Liệu pháp gen (human gene therapy)

Khi đưa các gen mã hóa đó vào cơthể sống sẽ tạo ra protein đặc hiệu để ức chế, kìm hãm gen khác gây bệnh, hoặckìm hãm sự tăng sinh quá nhanh của tế bào, hoặc cũng có thể gây chết tế bào

1.2 Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen.

2 Phân loại liệu pháp gen

3 Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen

3.1 Cơ sở của liệu pháp gen

3.2 Các bước cơ bản trong liệu pháp gen

3.3 Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp

4 Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen

4.1 Vector chuyển gen có bản chất virus

4.1.1 Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó.4.1.2 Vector Adenovirus

4.1.3 Vector Adeno-associated Virus (AAV)

1 Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức năng gen

2 Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư

3 Liệu pháp gen chữa bệnh do sự thay đổi chức năng của Protein

4 Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo

5 liệu pháp gen chữa bệnh HIV /AIDS

6 Liệu pháp gen chữa bệnh khác

IV Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiệm vụ hàng đầu của CNSH là giải quyết vấn đề mạng sống mà mỗi conngười đều phải trải qua là sinh, lão, bệnh, tử CNSH đang tập trung nỗ lực tìm racác hướng đi để chữa khỏi các căn bệnh di truyền cũng như các căn bệnh hiểmnghèo Trong đó liệu pháp gen là một kĩ thuật cao của CNSH có ý nghĩa quantrọng trong giải quyết nhiệm vụ này Do đó, chúng tôi chọn chủ đề Liệu pháp gen

để trình bày trong bài seminar hôm nay

II NỘI DUNG

1 Khái niệm

1.1 Định nghĩa liệu pháp gen

Liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào cơ thể thay thếcho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạtđựơc mục tiêu của liệu pháp

- Gen liệu pháp là các gen có chức năng sử dụng vào điều trị bệnh cho con ngừơi.Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm và chức năng riêng Gen liệu pháp có thể là:+ Các gen lành đưa vào tế bào sống để thay thế các gen hỏng tương ứng, từ đókhôi phục lại chức năng của gen

+ Các gen mã hóa cho một protein đặc hiệu Khi đưa các gen mã hóa đó vào cơthể sống sẽ tạo ra protein đặc hiệu để ức chế, kìm hãm gen khác gây bệnh, hoặckìm hãm sự tăng sinh quá nhanh của tế bào, hoặc cũng có thể gây chết tế bào gâybệnh

+ Gen ức chế các gen gây bệnh, gen kìm hãm, hoặc gen phục hồi

+ Các đoạn oligonucleotit có tác dụng kiềm hãm sự hoạt động các gen bị đột biếntrong tế bào

- Biện pháp đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh là cách giải quyết triệt

để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác độngbình thường của các trình tự biểu hiện gen đó Cho đến nay, chưa có thành tựuđáng kể nào trong lĩnh vực này vì người ta chưa biết cách sửa chữa gen một cáchđặc hiệu Tuy vậy, kỹ thuật tái tổ hợp đồng dạng cũng đem dến những hy vọng rấtlớn và khả năng thành công là điều có thể hy vọng trong tương lai

- Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộgen, người ta không làm chủ được vị trí gắn gen của đoạn mới đưa vào Điều nàydẫn đến một số kết quả không lường trước được:

+ Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được biểu hiệnmột cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và khôngđúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm chí không được biểuhiện

+ Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn

+ Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn dến sựbiểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư

Hiện nay, mọi cố gắng đều nhằm giải quyết những vấn đề này Đặc biệt, liệu phápgen trong trường hợp này được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng Việc tácđộng vào gen của tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức, con người từchối việc thay đổi gia sản di truyền có thể lưu lại cho con thế hệ sau.

