KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 4 ppt

LAI PHÂN TỬ 1. ĐÁNH DẤU MẪU DÒ DNA, RNA, OLIGONUCLEOTIDE 2. CÁC KIỂU LAI W Lai trong pha lỏng W Lai trên pha rắn (Southern, Northern, dot blot) W Lai tại chỗ 3. ỨNG DỤNG CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC Có ái lực với anti- Digoxigenin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có ái lực với streptavidin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN Đánh dấu mẫu dò (probe) Ỉ Lai với trình tự mục tiêu Ỉ Phát hiện phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang PH Ư ƠNG PHA Ù P NICK TRANSLATION W “Đục lỗ” trên 2 mạch của DNA bằng Dnase I W DNA polymerase I sử dụng haọt tính 5’-3’ exonuclease “gặm” mạch DNA theo chiều 5’-3’ W DNA polymerase I vừa thủy phân vừa tổng hợp mạch mới bù vào lỗ trống với các dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP đánh dấu) W Kết quả là probe được đánh dấu PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING W Biến tính mạch đôi DNA W Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu nhiên trên 2 mạch 6 4 = 1296 primers W DNA polymerase tổng hợp bù vào chỗ trống bằng các dNTP trong đó có nucleotide đánh dấu W Kết quả là probe đánh dấu PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU OLIGONUCLEOTIDE PHAÛN ÖÙNG PHOSPHATASE PHAÛN ÖÙNG KINASE PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU OLIGONUCLEOTIDE SÖÛ DUÏNG TERMINAL TRANSFERASE TỔNG HP MẪU DÒ RNA BẰNG PHIÊN MÃ IN VITRO W Trình tự sẽ dùng làm probe được tạo dòng vào vector biểu hiện W Tùy mạch muốn dùng làm probe sẽ sử dụng promoter tương ứng W RNA polymerase nhận biết promoter đặc hiệu, gắn vào và tổng hợp RNA W Nucleotide tự do dùng trong quá trình phiên mã có mang một phần nucleotide đánh dấu W Kết quả là mẫu dò RNA đánh dấu (riboprobe) TỔNG HP MẪU DÒ RNA BẰNG PCR VÀ PHIÊN MÃ IN VITRO gene A T7 promoter PCR Phiên mã in vitro với T7 RNA polymerase Mẫu dò RNA Thay vì tạo dòng thì sử dụng PCR để gắn thêm trình tự promoter phù hợp Quá trình tiếp theo giống như tạo dòng SOUTHERN BLOT [...]... : PHÁT HIỆN BỆNH HỒNG CẦU HÌNH LIỀM BẰNG SOUTHERN BLOT - Tách DNA - Cắt bằng enzyme MstII - Chạy điện di - Lai với mẫu dò -globin đánh dấu phóng xạ - Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi mẫu DNA bệnh dựa vào kích thước trình tự cho tín hiệu lai KỸ THUẬT “ĐI BỘ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ (CHROMOSOME WALKING) KẾT QUẢ RFLP TRONG NGHIÊN CỨU PHẢ HỆ CÂU HỎI PHẦN 4 1 Cách đánh dấu mẫu dò bằng đồng vò phóng xạ ? Bằng hóa... kính Rửa Phát hiện phân tử lai đánh dấu hóa học hay đồng vò phóng xạ Quan sát dưới kính hiển vi NGUYÊN TẮC CỦA MICROARRAY - Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy - Phiên mã ngược thành cDNA có đánh dấu huỳnh quang khác nhau - Trộn chung 2 loại cDNA đánh dấu - Rửa, loại các thành phần thừa - Đo cường độ phát huỳnh quang ở từng điểm : Điểm phát màu vàng : gene biểu hiện như nhau trong 2 lọai tế bào Điểm phát màu... hạn Điện di Chuyển lên màng lai Biến tính DNA Lai và phát hiện phân tử lai Tiền lai LAI TRÊN PHA RẮN & PHÁT HIỆN PHÂN TỬ LAI BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ Cố đònh DNA lên màng lai Lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ Rửa màng lai Thực hiện phóng xạ tự ghi SOUTHERN NORTHERN BLOT KẾT QUẢ NORTHERN BLOT Ghi chú : UN : Mẫu chứng khôn cảm ứng, 48 h : mẫu cảm ứng tạo -globin sau 48 giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo -globin sau... hiện như thế nào ? 4 Cho ví dụ về việc sử dụng reverse dot blot 5 Cách tiến hành Southern blot, Northern blot, dot blot 6 Ứng dụng của Southern blot, Northern blot, dot blot 7 Cách tiến hành và ứng dụng của phương pháp lai tại chỗ 8 Cách phát hiện phân tử lai với mẫu dò đồng vò phóng xạ ? Hóa học ? 9 Cách tiến hành phương pháp sử dụng microarray và ứng dụng của microarray 10 Kỹ thuật đi bộ trên nhiễm... blot Trình tự đã biết được cố đònh trên giá thể còn trình tự cần biết (mục tiêu) được đánh dấu WESTERN BLOT Điện di trên gel polyacrylamide Chuyển lên màng lai Liên kết với kháng thể 1 & 2 Rửa để loại kháng thể thừa Phát hiện màu thông qua phản ứng enzyme CẮT MẪU CHO LAI “TẠI CHỖ” (IN SITU HYBRIDIZATION) KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ LAI “TẠI CHỖ” TRÊN PHÔI Cố đònh mẫu (formol, đông lạnh) Cắt lát mỏng . CỦA MICROARRAY - Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy - Phiên mã ngược thành cDNA có đánh dấu huỳnh quang khác nhau - Trộn chung 2 loại cDNA đánh dấu - Rửa, loại các thành phần thừa - Đo cường độ phát. phóng xạ tự ghi SOUTHERN - NORTHERN BLOT KẾT QUẢ NORTHERN BLOT Ghi chú : UN : Mẫu chứng khôn cảm ứng, 48 h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 48 giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 96 giờ. Mẫu. DỤNG CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC Có ái lực với anti- Digoxigenin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có ái lực với streptavidin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP ĐÁNH DẤU