điện di

ĐIỆN DI ĐỨNG 1. Nguyên lý Nguyên lý của việc điện di là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử dịch chuyển về phía anode với tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung (lỗ hay “giếng” tải mẫu) các phân tử khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn đó có các phân tử khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng – band) khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng. Các phân tử protein do điện tích bề mặt khác nhau nếu điện di trong gel không gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt. Tuy vậy, nếu các protein được xử lý với các chất tẩy ion hóa mạnh như SDS (sodium dodecyl sulphat) và một hợp chất khử, ví dụ như mercapthoethanol, thì các cấu trúc bậc 2, và 4 của phân tử protein sẽ bị phá vỡ. Nghĩa là, sau khi xử lý với SDS, protein trở thành dạng phân tử polymer không có cấu trúc. Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion và làm phân tử protein trở nên tích điện âm đồng đều hơn. Mecarptoethanol thì làm giảm các liên kết disulphit hình thành giữa các tiểu phần cystein. Kết quả là nếu các phân tử protein được gây biến tính bởi SDS và mecarptoethanol thì sự phân tách của các loại phân tử protein trong điện di chủ yếu là do sự khác biệt về trọng lượng và kích thước phân tử. Sau khi điện di, các phân tử protein được nhuộm với các thuốc nhuộm liên kết protein như Coomassie brilliant blue và quan sát. Khi không có SDS, điện di vẫn có thể phân tách được các loại protein, nhưng lúc này còn có các yếu tố khác nhau của các loại protein là trọng lượng phân tử, tổng điện tích và điểm đẳng điện. Hình: Điện di trên gel acrylamide. 2. Các hóa chất sử dụng STT Hóa chất 1 Acrylamide 2 Bis – acrylamide 3 SDS 4 Đệm Tris 5 2 – mercapto ethanol hay Dithiothreitol (DTT) 6 Amonium persulfate 7 Glycerol 8 Bromophenol Blue 9 Coomassie Blue R250 10 Methanol 11 Glaicial acetic acid 12 TEMED 3. Cách pha hóa chất Monomere solution (30% T, 2.7%C) – Dung dịch acrylamide (20ml) - Acrylamide 60g - Bisacrylamide 1.6g - Nước cất vừa đủ 200ml Bảo quản ở 0 – 4 o C. 4X runnning gel buffer (1.5M Tris HCl, pH 8.8) – Đệm gel phân tách (stock separating gel) - Tris base 36.4g - SDS 0.8g - Nước cất 150ml - Chỉnh pH 8.8 với HCl 1N - Thêm nước cất vừa đủ 200ml Bảo quản ở 0 – 4 o C. 4X runnning gel buffer (0.5M Tris HCl, pH 6.8) – Đệm gel gom (stock separating gel) - Tris base 6g - SDS 0.4g - Nước cất 60ml - Chỉnh pH 6.8 với HCl 1N - Thêm nước cất vừa đủ 100ml Bảo quản ở 0 – 4 o C Ammonium persulfate 10% - Ammonium persulfate 1g - Nước cất 10ml Bảo quản ở -70 o C trước khi sử dụng. Dithiothreitol (DTT), 1M: Hòa tan 15.45g DTT trong 100ml nước cất. Dung dịch SDS (10%) - Hòa tan 1g SDS trong H 2 O thành 10ml. - Dung dịch này bảo quản được 6 tháng. 2X treatment buffer (0.125M Tris HCl, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2M DDT, 0.02% bromophenol blue, pH 6.8): dung môi pha mẫu - 4X staking gel buffer 2.5ml - SDS 10% 4ml - Glycerol 2ml - DTT 0.31g - Bromophenol blue 0.002g - Thêm nước cất đầy đủ 10ml Bảo quản ở -70 o C trước khi sử dụng. Tank buffer 5X (0.125M Tris HCl, 0.96M Glycine, 0.5% SDS, pH 8.3) – Đệm điện di (tank buffer) - Tris base 15.1g - Glycine 72g - SDS 5g - Bổ sung nước cất vừa đủ 1lit Bảo quản ở 0 - 4 o C trước khi sử dụng. Staining solution (0.025% coomassie brilliant blue R, 40% methanol acetic acid) – Dung dịch nhuộm protein - Coomassie brilliant blue 0.25g - Methanol 400ml - Acid acetic 70ml - Bổ sung nước vừa đủ 1lit Dung dịch rửa màu • Destaining solution I (40% methanol, 7% acid acetic) - Methanol 400ml - Acid acetic 70ml - Nước cất vừa đủ 1lit • Destaining solution II (5% methanol, 7% acid acetic) - Methanol 50ml - Acid acetic 70ml - Nước cất vừa đủ 1lit Thành phần đổ gel: Running gel Thể tích Stacking gel Thể tích Mono solution 2.5ml Mono solution 0.325ml 4X running gel buffer (pH 8.8) 1.875ml 4X running gel buffer (pH 6.8) 0.625ml H20 3.125ml H2O 1.525ml APS 10% 25μl APS 10% 12.5μl TEMED 5μl TEMED 5μl Trong các thành phần, TEMED cho sau cùng 4. Thực hành Chuẩn bị mẫu - Mẫu khô hoặc dung dịch được hòa tan trực tiếp trong dung dịch pha mẫu hoặc tỉ lệ 1:1 về thể tích giữa mẫu và dung môi pha mẫu sao cho có nồng độ protein khoảng 1mg/ml, đun sôi cách thủy 5 phút, để nguội mới cho vào các giếng của gel. - Pha thang protein chuẩn phân tử lượng thấp (14,4kDa – 94kDa) nếu có. Chuẩn bị gel phân tách - Tạo khuôn bản gel Gel polyacrylamide thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có kết cấu chuyên dụng để làm khuôn. Rửa sạch các tấm thủy tinh bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol. Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào. Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồi đặt tấm thủy tinh có “tai” lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau. - Đệm gel phân tách Khi cho TEMED lắc nhẹ cho tan hết sau đó dùng pipette hoặc micropipette bơm dung dịch gel phân tách vào khoảng hẹp của hai tấm kính (khuôn) mà không tạo bọt khí sao cho mức dung dịch gel cao 8cm, nhẹ nhàng đổ một lớp nước cất trên lớp gel, chờ cho gel cứng (nhờ quá trình polymer hóa xảy ra). Sau khi gel đã cứng hoàn toàn (15 – 30 phút), hút hết nước bên trên sau đó đổ lớp gel gom vào khuôn bằng cách dùng pipette hoặc micropipette, đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng, sau khi gel gần cứng lấy lược ra một cách nhẹ nhàng và từ từ rồi lắp khuôn gel vào độ điện di, cho dung dịch điện di vào hai buồng điện di, bơm từ 5 – 15μl mẫu (ở mục 2) vào giếng theo thứ tự, đậy hộp điện di, đóng điện, tiến hành chạy điện ổn định dòng 2mA/giếng, thường với điện thế khoảng 200V và cường độ dòng điện khoảng 30mA, khoảng 1 giờ sau khi vạch màu chỉ thị xuống gần đến đáy của gel, tách điện và lấy gel ra nhuộm. Các bước tiến hành sau khi đã điện di - Lấy gel ra khỏi tấm kính. - Ngâm gel này trong đĩa petri có chứa thuốc nhuộm protein, lay động nhẹ cho đến khi thuốc nhuộm thấm vào gel, thời gian ngâm 1 – 4 giờ. - Chuyển gel sang ngâm trong dung dịch rửa màu, thay dung dịch rửa mới vài lần cho đến khi gel có màu trong suốt, lúc này sẽ thấy xuất hiện những vạch xanh lơ trên gel, chụp ảnh gel và lưu lại. 5. Kết quả và bàn luận Kết quả Mẫu của nhóm chọn điện di gồm 4 loại enzyme xếp theo thứ tự: amylase, enzyme của nhóm 4, enzyme termamyl thương mại và pectinase. Tất cả được bơm với một lượng 10μl vào mỗi giếng. Sau khi chạy điện di, nhuộm và rửa gel, ta được kết quả: Nhận xét Nhìn từ trái qua : Giếng 1 và 2 chứa enzyme amylase: gel bị loang có thể do quá tải protein tổng, giữa 2 giếng có sự lẫn mẫu qua với nhau do thao tác đổ mẫu hoặc do hỗn hợp acrylamide đổ không đều. Hơn nữa, đây là 2 mẫu đổ đầu tiên vào giếng nên thời gian lưu của 2 mẫu này trước khi chạy điện di là nhiều nhất, vì thế gây sự loang lổ và mẫu không phân tách được. Giếng 3 và 4 chứa enzyme invertase thương mại : kết quả chỉ hiện lên một vạch cho thấy enzyme này có độ tinh sạch cao, không lẫn với các mẫu khác. Giếng 5 và 6 chứa enzyme termamyl thương mại: có vệt xuất hiện nhưng không thấy rõ và vết loang còn đậm màu, có thể do mẫu này cần thời gian chạy điện di nhiều hơn các mẫu khác. Giếng 7,8,9,10 chứa enzyme pectinase: xuất hiện 1 vệt khá rõ và đồng đều. Kết quả điện di các nhóm khác : Nhóm 3 : các vệt xuất hiện nhưng nằm xéo về 1 phía do miếng gel bị kéo về bên phải bởi miếng đệm ngắt điện trường ở các cạnh của gel. Giếng 7,8,9 bị loang và có vẻ liên kết với nhau, điều này có thể do thời gian chạy điện di chưa đủ. Nhóm 5 : xuất hiện 2 vệt nhưng chưa thấy rõ kết quả, có thể mẫu có chứa tạp liên kết với enzyme. Nhóm 7 : không có kết quả, và rửa màu chưa hết. Nhóm 9 : rửa màu chưa sạch, thao tác làm rách gel. . điện di, cho dung dịch điện di vào hai buồng điện di, bơm từ 5 – 15μl mẫu (ở mục 2) vào giếng theo thứ tự, đậy hộp điện di, đóng điện, tiến hành chạy điện ổn định dòng 2mA/giếng, thường với điện. có SDS, điện di vẫn có thể phân tách được các loại protein, nhưng lúc này còn có các yếu tố khác nhau của các loại protein là trọng lượng phân tử, tổng điện tích và điểm đẳng điện. Hình: Điện di. ĐIỆN DI ĐỨNG 1. Nguyên lý Nguyên lý của việc điện di là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử dịch chuyển về phía anode với