøi âọ; tàõt ngưn cung cáúp nàng lỉåüng v chuøn âäøi thnh pháưn agaroza c ra nàõp thiãút bë âënh tia cỉûc têm gáưn khay váûn hnh. Âàût nàõp lải v báût ân âãø bàõt lải sỉû âiãûn di). Ngoi ra, sau khi âiãûn di, gel biãún mu trong dung dëch ho tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H 2 O) khong tỉì 10 âãún 60 phụt räưi quan sạt v chủp nh máùu bàòng phỉång phạp chiãúu tia cỉûc têm. Âãø chủp nh gel, dng phỉång phạp chiãúu tia cỉûc têm trãn bãư màût tải mäùi vë trê åí âéa váûn hnh hồûc di chuøn nhẻ bn gel trãn bãư màût s quan sạt âỉåüc täúi âa (Âéa váûn hnh cọ 95 % ạnh sạng tràõng våïi bỉåïc sọng 254 nm v 40 % ạnh sạng tràõng våïi bỉåïc sọng 254 nm). Quan sạt máùu bàòng tia cỉûc têm åí bỉåïc sọng 366 nm hồûc lm gim cỉåìng âäü tia cỉûc têm xúng 302 nm âãø gim sỉû phạt hunh quang ca etydi bromua khäng liãn kãút, gel cọ thãø bë máút mu båíi sỉû hụt áøm ca nọ trong 5 phụt våïi MgCl 2 0,01M hồûc trong 1 giåì våïi MgSO 4 0,001M. Sỉû máút mu â tảo âiãưu kiãûn dãù dng âãø phạt hiãûn hm lỉåüng ADN nh. 15.3.6. Nhỉỵng chụ cáưn thiãút Nàõp an ton phi âỉåüc làõp trỉåïc khi näúi ngưn âiãûn våïi ngưn cung cáúp nàng lỉåüng. 330 Tàõt táút c cạc cäng tàõc âiãûn v ngàõt ngưn cung cáúp âiãûn trỉåïc khi thạo nàõp an ton. Trỉåïc khi sỉí dủng láưn âáưu, lm âáưy läù våïi 1 lỉåüng 600 ml 50/50 etylen glycol/ nỉåïc âãø ngàn chàûn sỉû täøn tháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë. Läù chỉïa lỉåüng trãn cọ thãø âäø âáưy ngay c khi khäng cáưn lm lảnh theo u cáưu. Khäng sỉí dủng nỉåïc cáút, cháút chäúng âäng thỉång mải hồûc báút k dung mäi hỉỵu cå no âãø âäø vo läù âọ. Nỉåïc âỉåüc láúy ra khi âọng bàng. Nãúu khäng nọ bë hụt vo bãn trong dung dëch v phạ våỵ liãn kãút. Dung mäi hỉỵu cå s gáy ra sỉû täøn tháút hoạ cháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë. Khäng lm lảnh lỉåü ng dung dëch cho vo läù âọ dỉåïi −20 0 C (−4 0 F). Cọ thãø lm lảnh lỉåüng dung dëch âọ trong thng âạ, mạy lm lảnh hồûc trong t lảnh. Khäng âiãưu chènh nhiãût âäü dung dëch âãûm hồûc gel trãn 50 0 C. Ngàn chàûn sỉû âun nọng quạ nhiãût bàòng cạch lm lảnh lỉåüng dung dëch âọ trỉåïc khi sỉí dủng. Âãø ngàn chàûn sỉû âun nọng quạ nhiãût trong quạ trçnh kẹo di chảy âiãûn ạp cao, thay thãú lỉåüng dung dëch thỉï nháút bàòng lỉåüng dung dëch thỉï 2 â âỉåüc lm lảnh. Sỉû âun nọng quạ nhiãût s gáy ra sỉû täøn tháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë Lm sảch Sau mäùi láưn sỉí dủng, lm sảch thiãút bë bàòng cháút táøy nhẻ v nỉåïc, sục cáøn tháûn våïi nỉåïc cáút v lm khä bàòng khäng khê. Khäng âỉåüc âàût thiãút bë vo dung dëch hồûc khê thåm hồûc cạc hydrocacbon halogen hoạ, xeton, este, alcol (trãn 30%) hồûc axit âàûc (trãn 25%). Âãø trạnh lm báøn DNaza v ARNza, ngám cạc khoang chỉïa âãûm hồûc khn