KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 4 ppt

CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌCCó ái lực với Digoxigenin anti-Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có ái lực với streptavidinDùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP... ĐÁNH DẤU BẰ

LAI PHÂN TỬ

1 ĐÁNH DẤU MẪU DÒ DNA, RNA,

OLIGONUCLEOTIDE

2 CÁC KIỂU LAI

W Lai trong pha lỏng

W Lai trên pha rắn (Southern, Northern, dot blot)

W Lai tại chỗ

3 ỨNG DỤNG

CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC

Có ái lực với Digoxigenin

anti-Dùng phối hợp với dATP, dCTP,

dGTP, dTTP

Có ái lực với streptavidinDùng phối hợp với dATP, dCTP,

dGTP, dTTP

ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN

Đánh dấu mẫu dò (probe) Ỉ Lai với trình tự mục tiêu Ỉ Phát hiện phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang

PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION

W “Đục lỗ” trên 2 mạch của DNA bằng Dnase I

W DNA polymerase I sửdụng haọt tính 5’-3’

exonuclease “gặm” mạch DNA theo chiều 5’-3’

W DNA polymerase I vừa thủy phân vừa tổng hợp mạch mới bù vào lỗ trống với các dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP đánh dấu)

W Kết quả là probe được đánh dấu

PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING

W Biến tính mạch đôi DNA

W Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu

nhiên trên 2 mạch

6 4 = 1296 primers

W DNA polymerase tổng hợp bù

vào chỗ trống bằng các dNTP trong đó có nucleotide đánh dấu

W Kết quả là probe đánh dấu

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU OLIGONUCLEOTIDE SỬ DỤNG TERMINAL TRANSFERASE

TỔNG HỢP MẪU DÒ RNA BẰNG PHIÊN MÃ IN VITRO

W Trình tự sẽ dùng làm probe được tạo dòng vào vector biểu hiện

W Tùy mạch muốn dùng làm probe sẽ sử dụng promoter tương ứng

W RNA polymerase nhận biết promoter đặc hiệu, gắn vào và tổng hợp RNA

W Nucleotide tự do dùng trong quá

trình phiên mã có mang một phần

nucleotide đánh dấu

W Kết quả là mẫu dò RNA đánh dấu (riboprobe)

TỔNG HỢP MẪU DÒ RNA BẰNG PCR VÀ

Mẫu dò RNA

Thay vì tạo dòng thì sử dụng PCR để gắn thêm trình tự promoter phù hợp

Quá trình tiếp theo giống như tạo dòng

SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT (tiếp)

Tách chiết & cắt DNA bằng enzyme giới hạn

Điện di Chuyển lên màng lai Lai và phát hiện phân tử lai

Biến tính DNA Tiền lai

LAI TRÊN PHA RẮN

& PHÁT HIỆN PHÂN TỬ LAI BẰNG ĐỒNG

VỊ PHÓNG XẠ

Cố định

DNA lên

màng lai

Lai với mẫu

dò đánh dấu

SOUTHERN NORTHERN BLOT

-KẾT QUẢ NORTHERN BLOT

Ghi chú : UN : Mẫu chứng khôn cảm ứng, 48h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 48 giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 96 giờ Mẫu dò đồng vị phóng xạ

DOT BLOT

Tách chiết DNA, RNA Ỉ Biến tính

(nếu có) Ỉ Đặt lên màng lai Ỉ Tiền

lai Ỉ Lai với mẫu dò (trình tự đã

biết) Ỉ Phát hiện phân tử lai

Dùng để phát hiện, hoặc định lượng tương đối khi so với thang hàm

lượng đã biết

Phương pháp cải biên là reverse dot blot Trình tự đã biết được cố định trên giá thể còn trình tự cần biết (mục tiêu) được đánh dấu

Liên kết với kháng thể 1 &

2 Rửa để loại kháng thể thừa

Phát hiện màu thông qua phản ứng enzyme

CẮT MẪU CHO LAI “TẠI CHỖ” ( IN SITU

HYBRIDIZATION)

KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ

LAI “TẠI CHỖ” TRÊN PHÔI

Cố định mẫu (formol, đông lạnh) Ỉ Cắt lát mỏng (microtome) Ỉ Cố định

trên lam kính Ỉ Xử lý mẫu trước khi lai Ỉ Tiền lai Ỉ Lai với mẫu dò

đánh dấu hóa học hay đồng vị phóng xạ Ỉ Rửa Ỉ Phát hiện phân tử lai

Ỉ Quan sát dưới kính hiển vi

NGUYÊN TẮC CỦA MICROARRAY

- Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy

- Phiên mã ngược thành cDNA có đánh dấu huỳnh quang khác nhau

- Trộn chung 2 loại cDNA đánh dấu

- Rửa, loại các thành phần thừa

- Đo cường độ phát huỳnh quang ở từng điểm :

Điểm phát màu vàng : gene biểu hiện như nhau trong 2 lọai tế bào

Điểm phát màu xanh : gene của tế bào nuôi trong glucose biểu hiện mạnh hơn Điểm phát màu đỏ : gene của tế bào nuôi trong ethanol biểu hiện mạnh hơn

KẾT QUẢ MICROARRAY

VÍ DỤ : PHÁT HIỆN BỆNH HỒNG CẦU HÌNH LIỀM BẰNG SOUTHERN BLOT

KỸ THUẬT “ĐI BỘ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ

(CHROMOSOME WALKING)

KẾT QUẢ RFLP TRONG NGHIÊN CỨU

PHẢ HỆ

CÂU HỎI PHẦN 4

1 Cách đánh dấu mẫu dò bằng đồng vị phóng xạ ? Bằng hóa học ? Ưu nhược điểm của từng loại tác nhân ?

2 Cách đánh dấu mẫu dò có bản chất là DNA, RNA, oligonucleotide

3 Southern blot z Northern blot z dot blot đuợc thực hiện như thế nào ?

4 Cho ví dụ về việc sử dụng reverse dot blot

5 Cách tiến hành Southern blot, Northern blot, dot blot

6 Ứng dụng của Southern blot, Northern blot, dot blot

7 Cách tiến hành và ứng dụng của phương pháp lai tại chỗ

8 Cách phát hiện phân tử lai với mẫu dò đồng vị phóng xạ ? Hóa học ?

9 Cách tiến hành phương pháp sử dụng microarray và ứng dụng của microarray

10 Kỹ thuật đi bộ trên nhiễm sắc thể : cách làm và ứng dụng