Bai giang tin sinh hoc 3

THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB Mục tiêu của bài học  Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác)  Phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm Tìm ki m trình t sinh h cế ự ọ 2 Quá trình sao chép DNA trong tế bào Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 3 Qui trình phản ứng PCR Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 4 Các vi sinh vật, động vật Thu nhận mẫu Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do chính phát minh này Mullis đã được trao giải nobel vào năm 1993 Thành phần trong phản ứng PCR Phản ứng PCR được thực hiện khi có:  DNA mẫu  Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18-30 bp không bắt cặp bổ sung )  Taq polymerase ( emzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn suối mước nóng Thermus aquaticus )  4 loại deoxiribomucleotid triphọtphat (dATP , dCTP, dTTP , dGTP) ,  Dung dịch đệm và Mg2+ Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 5 MÁY PCR Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 6 PCR là một kỹ thuật duy nhất để khuếch đại một mẫu DNA mong muốn khuếch đại (ví dụ những đoạn gene của vi sinh vật, vi khuẩn hay những đoạn gene của người và những động vật khác) Nguyên tắc trong phản ứng PCR Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 7 Biến tính Bắt cặp Kéo dài Nguyên tắc trong phản ứng PCR Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 8 Phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn: • Biến tính DNA mẫu T=94 0 C • Bắt cặp mồi Tm = 55 0 C-65 0 C • Giai đoạn kéo dài, tổng hợp DNA mới T kéo dài =70 0 C Mục đích, nguyên tắc  Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5' hay đầu 3' của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại. Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 9 Forward primer Reverse primer Đoạn DNA cần khuếch đại Primer là gì?  Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả năng bắt cặp bổ sung với DNA khuôn  Primer sẽ bắt cặp với đoạn DNA khuôn (DNA mục tiêu) cần khuếch đại số lượng lớn DNA 10 Tìm ki m trình t sinh h cế ự ọ [...]... môn học 30 Chức năng đánh giá Giới thiệu môn học 31 Sử dụng PDA (primer Design Assistnat) http://dbb.nhri.org.tw/primer/ Giới thiệu môn học 32 Sử dụng phần mềm FastPCR Giới thiệu môn học 33 Kết quả phản ứng của Tm của mồi xuôi Giới thiệu môn học 34 Kết quả phân tích mồi ngược Giới thiệu môn học 35 Chức năng đánh giá độ đặc hiệu mồi Giới thiệu môn học 36 ... các sinh vật (chúng ta sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế phản ứng mồi theo trình tự đã giải  Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật trên cơ sở dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những primer qua những phần mềm thiết kế PCR Giới thiệu môn học 18 Trình tự DNA khuôn - Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật - Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh. .. thiệu môn học 23 DNA club Bước 1: Nhập trình tự Giới thiệu môn học 24 DNA club Bước 2: Chọn start primer selection Giới thiệu môn học 25 Những điều kiện của phản ứng PCR Giới thiệu môn học 26 Chức năng đánh giá Giới thiệu môn học 27 Danh sách những đoạn mồi do DNAclub tìm được Giới thiệu môn học 28 Danh sách những đoạn mồi Giới thiệu môn học 29 Chọn những đoạn mồi tốt nhất Giới thiệu môn học 30 Chức năng...Đặc tính của primer 1 Tính chuyên biệt 2 Tính ổn định nhiệt độ của phản ứng 3 Tính tương thích cặp primer Giới thiệu môn học 11 Tính chuyên biệt  Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA Template DNA 5’ TCAACTTAGCATGATCGGGTA GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA 3 ’ CAGTCAACTGCTAC GTTGAACGTA GTTGAACGTA  Primer càng dài thì nó càng thể hiện tính duy nhất và nhiệt...  Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ 12 cho ta nhiệt độ lai Giới thiệu môn học Tính chuyên biệt Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai thích hợp Giới thiệu môn học 13 Nhiệt độ của primer 1 Nhiệt độ nóng chảy: Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi chưa bắt cặp với DNA khuôn Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/ (chiều dài nucleotide) khi mồi chưa bắt cặp với DNA,... Enteropathogenic E coli (EPEC), Enteroinvasive E coli (EIEC), Enterohemorrhagic E coli (EHEC), Enteroaggregative E coli (EAEC) chọn ra những gene đặc trưng cho từng loài ETEC, EPEC, EIEC và EHEC Tìm kiếm trình tự sinh học 19 Tính tương thích  Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược Chúng sử được sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng PCR  Một đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là nhiệt độ bắt . hoặc RNA của các sinh vật (chúng ta sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế phản ứng mồi theo trình tự đã giải.  Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật trên cơ. ự ọ 2 Quá trình sao chép DNA trong tế bào Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 3 Qui trình phản ứng PCR Gi i thi u môn h cớ ệ ọ 4 Các vi sinh vật, động vật Thu nhận mẫu Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis. được trao giải nobel vào năm 19 93 Thành phần trong phản ứng PCR Phản ứng PCR được thực hiện khi có:  DNA mẫu  Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18 -30 bp không bắt cặp bổ sung )  Taq