âục khong 10 phụt trong dung dëch H 2 O 2 3%, sau âọ sục cáøn tháûn våïi DEPC âỉåüc xỉí l räưi cho vo näưi háúp (dng nỉåïc â âỉåüc ion hoạ âãø háúp). Thay thãú miãúng bt âãûm Thạo nhỉỵng miãúng bt âãûm mn. Thạo v miãúng âãûm måïi. Sàõp âãûm cho thàóng v âãø nọ vo vë trê cúi ca khay dc theo cảnh ngàõn (7 cm), màût sau ca tỉåìng v sau âọ ẹp vo âụng vë trê. Làûp lải våïi miãúng âãûm thỉï hai trãn tỉåìng âäúi diãûn våïi miãúng âãûm thỉï nháút. 15.3.7. Âiãưu chènh thiãút bë âiãûn di Bãø chàõn máùu. Âãø cho gel âàûc lải täúi thiãøu l 30 phụt v giỉỵ åí nhiãût âäü phng trỉåïc khi thạo lỉåüc. Khi tha ïo lỉåüc giỉỵ åí cảnh ngàõn v náng nhẻ âãø trạnh gáùy gel. Giỉỵ âãø khäng hng bãø chỉïa, dng pipet âãø láúy máùu, cäú gàõng cho vo giỉỵa bãø v khäng lm thng âạy bãø. 331 Mỏựu thổớ khọng chaỷy doỹc theo cọỹt Nóỳu chaớy thaỡnh sồỹi trón khay bở hoớng thỗ phaới thay thóỳ. Giaớm õióỷn aùp. Choỹn chỏỳt õóỷm vồùi nọửng õọỹ vaỡ haỡm lổồỹng dung dởch õóỷm thờch hồỹp (lổồỹng dung dởch õóỷm TBE chổùa nhióửu hồn loaỷi TAE). Nóỳu chỏỳt õóỷm bở thaùo ra hóỳt thỗ ngổng hoaỷt õọỹng, thaùo nừp, duỡng ọỳng huùt lỏỳy chỏỳt õóỷm tổỡ lọự khaùc cho vaỡo bón trong lọự õọỳi dióỷn õóỳn khi õỏửy chỏỳt õóỷm. Nóỳu chỏỳt gel khọng õọửng nhỏỳt, õỷt khuọn õuùc nũm ngang trổồùc khi õọứ dọửn gel (õóứ laỡm hoaỡ lỏựn vaỡo nhau). Cỷp khuọn õuùc Lổồỹc phaới õỷt thúng õổùng õóứ traùnh laỡm bióỳn daỷng bóứ chổùa. Giaớm lồùp õóỷm 1 mm tổỡ bóử mỷt ồớ phờa trón gel, giaớm gradien nhióỷt õọỹ. Taùi taỷo gel khọng õuớ chỏỳt lổồỹng Thóm ficoll, glyxerol hay õổồỡng (mờa) vaỡo nhióửu dung dởch lỏỳy mỏựu õóứ baớo õaớm mỏựu lừng xuọỳng õaùy bóứ (choỹn chỏỳt ficoll) Chừc chừn mỏựu thổớ õổồỹc hoaỡ tan hoaỡn toaỡn. Giaớm õióỷn thóỳ. Giaớm nọửng õọỹ mỏựu thổớ. Giaớm thóứ tờch mỏựu. Cỏửn ờt nhỏỳt 1 mm gel dổồùi õaùy lổồỹc õóứ traùnh mỏựu rố ra tổỡ õaùy bóứ. Giaớm nọửng õọỹ muọỳi trong mỏựu thổớ. Kióứm tra õọỹ enzim, mỏựu thổớ coù thóứ cỏửn taùc õọỹng lỏu (xuùc taùc xaớy ra quaù trỗnh) vaỡ mọỹt loaỷi chỏỳt õóỷm khaùc haỷn chóỳ sổỷ di chuyóứ n. Pha chóỳ mỏựu mồùi nóỳu nghi ngồỡ mỏựu bở nhióựm bỏứn. Choỹn loaỷi agaroza vồùi tọỳc õọỹ thỏứm thỏỳu chỏỷm. ỷt khay õuùng vở trờ, khọng ỏỳn maỷnh vaỡo bón trong. . 15 .2. Âiãûn ạp âàût vo v thåìi gian âãư nghë (1) Âiãûn ạp, V Gradient, V/cm Thåìi gian, phụt 500 40 5 (1) 400 31 10 (1) 300 24 20 (1) 20 0 16 30 ÷ 40 150 12 30 ÷ 60 Ghi ch :. nhiãût cáưn thiãút. Chøn bë 600 ml våïi 50/50 C 2 H 2 (OH) 2 /H 2 O - Âãø giụp xem cạc bãø chỉïa âỉåüc r rng hån trong khi nảp máùu, thãm 1 hồûc 2 git thúc nhüm ho tan hồûc mu thỉûc pháøm vo. âiãûn di ca cạc mnh våỵ ADN âäúi våïi cạc loải cháút khạc Âiãûn di, % Hiãûu qu ca nhỉỵng âoản thàóng âäúi våïi sỉû phán gii 0,5 1,0 ÷ 3,0 0,7 0,8 ÷ 12 1,0 0,5 ÷ 10 1 ,2 0,4 ÷ 7 1,5 0,2