KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 5 ppsx

TAÏO DOØNG HAI CHIE Á N L Ö ÔÏC TAÏO DO Ø NG IN VIVO & IN VITRO NGUYEÂN TA É C TAÏO DO Ø NG ( I N VIVO) CÁC BƯỚC TẠO DÒNG Chuẩn bò vector Chuẩn bò trình tự tạo dòng (insert) Tạo vector tái tổ hợp Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Chọn lọc dòng cần tìm Xử lý enzyme tạo đầu so le, đầu bằng Nối vector/ insert W Hóa biến nạp W Điện biến nạp W Biến nạp bằng siêu âm, … W DNA : tách chiết DNA bộ gene, PCR, tổng hợp W RNA : tách chiết RNA và RT, RT- PCR W Lai với mẫu dò đặc hiệu W PCR với mồi đặc hiệu W Sử dụng kháng thể đặc hiệu CHUẨN BỊ cDNA ĐỂ TẠO DÒNG mRNA Ỉ cDNA Ỉ gắn thêm các linker có mang trình tự nhận biết của RE Ỉ Cắt bằng RE tương ứng tạo đầu so le X Ử LY Ù ĐOẠN GA É N CHE Ø N CO Ù Đ A À U BA È NG W Gắn thêm các linkers mang trình tự nhận biết của RE W Vector có chứa các trình tự nhận biết của RE tương ứng TẠO DÒNG BẰNG PCR W Mồi (primer) dùng trong phản ứng PCR có mang trình tự nhận biết của RE W Sản phẩm PCR được cắt bằng RE phù hợp tạo đầu so le W Nối với vector đã xử lý với cùng loại RE TẠO DÒNG TRONG PLASMID - Tạo plasmid tái tổ hợp - Biến nạp tế bào E. coli : ủ chung với plasmid TTH có hiện diện CaCl2 ; tạo sốc nhiệt - Nuôi trên đóa thạch có ampicillin để chọn dòng vi khuẩn có thu nhận plasmid TTH - Thu nhận các dòng tế bào có chứa plamid TTH pBR322 W Plasmid theá heä thöù nhaát W Plasmid theá heä thöù hai : pBR322 W Plasmid theá heä thöù ba : pUC, pSP, Bluescript, PLASMID pUC18/19 [...]... suy ra từ trình tự amino acid dựa theo mã di truyền, được tổng hợp và đánh dấu, sau đó đem lai với màng lai có mang cá trình tự DNA đã được cố đònh CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG KHÁNG THỂ Tạo một ngân hàng biểu hiện Cảm ứng cho các protein biểu hiện Phát hiện dòng cần tìm trong ngân hàng biểu hiện với kháng thể đánh dấu và đặc hiệu cho protein biểu hiện CÂU HỎI PHẦN 5 1 Vector dùng để tạo dòng cần có những... virus tái tổ Phủ tiếp lên trên một lớp agar mềm Ủ Mỗi đóa ly giải tương hợp ứng với vùng ly giải do một phần tử virus gây ra PHÁT HIỆN ĐĨA LY GIẢI CÓ CHỨA DÒNG CẦN TÌM Hộp thạch với các đóa ly giải p màng lai lên mặt thạch Ủ màng lai trong dung dòch kiềm để ly giải phage giải phóng DNA phage Tiền lai - Lai với mẫu dò Phát hiện phân tử lai TỔNG HP M13 MẠCH ĐÔI COSMID VECTOR PHC79 TẠO DÒNG BẰNG VECTOR COSMID... dòng cần có những đặc điểm gì 2 Có những loại vector nào ? Ưu nhược điểm của các loại ấy ? Ứng dụng của chúng ? 3 Đặc điểm của các vector plasmid pUC, pSP, Bluescript 4 Mô tả cách sử dụng vector là phage 5 Vector biểu hiện dùng để làm gì ? Cho ví dụ 6 Vcetor con thoi dùng để làm gì ? Cho ví dụ 7 Mô tả cách tạo ngân hàng bộ gene 8 Mô tả cách tạo ngân hàng cDNA 9 Cách phát hiện dòng cần tìm bằng kháng thể . cùng loại RE TẠO DÒNG TRONG PLASMID - Tạo plasmid tái tổ hợp - Biến nạp tế bào E. coli : ủ chung với plasmid TTH có hiện di n CaCl2 ; tạo sốc nhiệt - Nuôi trên đóa thạch có ampicillin để chọn. bằng siêu âm, … W DNA : tách chiết DNA bộ gene, PCR, tổng hợp W RNA : tách chiết RNA và RT, RT- PCR W Lai với mẫu dò đặc hiệu W PCR với mồi đặc hiệu W Sử dụng kháng thể đặc hiệu CHUẨN BỊ. tạo sốc nhiệt - Nuôi trên đóa thạch có ampicillin để chọn dòng vi khuẩn có thu nhận plasmid TTH - Thu nhận các dòng tế bào có chứa plamid TTH pBR322 W Plasmid theá heä thöù nhaát W Plasmid theá