kỹ thuật điện di

Ch¬ng 2- §iÖn di Ch¬ng 2- §iÖn di 2.1 Nguyên tắc của phơng pháp 2.1 Nguyên tắc của phơng pháp dựa trên chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch khi đợc dựa trên chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch khi đợc đa vào điện trờng (H. 1). đa vào điện trờng (H. 1). Vì các phân tử trong điện trờng chuyển động với vận tốc khác nhau phụ Vì các phân tử trong điện trờng chuyển động với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào: thuộc vào: điện tích, điện tích, hình d hình d ng, ng, kích thớc, kích thớc, phơng pháp đã đợc phát triển mạnh để tách chúng. phơng pháp đã đợc phát triển mạnh để tách chúng. Phơng pháp khá đơn giản và nhanh, đợc sử dụng để phân tích và tách: Phơng pháp khá đơn giản và nhanh, đợc sử dụng để phân tích và tách: các phân tử rất lớn nh protein và axit nucleic, các phân tử rất lớn nh protein và axit nucleic, các phân tử tích điện khác nhỏ hơn nh đờng, axit amin, peptide, các phân tử tích điện khác nhỏ hơn nh đờng, axit amin, peptide, nucleotide, các ion đơn giản. nucleotide, các ion đơn giản. Các phơng pháp phát hiện có độ nhạy cao đã đợc phát triển để ghi và Các phơng pháp phát hiện có độ nhạy cao đã đợc phát triển để ghi và phân tích các kết quả tách. phân tích các kết quả tách. Cách tiến hành: Cách tiến hành: Đa một lớp mẫu mỏng vào dung dịch đợc ổn định bằng một chất giá Đa một lớp mẫu mỏng vào dung dịch đợc ổn định bằng một chất giá có cấu tạo nhiều khe hở (mạng lới). có cấu tạo nhiều khe hở (mạng lới). Dới tác dụng của hiệu điện thế, các phân tử khác nhau trong mẫu sẽ Dới tác dụng của hiệu điện thế, các phân tử khác nhau trong mẫu sẽ di chuyển qua chất giá với vận tốc khác nhau. di chuyển qua chất giá với vận tốc khác nhau. Chất giá này là cần thiết vì dòng điện khi đi qua dung dịch điện di sẽ Chất giá này là cần thiết vì dòng điện khi đi qua dung dịch điện di sẽ tạo nhiệt (là nhân tố gây ra sự khuếch tán) và trộn lẫn các băng khi tạo nhiệt (là nhân tố gây ra sự khuếch tán) và trộn lẫn các băng khi thiếu môi trờng tạo cân bằng. thiếu môi trờng tạo cân bằng. Chất giá có thể đợc cấu tạo từ một số vật liệu khác nhau: Chất giá có thể đợc cấu tạo từ một số vật liệu khác nhau: giấy, giấy, acetate cellulose, acetate cellulose, polyacrylamide, polyacrylamide, agarose, agarose, tinh bột tinh bột . . Trong các gel polyacrylamide và agarose, chất giá còn có tác dụng Trong các gel polyacrylamide và agarose, chất giá còn có tác dụng sàng lọc (rây) lựa chọn theo kích thớc để tách. sàng lọc (rây) lựa chọn theo kích thớc để tách. Các phân tử sau khi tách có thể đợc phát hiện dới dạng các băng Các phân tử sau khi tách có thể đợc phát hiện dới dạng các băng (vệt) ở các vị trí khác nhau trong chất giá bằng cách: (vệt) ở các vị trí khác nhau trong chất giá bằng cách: nhuộm nhuộm sử dụng phơng pháp phóng xạ tự ghi, sử dụng phơng pháp phóng xạ tự ghi, đợc định lợng bằng cách quét (scan) trên mật độ kế, đợc định lợng bằng cách quét (scan) trên mật độ kế, gel đợc làmg khô để bảo quản lâu dài. gel đợc làmg khô để bảo quản lâu dài. Gel Gel polyacryamide polyacryamide và và agarose agarose (hình 1.2) là môi trờng tạo (hình 1.2) là môi trờng tạo ổn định hay sử dụng nhất trong các phòng thí nghiệm nghiên ổn định hay sử dụng nhất trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu. cứu. Gel thờng đợc tạo thành ở dạng: Gel thờng đợc tạo thành ở dạng: thỏi (trong ống), thỏi (trong ống), bản bản lá mỏng lá mỏng để tách protein để tách protein : gel polyacrylamide là chất giá thông thờng : gel polyacrylamide là chất giá thông thờng nhất, nhất, để tách axit nucleic để tách axit nucleic : có thể dùng một trong hai loại gel kể : có thể dùng một trong hai loại gel kể trên tuỳ thuộc vào kích thớc của các phân tử cần tách. trên tuỳ thuộc vào kích thớc của các phân tử cần tách. Việc lựa chọn chất giá và nồng độ (gel) ảnh hởng lên sự Việc lựa chọn chất giá và nồng độ (gel) ảnh hởng lên sự tách dựa trên kích thớc. tách dựa trên kích thớc. Trong phần lớn các máy điện di, gel đợc đặt giữa hai buồng chứa Trong phần lớn các máy điện di, gel đợc đặt giữa hai buồng chứa đệm để dòng điện