1.2 Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen

Theo Tổ chức Y tế thế giới và quy định của nhiều quốc gia thì điều trị bằng liệupháp gen cần tuân thủ một số nguyên tắc sau:

- Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyềncủa bệnh

- Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến,…cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp dùng để thay thế

- Dự đoán hiệu quả của liệu pháp Nếu hiệu quả cao mới áp dụng

- Cần thử nghiệm nhiều lần rồi đối với động vật, khi thử nghiệm nhiều lần có hiệuquả cao mới áp dụng cho người

2 Phân loại liệu pháp gen

- Liệu pháp gen có hai nhóm phương pháp cơ bản:

+ Liệu pháp gen soma: là phương pháp điều trị thay thế hay sửa chữa gen hỏng,gen bệnh của các tế bào soma trong cơ thể người, giúp cho con người sống bìnhthường Các tế bào dùng để chữa trị có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt làdùng tế bào gốc

+ Liệu pháp gen tế bào mầm: là phương pháp điều trị, sửa chữa, thay thế gen hỏngcho các giao tử (tinh trùng, trứng) nhằm tạo ra thế hệ sau bình thường

3 Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen

3.1 Cơ sở của liệu pháp gen

Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:

- Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà

thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với genđặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biểu hiện trong các mô mà thông thườngchúng được biểu hiện Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởiđộng, hoạt hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngàynay) hoặc có thể kết nối với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một côngtắc Những thao tác như vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

- Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích DNA cần kỹ thuật này để có thể tiếp cận

với tế bào Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:

+ DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô Gọi là chuyểnDNA trần (nacked DNA transfer)

+ DNA có thể được sử dụng để tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral transfershuttle) Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc chắn nhất DNA xâmnhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép,nhưng vector virus dễ dàng làm việc này

+ DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để khuếch đạikhả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó

- Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng

dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như

tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh Trong tương lai, các thao tác liệupháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào và sau đó cấy lênngười bệnh sẽ là tiến triển tột cùng

Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng Khi chọn phươngpháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:

- Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu

- Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn Nó phải được hoạt hoáđúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng

Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu phápgen Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểmnghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chínhxác của gen được chuyển là không cần thiết Đúng như mong muốn, hiệu quả củaliệu pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý

3.2 Các bước cơ bản trong liệu pháp gen

Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tếbào động vật theo các bước:

Hình 1 Các bước cơ bản trong liệu pháp gen.

- Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển Trước đó, các virus đã

được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểuhiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ cáctrình tự cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotormạnh Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy Loại tế bào được sửdụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn

đa thế (pluri potential)

- Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã

tách các tế bào tuỷ xương Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự thân dùgen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể Trở ngại lớn là protein do gen lạ tạo ra cóthể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyểngen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại

cơ thể lại ít khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân Vì thế cần theo dõi sự hoạtđộng của gen đích

Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làmchậm sự phát triển của bệnh AIDS Người ta chuyển các oligonucleotit đối(antisens) bổ sung cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các

tế bào của một người lành là anh em sinh đôi của người bệnh Sau đó các tế bàonày được tiêm vào bệnh nhân Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chépcủa virus khi bắt cặp và vô hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép.Còn các Oligonucleotit đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vậnchuyển mRNA từ nhân ra tế bào chất

3.3 Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp

Khi tạo ra các vector liệu pháp gen, cần phải có kỹ thuật chuyển các gen liệupháp vào tế bào, hoặc cơ thể người Mục đích cuối cùng là các gen liệu pháp trong

cơ thể người phải được phiên mã, dịch mã tạo ra các protein liệu pháp có tác dụngchữa bệnh Các vector liệu pháp được sử dụng khác nhau, thích hợp cho từng loại

tế bào đích, nhằm tạo ra các protein liệu pháp nội bào, hoặc ngoại bào

- Hình thức chuyển gen có thể được thao tác thông qua một số cách sau:

+ Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (liệu pháp in vivo), gồm các bước sau:

Hình 2 Liệu pháp in vivo.

* Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp

* Tách và tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp, thường thì tạo vector virus đểchuyển hiệu quả Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng

và bơm thông tin di truyền vào

* Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp bằng các kỹ thuật chuyển gen như: vitiêm, súng bắn gen v.v…

* Kiểm tra biểu hiện của gen liệu pháp

+ Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh (liệu pháp ex vivo):

Hình 4 Kỹ thuật vi tiêm.

