Sermina Liệu Pháp Gen (Human gene therapy)

Phân loại liệu pháp gen- Liệu pháp gen có hai nhóm phương pháp cơ bản: + Liệu pháp gen soma: là phương pháp điều trị thay thế hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma trong c

TRƯỜNG ĐH TÂY NGUYÊN

KHOA KHTN & CN

LIỆU PHÁP GEN

(Human Gene Therapy)

GVHD: Võ Thị Phương Khanh SVTH: Nguyễn Thành Lợi

Hồ Thị Lan Anh

1.2 Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen.

2 Phân loại liệu pháp gen.

3 Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen.

4 Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen.

III Ứng dụng.

1 Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức năng gen.

2 Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư.

3 Liệu pháp gen chữa bệnh đo sự thay đổi chức năng của Protein.

4 Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo.

5 liệu pháp gen chữa bệnh HIV /AIDS.

6 Liệu pháp gen chữa bệnh khác.

IV Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen.

I ĐẶT VẤN ĐỀ.

Nhiệm vụ hàng đầu của CNSH là giải quyết vấn đề mạng sống của con người CNSH đã và đang tập trung nỗ lực tìm ra các hướng đi để chữa khỏi các căn bệnh

di truyền cũng như các căn bệnh hiểm

nghèo Trong đó liệu pháp gen là một kĩ thuật cao của CNSH có ý nghĩa quan

trọng trong giải quyết nhiệm vụ này Do

đó, chúng tôi chọn chủ đề Liệu pháp gen

để trình bày trong bài seminar hôm nay.

II NỘI DUNG.

1 Khái niệm.

1.1 Định nghĩa liệu pháp gen.

Liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào cơ thể thay thế cho gen bệnh

hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí

gen bị sai hỏng để đạt đựơc mục tiêu của liệu pháp.

- Gen liệu pháp là các gen có chức năng sử

dụng vào điều trị bệnh cho con ngừơi Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm và chức năng riêng

Theo Tổ chức Y tế thế giới và quy định của nhiều quốc gia thì điều trị bằng liệu pháp gen cần tuân thủ một số nguyên tắc sau:

- Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyền của bệnh

- Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến,…cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp dùng để thay thế

- Dự đoán hiệu quả của liệu pháp Nếu hiệu quả cao mới áp dụng

- Cần thử nghiệm nhiều lần đối với động vật rồi mới áp dụng cho con người

1.2 Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu

pháp gen

2 Phân loại liệu pháp gen

- Liệu pháp gen có hai nhóm phương pháp cơ bản:

+ Liệu pháp gen soma: là phương pháp điều trị thay thế hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma trong cơ thể người, giúp cho con người sống bình thường Các tế bào dùng

để chữa trị có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt là dùng tế bào gốc

+ Liệu pháp gen tế bào mầm: là phương pháp điều trị, sửa chữa, thay thế gen hỏng cho các giao tử (tinh trùng, trứng) nhằm tạo ra thế hệ

sau bình thường.

3 Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen.

3.1 Cơ sở của liệu pháp gen

Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:

- Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen

thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động).

- Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích

- Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng

liệu pháp gen:

+ Ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân

+ Ứng dụng trên các tế bào đã tách ra khỏi

3.2 Các bước cơ bản trong liệu pháp gen.

Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus

để chuyển các gen vào tế bào động vật theo các bước:

- Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển

Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy (Tế bào tủy xương)

- Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ

thể mà từ đó người ta đã tách các tế bào tuỷ xương

3.3 Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp.

Khi tạo ra các vector liệu pháp gen, cần phải có kỹ thuật chuyển các gen liệu pháp

vào tế bào, hoặc cơ thể người.

Mục đích cuối cùng là các gen liệu pháp trong cơ thể người phải được phiên mã, dịch

mã tạo ra các protein liệu pháp có tác dụng chữa bệnh.