đợc nối qua gel giữa chúng. đệm để dòng điện đợc nối qua gel giữa chúng. Mối tiếp xúc giữa đệm và gel có thể là tiếp xúc lỏng trực tiếp (H. 1.3 Mối tiếp xúc giữa đệm và gel có thể là tiếp xúc lỏng trực tiếp (H. 1.3 A, B, C) hoặc qua một băng giấy hoặc gel. (H. 1.3 D). A, B, C) hoặc qua một băng giấy hoặc gel. (H. 1.3 D). Gel ống đứng hoặc bản (H1.3 A, B) (có tiếp xúc đệm trực tiếp) là hiệu Gel ống đứng hoặc bản (H1.3 A, B) (có tiếp xúc đệm trực tiếp) là hiệu quả nhất về sử dụng điện trờng quả nhất về sử dụng điện trờng Gel có thể có kích cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ cần Gel có thể có kích cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ cần tách và lợng mẫu. tách và lợng mẫu. Các gel ống phân tích thờng đợc đổ trong các ống thủy tinh Các gel ống phân tích thờng đợc đổ trong các ống thủy tinh với đờng kính trong 1- 5 mm và chiều dài 5- 25 cm. với đờng kính trong 1- 5 mm và chiều dài 5- 25 cm. Các gel ống chế phẩm có thể đến đờng kính 10 cm để phù Các gel ống chế phẩm có thể đến đờng kính 10 cm để phù hợp với lợng lớn nguyên liệu. hợp với lợng lớn nguyên liệu. Ngợc lại, các gel trong ống mao dẫn (có đờng kính 50- 100 Ngợc lại, các gel trong ống mao dẫn (có đờng kính 50- 100 à à m và dài 30- 100 mm) cho phép: m và dài 30- 100 mm) cho phép: có độ phân giải rất cao có độ phân giải rất cao tách nhanh tách nhanh cần một lợng mẫu rất nhỏ cần một lợng mẫu rất nhỏ Gel bản thờng đợc đổ giữa một cặp bản kính. Gel bản thờng đợc đổ giữa một cặp bản kính. Buồng đệm đợc tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh Buồng đệm đợc tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh spacer (tạo bề dày) ở hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo spacer (tạo bề dày) ở hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo buồng kín (H. 1.4). buồng kín (H. 1.4). Gel bản có kích thớc từ 2,5 cm Gel bản có kích thớc từ 2,5 cm 2 2 (giữa hai lamen của kính hiển vi) đến (giữa hai lamen của kính hiển vi) đến 30. 150 cm 30. 150 cm 2 2 và độ dày từ <0,05 mm đến > 10 mm. và độ dày từ <0,05 mm đến > 10 mm. - Các thông số dòng điện Các thông số dòng điện Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống. Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống. Vận tốc của phân tử tỉ lệ thuận với gradient hiệu điện thế xung Vận tốc của phân tử tỉ lệ thuận với gradient hiệu điện thế xung quanh. quanh. Có 2 phơng trình điện cơ bản quan trọng trong điện di. Có 2 phơng trình điện cơ bản quan trọng trong điện di. 1. 1. Thứ nhất là Thứ nhất là định luật Ohm định luật Ohm : : V = IR V = IR hoặc hoặc I = V/R I = V/R Định luật Ohm liên kết: Định luật Ohm liên kết: hiệu điện thế (V) đo bằng vôn (V), hiệu điện thế (V) đo bằng vôn (V), dòng điện (I) đo bằng ampe (A), dòng điện (I) đo bằng ampe (A), điện trở (R) đo bằng ohm ( điện trở (R) đo bằng ohm ( ). ). Phơng trình cơ bản thứ hai trong điện di liên quan đến power, nó Phơng trình cơ bản thứ hai trong điện di liên quan đến power, nó miêu tả lợng nhiệt thoát ra trong mạng; miêu tả lợng nhiệt thoát ra trong mạng; P = VI P = VI hoặc hoặc P = I2R P = I2R hoặc hoặc P = V2/ R P = V2/ R với P là công suất (power- đo bằng watt (W). với P là công suất (power- đo bằng watt (W). Lợng nhiệt này còn đợc biết đến nh nhiệt đo bằng Joule. Lợng nhiệt này còn đợc biết đến nh nhiệt đo bằng Joule. Trong mạch điện di, điện thế và dòng điện đợc nguồn điện DC Trong mạch điện di, điện thế và dòng điện đợc nguồn điện DC cung cấp, dây chì, điện cực, đệm và gel là những resistor đơn giản. cung cấp, dây chì, điện cực, đệm và gel là những resistor đơn giản. [...]