+ Kỹ thuật xung điện (electroporation): Thường dùng khi đưa gen liệu pháp vào tếbào nằm ngoài cơ thể sống Nhờ kỹ thuật xung điện có thể thay thế gen hỏng bằnggen lành, sau đó nhân nuôi tế bào lành tạo số lựơng lớn, rồi chuyển vào ngườibệnh

Hình 5 Máy electroporation - Ảnh hưởng của điện trường lên màng tế bào

+ Kỹ thuật dùng súng bắn gen (gene gun): Kỹ thuật bắn gen nhờ súng bắn gen đểchuyển gen liệu pháp vào tế bào đích thường đạt kết quả cao Thực hiện kỹ thuậtnày cần có thiết bị bắn gen, các vi đạn có bọc gen liệu pháp để đưa vào tế bàođích Gen liệu pháp dùng trong kỹ thuật này là DNA trần, hoặc phức hợp DNA-liposom và đựơc thực hiện theo hình thức ex vivo.

+ Kỹ thuật liposom (liposom technique): Liposom mang gen liệu pháp có khảnăng chui qua màng tế bào để đưa các gen liệu pháp vào bên trong tế bào Kỹthuật này cần chú ý chọn tế bào đích thích hợp để nâng cao hiệu quả

4 Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen

4.1 Vector chuyển gen có bản chất virus

4.1.1 Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó

Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:

- Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào Virus chứa vật chất di truyền

được bao quanh bởi lớp màng protein Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệtbằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào.Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tếbào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào

- Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được mang bởivirus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếphợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và DNA nhân tồn tại Các genđặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus sẽ phiên mã tổng hợp RNA vàdịch mã tạo thành protein để tạo nên chức năng mong muốn hay sản phẩm của liệupháp

- Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen củachúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen Hơn nữa, hiệu quả cuối cùng củachúng đối với các gen chức năng trong tế bào không giống nhau và có thể khác

nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ quan này đến mô cơ quankhác

Những vấn đề này ảnh hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công củachiến lược liệu pháp gen dựa trên vector virus

Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đãđược xác định Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ đểngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản cácvector virus gây bệnh

Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiêncứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpesSimplex

Bảng 1 So sánh đặc điểm của các hệ thống chuyển gen virus.

4.1.2 Vector Adenovirus

Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng làvector có cơ sở adenovirus

Hình 8 Cấu tạo Adenovirus Hình 9 Vector Adenovirus

- Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ gendsDNA dài xấp xỉ 36kb Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và basepenton Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt hai mươi mặt,trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 “chóp” ngoài vỏvirus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử

- Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cứu khá kỹ, chứa DNA xoắn kép gồm 50gen, dài 36 kilobase (Kb) Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điềuhoà quá trình dịch mã của bộ gen Các vector đã tách gen này cho phép mang gendài 8kb Để thiết kế vector andenovirus phải cắt bỏ gen E1 rồi thay thế bằng phứchợp promotor-gen liệu pháp và gây bất hoạt hoặc cắt bỏ gen E3 Vectorandenovirus tái tổ hợp sau khi xâm nhiễm vào tế bào đích, nó sẽ chuyển gen liệupháp cho tế bào đích và loại bỏ gen sai hỏng của tế bào mang gen hỏng

4.1.3 Vector Adeno-associated Virus (AAV)

- AAV là một parvovirus (virus gây bệnh Parvo ở Chó, triệu chứng: mệt mỏi, ủ rũ,nôn khan ra bọt dãi nhớt màu xanh, sốt, tiêu chảy thường có máu) không xuất hiệntrong các bệnh do vi sinh vật ở người Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào

và hoà nhập với DNA của tế bào chủ (người) ở vị trí đặc hiệu của NST số 19 tạo

ra các dạng tiền virus (provirus), tồn tại trong tế bào Khi gặp điều kiện thuận lợi,AAV tách ra, tạo ra AAV mới AAV có chứa một phân tử AND sợi đơn có kíchthước khoảng 4.5-4.7kb Hệ gen của AAV có hai nhóm gen chính là Rep và Cap,ngoài ra còn có một số gen khác điều khiển sự hoạt động của AAV

- Khi thiết kế các vector AAV phải loại bỏ gen Cap và Rep thay thế bằng gen liệupháp kết hợp với promoter thích hợp Vector AAV chỉ chuyển được các gen liệupháp có kích thước nhỏ Đặc điểm quan trọng nhất của vector AAV là hiệu quảchuyển gen cao lại không gây bệnh cho người AAV sử dụng để điều trị ung thư,bệnh xơ gan, nghẽn mạch …

Hình 10.Cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại Hình 11 Adeno-associated Virus.