Các vector liệu pháp được sử dụng khác nhau, thích hợp cho từng loại tế bào đích,

nhằm tạo ra các protein liệu pháp nội bào,

Hình thức chuyển gen có thể được thao tác

thông qua một số cách sau:

Chuyển trực tiếp gen

vào mô người bệnh (liệu

pháp in vivo), gồm các bước

sau:

- Lựa chọn vector liệu pháp

thích hợp

- Tách và tạo vector tái tổ

hợp mang gen liệu pháp,

thường thì tạo vector virus

để chuyển hiệu quả

- Đưa vector tái tổ hợp

mang gen liệu pháp bằng

các kỹ thuật chuyển gen

như: vi tiêm, súng bắn gen

v.v…

- Kiểm tra biểu hiện của gen

liệu pháp nguyenthanhloi_2@yahoo.com 10

Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người

Về kỹ thuật chuyển gen liệu pháp để điều trị bệnh, có thể dùng các kỹ thuật chính sau:

• Kỹ thuật vi tiêm

(Microinjection):

Được sử dụng để đưa

vector liệu pháp vào

các khối ung thư Gen

Kỹ thuật xung điện (electroporation):

Kỹ thuật liposom (liposom technique):

4 Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen.

4.1 Vector chuyển gen có bản chất

virus.

4.1.1 Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó.

- Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền

đến tế bào Đầu tiên, virus gắn tới các tế

bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên

bề mặt tế bào Tiếp đó, virus vào tế bào

bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào

- Phụ thuộc vào dạng của vector virus được

sử dụng, những gen mang bởi virus được

nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các

tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế

bào.

- Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen.

Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự

truyền đi không mong muốn của vector virus

và để ngăn cản các vector virus gây bệnh

Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes Simplex.

- Bộ gen của adenovirus chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (Kb) Gen E1 điều hoà phiên mã

trong khi gen E2 và E3 điều hoà quá trình dịch mã của

bộ gen Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài 8kb Để thiết kế vector andenovirus phải cắt bỏ gen E1 rồi thay thế bằng phức hợp promotor-gen liệu pháp

và gây bất hoạt hoặc cắt bỏ gen E3 Vector andenovirus tái tổ hợp sau khi xâm nhiễm vào tế bào đích, sẽ chuyển gen liệu pháp cho tế bào đích và loại bỏ gen sai hỏng

của tế bào mang gen hỏng

4.1.3 Vector Adeno-associated Virus (AAV)

- AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh

do vi sinh vật ở người Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào và hoà nhập với DNA của tế bào chủ (người)

ở vị trí đặc hiệu của NST số 19 tạo ra các dạng tiền virus (provirus), tồn tại trong tế bào Khi gặp điều kiện thuận lợi, AAV tách ra, tạo ra AAV mới AAV có chứa một

phân tử AND sợi đơn có kích thước khoảng 4.5-4.7kb

Hệ gen của AAV có hai nhóm gen chính là Rep và Cap, ngoài ra còn có một số gen khác điều khiển sự hoạt

động của AAV

- Khi thiết kế các vector AAV phải loại bỏ gen Cap và

Rep thay thế bằng gen liệu pháp kết hợp với promoter thích hợp Vector AAV chỉ chuyển được các gen liệu

pháp có kích thước nhỏ Đặc điểm quan trọng nhất của vector AAV là hiệu quả chuyển gen cao lại không gây

bệnh cho người AAV sử dụng để điều trị ung thư, bệnh

Adeno-associated

Virus

Cấu trúc bộ gen của kiểu hoang

dại và của vectorAAV

bản sao DNA của vật liệu

di truyền RNA qua phiên

mã ngược) và enzym hoà

nhập (integrase) cần cho

sự hoà nhập của

retrovirus virus vào tế bào

chủ.