... cho độ phân giải cao hơn nhiều  Trong điện di ngắt quãng, độ di động của 1 protein (số đo tốc độ của 1 phần tử tích điện trong điện trường) là trị số trung bình giữa: độ di động của ion đệm trong gel cô (leading-ion dẫn, đi trước) và độ di động của ion trong buồng điện di trên (trailing-ion- được kéo theo sau) Khi điện di bắt đầu, các ion và protein bắt đầu di động vào gel cô Protein được cô đặc... ngược lại Để tách protein bằng điện di dựa trên sự di động của các phân tử khác nhau, pH dung dịch cần được giữ ổn định để duy trì điện tích và từ đó là độ di động của protein Do vậy, vì sự điện ly nước tạo ra H+ ở anode và OH- ở catode, dung dịch điện di cần phải được đệm hoá - Tác động của nhiệt lên quá trình tách Sự điều khiển nhiệt là then chốt trong mỗi bước của điện di Ví dụ, sự polymer hoá của... - Đặc điểm của điện di trên gel agarose: 1 ứng dụng để để tách và phân tích AND 2 Lựa chọn hệ thống đệm, nồng độ gel, điều kiện chạy (dòng điện, thời gian, nhiệt độ ) thích hợp 3 Sử dụng EtBr và tia UV để phát hiện các băng ADN trên gel - Điện di trên gel polyacrylamid Điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS- PAGE): tách protein dựa trên KLPT (MW) Khi tách bằng SDS PAGE, sự di động được xác... phải do điện tích của chuỗi polypeptide, mà do khối lượng phân tử (MW) SDS (sodium dodecylsulfate) là một chất tẩy anion gây biến tính protein bằng cách bao quanh bộ khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng Mỗi phân tử SDS sẽ cung cấp hai điện tích âm, các phân tử protein sẽ được tích điện tỉ lệ với khối lượng phân tử của chúng SDS-PAGE Trong điện di biến tính trên gel polyacrylamide (điện di có... dựa vào đó có thể đánh giá về: độ sạch, mức độ biểu hiện, điện chuyển miễn dịch, chuẩn bị phân tích trình tự, tạo các kháng thể nhờ SDS-PAGE  Có hai kiểu hệ thống đệm trong điện di: liên tục và ngắt quãng (discontinuous) Hệ thống liên tục chỉ có 1 gel tách duy nhất và sử dụng cùng 1 loại đệm cho gel và để chạy điện di Trong điện di ngắt quãng (Ornstein và Davis, 1964), 1 lớp gel có mạng lưới... Nguồn điện dùng cho điện di giữ một thông số (hoặc dòng, hiệu điện thế, hoặc công suất) cố định Tuy nhiên, điện trở của mạch không cố định trong quá trình chạy Điện trở đệm giảm cùng với sự tăng của nhiệt độ do nhiệt (Joule) Điện trở cũng thay đổi khi vùng ion đệm ngắt quãng chuyển động qua gel , trong trường hợp của SDS- PAGE ngắt quãng, điện trở tăng khi chạy Phụ thuộc... Proteins with different isoelectric points are thus distributed differently throughout the gel (Tab ) Two dimensional electrophoresis The combination of these two different electrophoretic methods in twodimentional gels permits the resolution of complex mixture of proteins (Fig ) and with more sensitivity Two-dimentional electrophoresis separate proteins of identical molecular weight that difer in pI,... to its molecular weight, Mr - Điện di phân vùng đẳng điện protein Giới thiệu chung -Điện di hai chiều (2D-PAGE) Giới thiệu chung ứng dụng của 2D-PAGE Isoelectric focusing is a procedure used to determine the isoelectric point (pI) of a protein (Figure ) A pH gradient is established by allowing a mixture of low molecular weight organic acid and bases (ampholytes) to distribute themselves in an electric... có thể tích điện âm hoặc dương, vì chúng có chứa cả hai loại gốc acid và base Axit nucleic không phải lưỡng tính và tích điện âm ở đa số đệm điện di (do bản chất axit mạnh của các nhóm phosphate của bộ khung) Đa số điện tích protein có được là từ sự ion hoá (phụ thuộc pH) của các nhóm carboxyl và amino của mạch bên: - COOH COO- + H+ - NH2 + H+ NH3+ His- một a.a kiềm yếu cũng có chứa điện tích gần... chất khử), độ di động của các phân tử được xác định không phải bằng điện tích của protein, mà bằng khối lượng phân tử của chúng SDS (sodium dodecylsulfate) là 1 chất khử anionic gây biến tính protein bằng cách bao quanh khung polypeptide và tích điện âm cho nó tỉ lệ với chiều dài của mạch Khi được xử lý bằng SDS và chất khử, các protein đều có dạng hình cầu tích điện âm với cùng số điện tích trên . nhiệt đo bằng Joule. Trong mạch điện di, điện thế và dòng điện đợc nguồn điện DC Trong mạch điện di, điện thế và dòng điện đợc nguồn điện DC cung cấp, dây chì, điện cực, đệm và gel là những resistor. dòng điện Các thông số dòng điện Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống. Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống. Vận tốc của phân tử tỉ lệ thuận với gradient. chì, điện cực, đệm và gel là những resistor đơn giản. Nguồn điện dùng cho điện di giữ một thông số (hoặc dòng, hiệu điện Nguồn điện dùng cho điện di giữ một thông số (hoặc dòng, hiệu điện