và của vectorAAV

 (A) bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các khung đọc (readingframes) Rep và Cap, các promoter (p5, p19, và p40), polyadenylationsite (pA), và inverted terminal repeats (ITR) Quá trình phiên mã củavirus mã hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau được vẽ dưới

bộ gen Các protein Rep nhỏ hơn được dịch mã từ các điểm khởi đầunội tại (internal initiation sites)

 (B) bản đồ của vector AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Capcủa virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA vàpolyadenylation site)

 (C) Cấu trúc bậc hai của AAV ITR, với các vùng gắn Rep (RBS) vàvùng tiêu tan cuối cùng (TRS) (terminal resolution site)

4.1.4 Vector Retrovirus

- Retrovirus nằm trong số các vector virus được phát triển đầu tiên Vector này đãđược sử dụng trong gần 60% dự án liệu pháp gen y học Virus này có chứa vậtchất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 Kb Khi vào tế bào, RNA viruscần trở thành DNA trước khi nó có chức năng trên tế bào chủ Điều này được thựchiện bởi enzym phiên mã ngược, RT (reversse transcriptase) Retrovirus có chứaenzym phiên mã ngược (enzym xúc tác tạo thành bản sao DNA của vật liệu di

truyền RNA qua phiên mã ngược) và enzym hoà nhập (integrase) cần cho sự hoànhập của retrovirus virus vào tế bào chủ.

Hình 12 Cấu tạo Retrovirus

Hình 13: Bộ gen của retrovirus (oncogenic retrovirus) gây bệnh ung thư MLV

(murine leukemia virus) và DNA của axit nucleic của virus (hình thái của bộ genvirus trong các tế bào bị nhiễm)

Hai virus có cùng có các gen cấu trúc gag, pol, và env Gav mã hoá lõi virus và

pol mã hoá các enzim tái bản Gen env mã hoá màng glycoprotein

4.1.5 Các vector có cơ sở là Herpes simplex

- Vector herpes simplex là các vector có bản chất virus DNA Chúng không hoànhập vào DNA chủ nhưng giữ nguyên sự ổn định như một thể bổ sung (lantency),

có khả năng cho phép các gen được chuyển ổn định trong một thời gian dài Ngàynay, chúng được sử dụng trong các ứng dụng đặc biệt của liệu pháp gen với cáckhối u thần kinh

- Herpes simplex virus (HSV) có hiệu quả cao đối với các nơron thần kinh Vectornày đủ lớn để chuyển DNA lớn (tới 30 Kb) Khả năng to lớn này cho phép phânphối 5 gen khác nhau được điều khiển bằng các promoter khác nhau Do đó, nếuquá trình trị bệnh cần đa gen, đây có thể là vector được lựa chọn

Hình 14 Cấu tạo Herpes Simplex Virus

- Hiện có rất ít kinh nghiệm trị bệnh với các vector này, nhưng khả năng sử dụng của vector này cho việc phân phối gen trong một thời gian dài tới hệ thống thần kinh trung ương ngày càng tăng

4.1.6 Các vector virus khác

Các vector virus khác đang trên đà phát triển bao gồm virus pox, virus Barr, veovirus Mỗi tiến triển mới có thể là lí tưởng cho các thử nghiệm y họctrọng tâm Các chiến lược hiện nay là kết hợp DNA virus từ các vector đa dạngvới sự phân phối liposome không có bản chất virus Chiến lược này cho thấy mộtvài hứa hẹn trên các nghiên cứu với động vật

Epstein-4.2 Các vector không có bản chất virus

4.2.1 Liposomes

- Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên củamàng tế bào để xâm nhập vào tế bào Tất cả các vật chất sinh học có cực và thànhphần lipid cũng như tính hòa tan nước khác nhau Thành phần và cấu trúc của nóxác định các tính chất này

- DNA tích điện âm Tính “béo” cao và tích điện âm của màng tế bào người vàmàng nhân ngăn cản sự di chuyển tự do ra vào tế bào của DNA Liposome mangđiện tích dương, lớp vỏ ưa lipid Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dànggắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA Tính hoà tan chấtlipid này cho phép vận chuyển nó qua màng tế bào và màng nhân, dễ dàng đưaDNA vào nhân của tế bào