Bộ gen của retrovirus (oncogenic retrovirus) gây

bệnh ung thư MLV (murine leukemia virus) và DNA của axit nucleic của virus (hình thái của bộ gen virus trong các tế bào bị nhiễm)

Hai virus có cùng có các gen cấu trúc gag, pol, và env

Gav mã hoá lõi virus và pol mã hoá các enzim tái bản

Gen env mã hoá màng glycoprotein

4.1.5 Các vector có cơ sở là Herpes simplex

- Vector herpes simplex là các

vector có bản chất virus DNA

Chúng không hoà nhập vào

DNA chủ nhưng giữ nguyên sự

ổn định như một thể bổ sung

(lantency), có khả năng cho

phép các gen được chuyển ổn

định trong một thời gian dài

Ngày nay, chúng được sử dụng

trong các ứng dụng đặc biệt

của liệu pháp gen với các khối

u thần kinh

- Herpes simplex virus (HSV) có

hiệu quả cao đối với các nơron

4.1.6 Các vector virus khác

Các vector virus khác đang trên đà

phát triển bao gồm virus pox, virus

Epstein-Barr, veovirus Mỗi tiến triển mới

có thể là lí tưởng cho các thử nghiệm y

học trọng tâm Các chiến lược hiện nay là kết hợp DNA virus từ các vector đa dạng với sự phân phối liposome không có bản chất virus Chiến lược này cho thấy một vài hứa hẹn trên các nghiên cứu với động vật.

4.2 Các vector không có bản chất virus

4.2.1 Liposomes

- Liposome là vector không có bản chất

virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của

màng tế bào để xâm nhập vào tế bào

- DNA tích điện âm Liposome mang điện

tích dương, lớp vỏ ưa lipid Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome- DNA

- Liposome là các phân tử không độc, dễ

dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến

chúng trở thành vector rất hiệu quả trong

các ứng dụng thương mại

Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm

vector chuyển gen

Sự xâm nhập vào tế bào của các

polymer cation

4.2.3 Cấy trực tiếp

- Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực

tiếp tới khối u hoặc mô

- Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh.

- Giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu

hút hơn, cũng có một số nhược điểm như sự

quản lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn

đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi

enzym nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ

(clearance) bởi gan và thận; các DNA lạ

(foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch

4.2.4 Liệu pháp tế bào gốc

- Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra tranh cãi lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm

- Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ

tế bào nào ở người

- Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh

chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng

tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ

4.2.5 Biến đổi biểu hiện gen

4.2.5.1 Oligonucleotide

- Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử

dụng để kìm hãm quá trình dịch mã của gen Mạch đối

(antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành Khi mang tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu

và ngăn cản sự sản xuất protein từ RNA này

- Công nghệ mạch đối đã rất hữu dụng trong nghiên cứu

4.2.5.3 Promoter

Promoter là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị phiên mã Tất cả các vector liệu pháp gen hiện nay sử dụng các

promoter của virus để điều khiển sự biểu

hiện của các gen được chuyển Có thể cho phép hoạt hoá của gen được chuyển chỉ

trong các mô dự kiến

Ví dụ, một vector sử dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được

sử dụng trong các thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến Vector này sẽ là đích của một số lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào

bình thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu

III ỨNG DỤNG

Ngày nay liệu pháp gen được ứng

dụng rộng rãi trong chữa bệnh, phục hồi cấu tạo và chức năng các bộ phận cơ thể, được dùng để tạo ra những cơ quan nhân tạo thay thế cho con người

Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới

Một số bệnh di truyền đã được chữa

bằng liệu pháp gen như: rối loạn chức

năng gen, ung thư, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, bệnh xơ nang, HIV/AIDS, bệnh máu khó đông.v.v

Các thử nghiệm lâm sàng bằng liệu pháp

gen (1990 − 1999).

Bệnh Số lần

thử nghiệm

Bệnh Số lần

thử nghiệm

24 1 1

Bệnh máu khó đông A Bệnh máu khó đông B Bệnh Hunter

Thiếu kết dính bạch cầu Bệnh đa xơ cứng

Loạn dưỡng cơ Thiếu Ornithine transcarbamylase Thiếu Purine nucleoside phosphorylase

Viêm thấp khớp Suy giảm miễm dịch

2 2 1 1 1 1 1 1 2 3

1 Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn

commongamma nằm trên vai dài của NST X

+ Liệu pháp gen chữa bệnh này là phải thay thế gen

commongamma trên NST giới tính đã bị sai hỏng bằng

gen commongamma bình thường

+ Thực hiện: Lấy tế bào tủy xương người bệnh, tiến hành

xạ trị, sau đó chọn lọc các tế bào khỏe đã được chuyển

gen commongamma bình thường bằng cách sử dụng

vector retrovirus, rồi đưa trở lại vào cơ thể người bệnh Kết quả là khôi phục được các tế bào T và B

- Bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng do

sự sai lệch của các gen ADA, PNP, CD nằm trên NST thường: gây biến đổi cấu trúc của các

enzym, protein tương ứng dẫn đến bệnh suy

giảm miễn dịch ở mức độ khác nhau:

+ Liệu pháp gen là thay thế gen ADA hỏng

bằng gen bình thường Sử dụng retrovirus để

chuyển gen ADA “lành” vào tế bào lympho T cho kết quả cao Bước tiếp theo là đưa tế bào

lympho T mang gen bình thường vào cơ thể nên

đã điều trị được bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng

+ Để điều trị bệnh ADA-SCID ở người còn có thể dùng các liệu pháp gen khác như sử dụng

polyethyleneglycol (PEG-ADA), hoặc liệu pháp

2 Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư

Trong điều trị ung thư bằng liệu pháp gen, người ta sử

dụng các loại vector liệu pháp như: vector virus, vector

adenovirus, vector DNA trần nhưng lại được thiết kế dạng

+ Thay thế gen để phục hồi các protein, enzym sai hỏng, phục hồi khả năng kìm hãm hoạt động của các gen gây ung thư

+ Sử dụng các gen tạo ra các sản phẩm có khả năng tiêu diệt

tế bào ung thư

+ Sử dụng các hợp chất tự nhiên tác dụng trực tiếp vào tế

bào ung thư, bao vây thành mạch ngăn chặn mối liên hệ về dinh dưỡng của tế bào ung thư Do đó tế bào ung thư thiếu

3 Liệu pháp gen chữa bệnh do sự thay đổi

chức năng protein

Một số bệnh gây

nên do đột biến gen làm

thay đổi cấu trúc bậc

cầu hình liềm SCA

(Sickle Cell Anemia) do

đột biến gen β globin

Đột biến gen β globin

làm biến đổi

hemoglobin bình

thường (HbA) thành

- Có ba xu hướng trong liệu pháp gen để chữa bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, đó là:

+ Sửa chữa sai lệch của bộ ba mã hóa cho acid amin thứ 6 của gen β s globin

+ Sửa chữa các sai lệch của bộ ba mã hóa cho acid amin thứ

22 và acid amin thứ 87 trên gen β globin để tạo các dạng HbF và HbA 2 bình thường

+ Thay thế cả gen β s globin Cắt bỏ gen bị hỏng ( gen β s globin), thay thế bằng gen β globin bình thường cho các tế bào máu trong tủy xương

- Các bước điều trị bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm gồm có: + Tách tế bào tủy xương của người bệnh, chiếu xạ để chọn các

tế bào khỏe mạnh Chuyển gen β globin bình thường nhờ

retrovirus vào tế bào tủy xương Nhân nuôi tế bào đã mang gen β globin bình thường

+ Xạ trị kết hợp với điều trị bằng hóa chất cho người bệnh để loại bớt tế bào tủy xương bị đột biến mang gen β s globin

+ Chuyển các tế bào tủy xương mang gen β globin bình thường

là được nhân nuôi vào người bệnh

+ Theo dõi, đánh giá lượng tế bào mang gen βs globin đột biến còn lại Nếu tế bào mang gen βs globin còn nhiều thì phải tiến

hành thêm một lần lặp lại nguyenthanhloi_2@yahoo.com 42